口蹄疫滅活疫苗抗原穩定性研究進展

李緯亮，趙啟祖

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

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口蹄疫滅活疫苗抗原穩定性研究進展

李緯亮，趙啟祖*

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

口蹄疫是一種感染牛、羊和豬等偶蹄動物、具有高度傳染性的動物疫病。疫苗免疫是控制該病的關鍵措施之一，口蹄疫滅活疫苗在口蹄疫流行地區廣泛使用。滅活疫苗中，完整口蹄疫病毒粒子(146S粒子)是至關重要的免疫抗原，它的數量和穩定性決定了疫苗的免疫效果。不同血清型，甚至同型不同毒株的口蹄疫病毒粒子穩定性不同，146S粒子在一定溫度、酸、堿條件下容易分解為五聚體(12S粒子)，導致疫苗免疫效力大幅下降。近年來口蹄疫病毒結構及其穩定性的分子基礎研究取得了新進展，為研究口蹄疫病毒穩定性提高疫苗質量，開發新型口蹄疫空衣殼疫苗提供了重要理論基礎。本文簡要介紹了口蹄疫病毒結構基礎、穩定性研究方法和研究進展，為了解口蹄疫病毒結構與免疫的關系，評價新型疫苗提供參考信息。

口蹄疫病毒；146S粒子；完整性；穩定性

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一種感染牛、羊和豬等偶蹄動物的、具有高度傳染性的動物疫病。一旦暴發，會迅速在易感動物之間傳播，引發大范圍的疫情，從而造成暴發疫情地區的重大經濟損失，如2001年在英國，2010年在日本和2012年在埃及暴發的口蹄疫疫情[1-4]?？谔阋咴诜侵?、亞洲、南美洲及歐洲的許多國家中流行。在這些流行地區中，疫苗免疫是控制該病的關鍵措施[5]?，F今，在全球范圍內使用最多的口蹄疫疫苗是口蹄疫全病毒滅活疫苗。該疫苗主要是通過疫苗種毒接種易感細胞系，采用細胞懸浮培養的方法，擴增得到口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)。隨后使用二乙烯亞胺(binary ethylenimine, BEI)對病毒進行滅活并加入適當佐劑制成滅活疫苗[6]。

在滅活疫苗中，完整FMDV粒子(146S粒子)是至關重要的免疫抗原，它的數量和穩定性決定了疫苗的免疫效果[6-7]。FMDV粒子含有四種結構蛋白，分別是VP1、VP2、VP3、VP4。四種結構蛋白組成一個原粒，隨后5個原粒頂點相接聚合在一起，形成一個五聚體，十二個五聚體將病毒基因組包裹后構成了完整的FMDV粒子[8]。然而，完整的FMDV粒子存在顯著的不穩定性，當其處在pH<7.0或溫度升高的狀態下，便會分解為五聚體(沉降系數為12S，見圖1)[9]。完整的FMDV粒子一旦分解，疫苗的免疫效果將隨之大幅度降低[6]。為了保證疫苗質量，生產商需要采用昂貴的冷鏈運輸將疫苗送到用戶手中，而疫苗在使用前都需要在低溫下貯藏，同時，在疫苗抗原生產過程中病毒顆粒也會發生裂解，使生產成本增大，這正是口蹄疫滅活疫苗令人不滿意的地方。

a:原子模型圖。左側為完整的O型FMDV粒子，右側為完整病毒粒子經歷長時間存放、加熱或酸處理后，分解為12個五聚體。藍色代表VP1，綠色代表VP2，紅色代表VP3，黃色代表VP4。b:負染色法電子顯微鏡照片。左側為滅活后剛純化的FMDV O1M 親本株病毒粒子(絕大部分粒子完整，僅有少量分解為五聚體)；右側為4 ℃儲存10 d(80%完整粒子已分解為五聚體)，比例尺：50 nm。圖中圖是完整粒子或五聚體的平均模式，比例尺為5 nm。(a) Surface representation of atomic models of the intact FMDV serotype-O capsid (left) and of its dissociation into 12 pentameric assemblies upon storage, heating or lowering of pH (right). Blue, VP1; green, VP2; red, VP3; yellow, VP4. (b) Negative-stain EM images of the inactivated O1M wild-type capsids soon after purification (left, capsids intact with only a few detectable pentamers) or after 10 dof storage at 4 ℃ (right, 80% dissociated into pentamers). Scale bars, 50 nm. Class averages of the intact capsid or pentamers are shown in zoom view. Scale bars in zoom view, 5 nm.圖1 完整的FMDV分解為五聚體的示意圖及電鏡照片(圖片引用自Kotecha A等人)Fig 1 Dissociation of FMDV capsids into pentameric and electron microscope images of the inactivated FMDV(This figure is adapted from Kotecha A et al)

