脂多糖對人鼻黏膜上皮細胞人β防御素2誘導表達的影響△

胡秀娟 劉海兵 賀廣湘

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·基礎研究·

脂多糖對人鼻黏膜上皮細胞人β防御素2誘導表達的影響△

胡秀娟 劉海兵 賀廣湘＊

目的 觀察脂多糖(LPS)誘導人鼻黏膜上皮細胞人β防御素2(hBD-2)表達的影響。方法 用LPS刺激人鼻黏膜上皮細胞，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測hBD-2 mRNA的表達，免疫細胞化學檢測hBD-2蛋白的表達。結果 LPS刺激2 h后人鼻黏膜上皮細胞可見hBD-2 mRNA的表達，并呈劑量和時間依賴性；刺激4 h后人鼻黏膜上皮細胞胞質中可見hBD-2蛋白的表達。結論 一定劑量的LPS可誘導人鼻黏膜上皮細胞hBD-2的表達，這種表達具有一定的劑量和時間依賴性。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：245-248)

人鼻黏膜上皮細胞；人β防御素2；脂多糖

鼻-鼻竇炎是常見的難治性疾病，發病率高達16%，極大影響了人們的健康和生活質量[1]。目前其治療效果欠佳，復發率高。而人β防御素2(human β defensin 2, hBD-2)廣泛表達于包括鼻黏膜在內的各種黏膜細胞和上皮組織，不僅具有廣譜抗微生物活性，迄今未發現對其有明顯抗性的噬菌體，而且在先天性免疫和獲得性免疫中發揮重要作用[2]。因此作為內源性“超級抗生素”的hBD-2有可能成為一種新型的鼻-鼻竇炎治療藥物，既能解決細菌耐藥問題，又能發揮免疫防御功能，在治療鼻-鼻竇炎中具有廣泛的應用前景，可能給鼻-鼻竇炎的治療帶來新的革命，值得進一步深入研究。本研究在前期研究的基礎上，進一步深入研究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)對鼻黏膜上皮細胞hBD-2的誘導表達作用，以期從分子生物學水平明確鼻黏膜上皮細胞中hBD-2誘導表達的規律和機制，為深入研究鼻-鼻竇炎的有效防治提供理論依據和線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 DMEM:Ham F12以1∶1配比，0.25%膠原酶、Hank液(Hyclone公司)，Keratinocyte-SFM(GIBCO公司)，胎牛血清(四季清公司)，I型膠原酶和LPS購自Sigma公司，BD-2(C-17)(SC-10854，美國SANTA公司)，Total RNA 試劑盒Ⅱ(R6934-01，OMEGA公司),Rever Tra Ace qPCR RT試劑盒(TOYOBO公司)，2×Taq Master Mix、DNA Marker(TIANGEN公司)，hBD-2上下游引物(255 bp)、GAPDH上下游引物(452 bp)均由上海生工公司合成。

1.2 原代鼻黏膜上皮細胞的分離和培養 標本來自湘雅三醫院耳鼻咽喉頭頸外科同期做鼻中隔矯正術、鼻腔血管電凝術患者。經患者同意，在行鼻內鏡手術時取其下鼻甲黏膜。所有患者無全身及鼻腔局部炎癥、無變態反應性疾病，取材前近2個月無全身及局部應用糖皮質激素及其他抑制細胞生長藥物史，無鼻手術、外傷史。在無菌條件下，生理鹽水浸洗，去除粘附的鼻甲、壞死組織及黏液、血液，放入4 ℃的保存液中轉運到細胞培養室。4 h內于無菌超凈臺上，用含10 mg/L氟康唑和100 mg/L慶大霉素的生理鹽水反復沖洗下鼻甲黏膜3～5遍后，將下鼻甲黏膜剪成1 mm ×1 mm×1 mm大小的組織塊。參照王振霖等[3]的方法并略作改動，以組織塊30～50倍體積的0.1% 膠原酶37 ℃消化30 min，加入等量0.25%的胰蛋白酶消化5 min，加入適量含15%血清的DMEM/F12培養基終止消化。靜置后組織塊沉于無菌玻璃皿底時，吸去上清液，以1 mL無菌注射器挑起組織塊，均勻種植于25 cm×25 cm瓶底，翻轉培養瓶，在對側加入5 mL含15%血清的DMEM/F12培養基，37 ℃、5%CO2、95% O2培養箱中培養24 h后翻轉培養瓶。48 h 后更換Keratinocyte-SFM(K-SFM)培養基繼續培養，每4 d換液。傳代后種板，72 h后進行細胞角蛋白鑒定。