研究者在面對這樣的困境時，嘗試著各種方法，以求達到提高FMDV的酸熱穩定性的目標。部分研究者通過分析FMDV 146S的三維結構及結構蛋白的組成成分，以求找出146S分解的機理。部分研究者采取加壓篩選方法，篩選出穩定性提升的FMDV突變株。部分研究者采取反向遺傳學系統對FMDV基因組進行改造，對結構蛋白進行氨基酸替換，讓病毒按著研究者設想的方向進行改變。

1 影響FMDV穩定性的因素

Doel和Baccarini[10]的研究結果顯示，FMDV病毒粒子內的蛋白和RNA之間、蛋白和蛋白之間的相互作用是146S粒子穩定存在的重要因素。

研究者們后續研究逐漸發現，無論是組裝成完整的FMDV過程中，還是FMDV在酸性環境中分解產物中，由結構蛋白組裝、聚合而成的結構蛋白五聚體都是其中的重要成分。因此，FMDV在酸性環境中分解很可能是因為pH的降低破壞了五聚體之間的相互連接[11]；而在高溫環境分解很可能是因為熱量的吸收使五聚體從組合狀態態(空衣殼蛋白或病毒粒子)轉變為分解狀態。

Acharya R等[11-12]研究者們觀察FMDV的結構后發現，結構蛋白VP2和VP3中構成五聚體連接面的部分存在高密度的組氨酸殘基，認為這可能是FMDV在pH<7.0時不穩定的一個原因。由于組氨酸的pKa值與引起FMDV分解pH值相近，所以研究者們認為質子化的組氨酸殘基在五聚體連接面內產生了靜電排斥力，觸發了FMDV的分解。

Curry S等[13]研究者們更進一步縮小了產生靜電排斥力的區域。在分析了FMDV的結構后，發現在二重軸兩側相鄰的五聚體上，存在著一種由VP2 89-98位氨基酸殘基組成的偶極化的α螺旋結構(圖2)。在這個螺旋結構的N末端(即正極)附近，存在著一個相鄰五聚體上的VP3 142位組氨酸殘基(VP3 142His)。由于該結構位于二重軸內，所以每個五聚體連接面都存在一對這樣的組氨酸-α螺旋結構。當上述組氨酸殘基發生質子化后，便很有可能在五聚體連接面中產生靜電排斥作用，進而有機會導致相鄰的五聚體分裂。

為簡單起見，只顯示出兩個五聚體各自的VP2與VP3的部分結構。相鄰五聚體接觸面水平地通過圖形的中心。相鄰五聚體各自的結構蛋白以"VP2"與"VP3"及"VP2'"與"VP3'"表示。偶極化α螺旋中的陽極用"+"標示出來，與α螺旋相關的H142側鏈基團已標示出來。For simplicity, only portions of one copy of VP2 and VP3 from each of the two pentamers are shown. The pentamer interface passes horizontally through the center of the figure. Labels associated with the twofold-related pentamer are indicated by'. The positive end of the helix dipoles are indicated by +. Side chains H142, associated with the helix, has shown.圖2 FMDV A22株相鄰五聚體的組氨酸-偶極化α螺旋結構示意圖(圖片引用自Curry S)Fig 2 Schematic representation of the histidine-helix dipole interaction between twofold-related pentamers in A22 FMDV(This figure is adapted from Curry S)

van Vlijmen H W等[12]研究者通過進行精確的酸堿滴定，證實VP3 142His在低pH時會在五聚體連接面間產生很強的不穩定作用。Ellard F M等[11]研究者通過對該氨基酸的替換試驗證實了上述結論。該試驗也證明了選擇不同的氨基酸替換該位置的組氨酸，將會產生不同的結果，既能提升也能降低病毒衣殼的穩定性。