1.3 LPS刺激鼻黏膜上皮細胞 待第10天左右細胞呈對數生長時進行消化傳代，以1∶3的比例種板。待細胞基本融合，生長狀態良好時分別予以LPS 0、1、10 μg/mL的濃度進行刺激，并取LPS 10 μg/mL的濃度分別刺激鼻黏膜上皮細胞0、2、4、6、24 h，收集不同濃度刺激后的細胞總RNA及不同時相點的細胞總RNA，以LPS 10 μg/mL的濃度刺激鼻黏膜上皮細胞4 h后檢測胞質蛋白。

1.4 反轉錄聚合酶鏈反應 采用Trizol法抽提總RNA，行完整性檢測。根據反轉錄試劑盒說明配置反應體系：5×RT緩沖液4 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、Primer Mix 1 μL、RNA 3 μg(通過所測濃度依次計算需加入反應體系的各樣本RNA體積)，最后加入Nuclease-free Water使總體積達20 μL。在37 ℃反轉錄成cDNA,參照試劑盒說明書加樣至20 μL體系，反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共33個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。陽性對照GAPDH，產物長度為452 bp,上游：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′；hBD-2引物上游： 5′-CCA GCC ATC AGC CAT GAC GGT-3′，下游：5′-GGA GCC CTT TCT GAA TCC GCA-3′，產物長度為255 bp。

1.5 免疫細胞化學檢測 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗細胞后用4%多聚甲醛固定，3%H2O2室溫孵育去除內源性過氧化物酶，0.2%的Triton X-100室溫處理30 min增加細胞膜通透性，封閉液封閉，一抗(山羊抗hBD-2)孵育過夜，二抗孵育2 h。二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染，樹膠封片。本組實驗中LPS 0 μg/mL為對照組。

1.6 結果判定標準 各測量組的電泳圖片用凝膠成像系統照相后進行吸光度值測定，將目的基因的吸光度值與GAPDH的吸光度值進行比較，得出相對值。相對值越高，說明目的基因轉錄水平越高。hBD-2在黏膜上皮細胞胞質中呈現棕黃色或棕黃色顆粒為陽性，與蘇木素復染后細胞核藍染不重疊，定位區分明確。

2 結果

2.1 LPS刺激鼻黏膜上皮細胞對hBD-2 mRNA表達的作用 不同濃度的LPS(0、1、10 μg/mL)刺激鼻黏膜上皮細胞4 h后，hBD-2 mRNA表達呈劑量依賴性升高，經電泳后在凝膠上呈現的亮度隨著刺激濃度的增加而增加(圖1)。將hBD-2mRNA與GAPDH的吸光度比值[LPS為0、1、10 μg/mL時分別為(0.35±0.035)(0.51±0.009)(0.62±0.002)]進行比較，可見兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1. LPS刺激鼻黏膜上皮細胞對hBD-2mRNA表達的作用

2.2 一定濃度LPS不同時間點刺激上皮細胞對hBD-2 mRNA表達的作用 用一定濃度的LPS(10 μg/mL)刺激鼻黏膜上皮細胞，在0、2、4、6、24 h時檢測hBD-2mRNA的表達。從電泳后的凝膠上呈現的亮度變化可見看出，2 h時可見鼻黏膜上皮細胞中hBD-2 mRNA表達，4 h表達最明顯，6 h有所下降，24 h后降低明顯(圖2)。將hBD-2 mRNA與GAPDH的吸光度比值[0、2、4、6、24 h后分別為(0.44±0.029)(0.56±0.029)(0.60±0.028)(0.52±0.029)(0.50±0.027)]進行比較，可見兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2. hBD-2mRNA表達與LPS刺激的時效關系

2.3 免疫細胞化學檢測hBD-2的表達 正常情況下，未受刺激的對照組鼻黏膜上皮細胞胞質呈半透明狀，基本未檢測到hBD-2蛋白的表達；用一定濃度的LPS(10 μg/mL)刺激4 h，免疫細胞化學法證實鼻黏膜上皮細胞有hBD-2蛋白表達，主要分布在胞質中，呈棕色顆粒(圖3)。