然而，當影響FMDV的酸穩定性的結構基礎已經追溯到位于五聚體連接面附近的組氨酸殘基時，影響FMDV熱穩定性的結構基礎仍然不清晰。

Rincón V等[14]研究者觀察發現，FMDV五聚體的組合主要依靠微弱的靜電作用。在五聚體連接面附近存在一組酸性氨基酸殘基，它們在多數pH下帶負電荷，因此在五聚體之間形成了靜電排斥網。在上述微弱的靜電吸引與排斥的共同作用下，FMDV完整粒子從組合態只需少許能量即能轉變為過渡態進而分解為五聚體。當研究者們用無極性氨基酸殘基部分替換該組酸性氨基酸(D2068N，E2086Q，D3134N，D3195N)，發現組合態轉變至過渡態所需能量提高且分解率降低。因此，研究者們認為FMDV受熱容易分解是由結構蛋白當中的個別氨基酸殘基在五聚體之間形成靜電排斥作用所導致的 。

FMDV的衣殼穩定性在不同血清型之間存在顯著差異：O型和SAT型對酸熱穩定性差，而A和Asia1型相對來說更穩定[9]。而引起這一差異的機理仍然存在未知有待探究。

2 提高FMDV穩定性的研究

2.1 人工加壓篩選穩定性提升毒株 以篩選出FMDV抗酸能力提高的突變株為例，研究者根據目標，用酸性緩沖液處理FMDV，隨后將處理過的FMDV接種于易感細胞(如BHK-21)中擴增，從而篩選出抗酸能力提高的FMDV突變株。該方法的優點是能在影響FMDV穩定性機理并不清楚的情況下，依據研究者的目的定向篩選出達到目的FMDV。缺點是試驗過程較復雜，產生突變的位點難以預測且試驗耗費的時間難以估計。因此該方法更合適用于探究影響FMDV穩定性的可能因素上。

2.2 反向遺傳操作 研究者通過對FMDV全長cDNA的操作，直接改變FMDV的基因組，導致氨基酸替換，進而影響FMDV的性狀，達到影響FMDV穩定性的目的。優點是能在分子水平上對FMDV進行精準突變，減少或避免非預期突變；試驗時間較短且能進行大量突變嘗試。缺點是需要成功構建出該株FMDV感染性克??；基因組改變所帶來的性狀改變有時難以預測。該方法更適合用于探究影響FMDV穩定性分子機理及大量定點突變改造的試驗中。

2.3 影響FMD抗原酸穩定性的研究 王海偉等[15]研究者為了驗證FMDV的部分氨基酸殘基在146S粒子酸穩定性中所起的作用并獲得酸穩定性有所提升的突變病毒，于是通過反向遺傳學系統，對Asia 1型FMDV YS/CHA/05毒株的VP1、VP2和VP3進行了單氨基酸替換(VP1 N17D、VP2 H145Y、VP2 G192D和VP3 K153E)及雙氨基酸(H145Y/N17D, G192D/N17D和K153E/N17D)替換。隨后研究者們拯救出上述重組病毒，并對其做了酸穩定性測試。結果顯示，含有VP2 H145Y或/及VP1 N17D的氨基酸替換的Asia 1型FMDV重組毒株，能夠在一定程度上抵抗酸誘導的滅活作用結果見圖3。研究者們因此得出了VP2 H145Y或/及VP1 N17D的氨基酸替換能使Asia1型FMDV酸穩定性提高的結論。

病毒樣品使用不同pH值溶液(5.0, 6.0或7.4)在室溫下處理30min，隨后使用TCID50試驗測定剩余感染滴度。親本病毒 Asia1/YS/CHA/05株作為對照組。Viral samples were treated at different pH values (5.0, 6.0, or 7.4) for 30 min at room temperature, and the remaining infectious titers were determined by TCID50 assay. The parental virus Asia1/YS/CHA/05 was used as a control.圖3 氨基酸替換VP2 H145Y和VP1 N17D提升FMDV突變病毒酸抗性的效果(圖片引用自王海偉等人)Fig 3 Effect of the VP1 N17D and VP2 H145Y substitutions on increased acid resistance in FMDV mutants (This figure is adapted from Wang H W et al)

袁紅等[17]研究者對O/HN/93毒株全長感染性cDNA克隆進行點突變，成功拯救出三株突變病毒rN17D、rD86H和rN17D2。隨后利用獲得的突變病毒進行酸誘導的失活實驗、熱誘導的失活試驗。結果顯示，三株突變病毒都具有耐酸性，突變病毒rD86H、rN17D和rN17D2的pH50值分別為6.25、6.18、6.30，而親本病毒pH50值為6.50。在熱誘導的失活試驗中，研究者發現突變病毒中rD86H和rN17D的抗熱失活能力有所提升，結果見圖4。

圖4 四株病毒在42℃的熱失活曲線(圖片引用自袁紅)Fig 4 Thermal inactivation kinctics of the four viruses at 42 ℃ (This figure is adapted from Yuan H)

Biswal J K等[16]研究者為了提高A型FMD疫苗的酸穩定性，利用了反向遺傳學方法對正在使用的疫苗株IND 40/2000進行改良，把VP3上142號位點的組氨酸替換為丙氨酸(H142A)、精氨酸(H142R)、苯丙氨酸(H142F)和天冬氨酸(H142D)。然而，僅有重組質粒pA40/2000-H3142D能拯救出有感染性的重組病毒，其余重組質粒均未能拯救出重組病毒。隨后，研究者將得到的重組病毒與親本毒株一同進行多項試驗。

結果顯示，在抗原檢測ELISA試驗中，在重組質粒pA40/2000-H3142D拯救出來的重組病毒A-H3142D傳代得到的細胞上清中能檢測到A型FMDV特定的吸光值，結果見圖5。在酸誘導的滅活試驗中，重組病毒相比親本病毒，產生了很明顯的耐酸性，結果見圖6。證明了VP3中的氨基酸替換(H142D)能提高A型FMD疫苗株的酸穩定性[16]。

圖5 抗原檢測ELISA試驗中492 nm吸光度結果圖(圖片引用自Biswal J K等人)Fig 5 Absorbance recorded at 492 nm in antigen detection ELISA (This figure is adapted from Biswal J K et al)

使用酸性溶液(pH 6.0)或中性溶液(pH 7.4 作為對照)處理等量的親本病毒IND 40/2000和重組病毒H3142D，將溶液中和以后使用TCID50試驗測定病毒的剩余感染滴度。Equals amounts of the parental A IND 40/2000 and H3142D mutant virus were treated acidic buffer (pH 6.0) or neutral buffer (pH 7.4 as a control). The samples were then neutralized, and the remaining infectivity of viruses was determined by TCID50 assay.圖6 A型FMDV H3142D突變株對酸誘導滅活試驗的耐受性(圖片引用自Biswal J K等人)Fig 6 Resistance of the H3142D mutant FMDV serotype A to acidinduced inactivation(This figure is adapted from Biswal J K et al)

2.4 影響FMD抗原熱穩定性的研究 Roberto M等[5]人在不影響到FMDV的關鍵功能以及感染性的前提下，通過在12S粒子間相互作用面內構建出二硫鍵或者改變靜電吸引力這兩種構象作用，來對C型FMD疫苗株Santa Pau-Spain/70進行了改良，從而達到提升FMDV 146S粒子結構的熱穩定性的目的。研究者們通過定點突變將目標點上原有的各類氨基酸替換成了半胱氨酸，以求在12S粒子間相互作用面內構建出二硫鍵。他們為此總共設計了8組、每組兩個的氨基酸替換。在改變靜電吸引力上，他們設計了7組氨基酸替換(3組雙氨基酸替換4組單氨基酸替換)。結果顯示，僅有2組(T2053D/Q2057K和Y2200H/I3189D)構建二硫鍵的及4組(D3069E/T2188A、T2188A、A2065K和A2065H)改變靜電吸引力的氨基酸替換能拯救出與親本毒株擁有相似感染性的重組病毒。隨后研究者們對上述拯救成功的重組病毒進行了146S粒子的熱分解試驗，結果僅有2組(D3069E/T2188A及A2065H)重組病毒的分解速度要比親本毒株要慢，結果見圖7，達到了研究者的目的。然后，研究者們利用C型FMDV的單克隆抗體，與親本病毒和突變病毒進行了酶聯免疫斑點試驗。結果顯示，突變病毒的抗原位點與親本病毒沒有明顯變差異，結果見圖8。

圖中三角形代表FMDV突變株，圓形代表親本毒株。Triangles and circles were represented for mutant or nonmutated FMDV respectively.圖7 純化的FMDV突變株D3069E/T2188A(a和b)或A2065H(c和d)在42 ℃(a和c)或4 ℃(b和d)下的熱分解變化圖(圖片引用自Roberto M等人)Fig 7 Thermal-dissociation kinetics of purified FMDV mutant D3069E/T2188A (a and b) or A2065H (c and d)at 42 ℃ (a and c) or 4 ℃ (b and d) (This figure is adapted from Roberto M et al)

Porta C等人[4]在前人對FMDV結構研究的結果中受到啟發，因此他們對A型FMDV的重組疫苗株A22進行了氨基酸替換，將VP2 93號位點的組氨酸替換為半胱氨酸(H2093C)，從而在12S粒子間相互作用面內構建出二硫鍵，達到提高FMDV空衣殼蛋白酸熱穩定性的目的。隨后，研究者們利用自行設計的優化過的空衣殼蛋白表達系統，將親本和突變型空衣殼蛋白都表達出來。然后，研究者們對得到的兩種空衣殼蛋白同時進行了熱分解試驗以及酸化分解試驗，使用蔗糖梯度密度法沉淀處理后與未處理的空衣殼蛋白，使用Western blot檢測蔗糖密度梯度。結果顯示，突變的空衣殼蛋白的酸熱穩定性均比親本的要高(圖9)，研究者成功達到其預期的提高空衣殼蛋白酸熱穩定性的目標。然后，研究者們將高純度的空衣殼蛋白注射到易感牛中，測定其抗體滴度。隨后在免疫后第34周，研究者進行攻毒試驗，觀察實驗動物的臨床癥狀并檢測其血清中的病毒核酸含量。結果顯示，動物注射重組型或親本型空衣殼蛋白所產生的抗體滴度差異不顯著(P>0.05)。攻毒試驗結果顯示，免疫親本型或突變型空衣殼蛋白均能為易感動物提供足夠保護結果見圖10。

每一列中，每個病毒樣品作一個重復。每一列的第七孔作為陰性對照(不加入病毒)。第一列作為陰性對照(不加入單抗)。剩余列數中，號碼1、2和3代表指單抗的10倍連續稀釋。In each strip, each of the three viruses was applied in duplicate.As a negative control, no virus was added to the bottom (seventh) well in each strip. The first strip is a negative control (no MAb was added). For the remaining strips, the numbers 1,2,and 3 correspond to 10-fold serial dilutions of the indicated MAb.圖8 C型FMDV親本毒株(C-S8c1；wt)和突變株A2065H和D3069E/T2188A與識別C型口蹄疫抗原位點(A,C,D1,D2和D3)的單克隆抗體進行的酶聯免疫斑點試驗(圖片引用自Roberto M等人)Fig 8 Reactivity in immunodot assays of nonmutated (C-S8c1; wt)FMDV and mutants A2065H and D3069E/T2188A with neutralizing monoclonal antibodies (MAbs) directed against each of the identified antigenic sites (A, C, D1, D2, and D3) in serotype C FMDV (This figure is adapted from Roberto M et al)

圖9 A22親本及H2093C毒株空衣殼蛋白Western blot試驗(圖片引用自Porta C等人)Fig 9 Western blot analyses of A22-wt and A22-H2093C empty capsids. (This figure is adapted from Porta C et al)

上圖分別代表的是免疫了A22-wt(A)、A22-H2093C(B)空衣殼和對照組(C)動物。實驗組中有三頭牛(FMD140、143和144)出現臨床癥狀，而對照組中兩頭牛均出現明顯的臨床癥狀。Individual data for animals vaccinated with (a)A22-wt,(b)A22-H2093C and for non-vaccinated control animals (c). Clinical signs were detected in three of the eight animals of experimental group (FMD140, FMD143 and FMD144). Both non-vaccinated control animals showed overt clinical signs.圖10 動物血清中病毒基因含量檢測(圖片引用自Porta C等人)Fig 10 The quantity of viral genome (Log10/ml) was determined in serum samples from each animal (This figure is adapted from Porta C et al)

3 展 望

FMDV 146S粒子的完整性與數量是影響FMD滅活疫苗免疫效果的決定性因素[6-7]，維持滅活疫苗中病毒粒子的完整性和穩定性，以及高效組裝完整、穩定的病毒樣顆粒開發新型疫苗，是口蹄疫疫苗研究者長期努力和研究的方向。迄今為止，已獲得不少成果。但影響FMDV穩定性的分子機理仍未十分清楚。在研究過程中，研究者們成功獲得種類繁多的且穩定性提升的FMDV突變株，但不同血清型突變株所替換的氨基酸殘基不盡相同[11-12]，暫時還沒發現一種在FMDV各血清型中通用的穩定性提升方法。FMDV的突變株與親本病毒相比較，雖然成功提高了穩定性，但兩者的抗原性及免疫保護水平卻少有比較，而抗原性及免疫保護水平是突變株是否能成為改良疫苗候選毒株的關鍵因素。

疫苗中含有的146S粒子的數量與完整性是疫苗產生有效保護的關鍵。若將研究者們得到的穩定性提升的FMDV突變株運用到疫苗生產當中，將會有效減少FMDV 146S粒子在生產過程中的分解，從而提高疫苗中的抗原含量，提高疫苗的保護效果。同時，由于146S粒子的穩定性提升，將降低疫苗在運輸與儲存過程中對冷鏈的依賴程度，同時疫苗的保質期得到了延長。FMDV突變株仍可利用現在的FMD滅活疫苗生產方法制作成滅活疫苗，避免了重新設計生產方法的麻煩。

若影響FMDV穩定性的關鍵因子在各血清型中高度保守，研究者們便可以此為基礎，設計出一種在FMDV各血清型之間通用的穩定性提升方法，提升各血清型FMDV的穩定性，進而為改良疫苗提供候選毒株。另外，FMDV衣殼分解的關鍵因子的發現有助于我們更進一步地理解FMDV脫衣殼過程的分子機理，讓我們對FMDV侵染機體的認知提升到一個新的水平。

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(編輯：陳希)

The Advance in the Antigen Stability of Foot-and-Mouth Disease Inactivated Vaccine

LI Wei-liang, ZHAO Qi-zu*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

ZHAOQi-zu,E-mail:zhaoqizu@163.com

Foot-and-Mouth Disease (FMD) is a highly infectious disease of cloven-hoofed livestock such as cattle, sheep and pigs. Vaccination, mostly use inactivated vaccines, is one of the critical preventive methods for controlling FMD in epidemic zones. The intact virus particle (146S particle) is essential for FMD vaccine immunogenicity. The quantity and stability of virus particle is key factors to vaccine immunogenicity. There are significant differences in stability for 7 serotypes of FMD virus even different strains of the same serotype. The potency of vaccine will greatly reduce when it is treated with heat, acid or alkali because 146S particle is easy to dissociate into pentamers (12S particle). A lot of achievements have been obtained on FMD virus about virus structure and stability. These achievements provide important theoretical evidences for improvement of inactivated vaccine and the development of virus empty capsid vaccine. This article review some research methods and progress in the structure and stability of FMDV and provide some reference information for colleagues to understanding the relationship between immune and the structure of FMDV as well as evaluating the new type vaccines.

Foot-and-Mouth Disease Virus; 146S particle; integrity; stability

農業部公益性行業(農業)科研專項"動物疫苗制劑及下游工藝技術研究與示范"(P2015003086) 作者簡介： 李緯亮，碩士研究生，從事預防獸醫學研究。

趙啟祖。E-mail: zhaoqizu@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.13

2017-02-09

A

1002-1280 (2017) 07-0070-08

S852.65