圖3. 鼻黏膜上皮細胞免疫細胞化學染色(SP法×100倍) A.未受刺激的對照組鼻黏膜上皮細胞胞質呈半透明狀;B.受刺激的鼻黏膜上皮細胞胞質黃染

3 討論

hBD-2是人體內發現的富含半胱氨酸的內源性抗微生物活性肽，具有抵御病原微生物入侵的生物活性，參與了許多疾病的病理生理過程。與hBD-1的固有表達不同，hBD-2在某些組織如氣道上皮中呈微量的固有表達，但主要表現為受到炎癥刺激后的誘導表達?？烧T導hBD-2表達的因素包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、魯斯假絲酵母(念珠菌)、白假絲酵母、人類免疫缺陷病毒(HIV-1)等微生物；一些細胞因子如白細胞介素α(interleukin α,IL-α)、IL-β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-γ、L-異亮氨酸和LPS等物質也可誘導hBD-2的表達。不同的微生物成分可誘導不同防御素分子的表達，以對抗不同微生物感染，而不同刺激因素對hBD-2的誘導存在著明顯的不同[4-7]。近年來對hBD-2的誘導研究以及誘導表達機制的研究也越來越多。

鼻部炎癥性疾病多與革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌以及真菌感染等有關。LPS是含糖和脂的化合物,糖多于脂,是革蘭陰性細菌外膜的主要成分，可作用于體內的巨噬細胞等，使之產生IL-1、IL-6和TNF-α等細胞因子[8]。因此，用LPS刺激鼻黏膜上皮細胞從而誘導hBD-2的表達具有一定的代表性。

目前關于鼻部hBD-2表達的研究也不少，但系統應用革蘭陰性菌毒性物質誘導hBD-2的表達尚罕見報道。因此本實驗系統應用革蘭陰性菌毒性物質LPS刺激培養的鼻黏膜上皮細胞，觀察hBD-2的表達，發現LPS能誘導鼻黏膜上皮細胞中hBD-2的表達，且在一定劑量范圍內呈現劑量依賴性，這與文獻[9]報道LPS誘導人氣道上皮細胞hBD-2的表達規律一致。另外，一定濃度LPS(10 μg/mL)刺激鼻黏膜上皮細胞時，發現刺激2 h時hBD-2的表達增加，4 h時表達增加明顯，6 h時較4 h有所減少，24 h時開始降低，說明當病原微生物侵襲上呼吸道時，hBD-2的表達、分泌可能是上呼吸道最初的防御反應，參與早期的抗菌過程。

hBD-2誘導表達的機制和信號傳導通路目前并不完全清楚。有研究[10-12]發現，首先各種刺激因素被靶細胞上的病原識別受體識別，如Toll樣受體、CD14等，然后通過某種信號通路傳導這種刺激并誘導hBD-2表達和上調。Scharf等[12]研究發現，嗜肺軍團桿菌刺激人肺上皮細胞誘導hBD-2表達是通過TLR2和TLR5介導的，同時p38MAPK、JNK、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和AP-1信號通路都參與了調控。趙俊麗等[13]發現LPS可能通過TLR4/NF-κB信號傳導通路誘導腎小管上皮細胞表達hBD-2。有學者[14]在體外白假絲酵母刺激食管細胞株誘導hBD-2和hBD-3表達實驗中發現，兩者調控的信號傳導通路是不同的，其中hBD-2表達調控的信號傳導通路是NF-κB和AP-1信號傳導通路協同作用，而hBD-3是獨立依賴EGFR/MAPK/AP-1信號傳導通路調控。Yoon等[15]發現脆弱類桿菌腸毒素刺激小腸上皮細胞誘導hBD-2的表達時需要通過絲裂原激活蛋白激酶/IκB激酶/NF-κB信號傳導通路。以上研究表明，不同防御素表達調控的信號傳導通路是不同的[14]，并且hBD-2的誘導表達也可能是通過多種信號通路實現的。外來刺激信號通過激活NF-κB可能是上皮細胞hBD-2基因激活的機制之一。然而亦可能還有其他激活通路，如p38MAPK、JNK、NF-κB和AP-1途徑。李同麗等[16]的實驗證實LPS刺激鼻黏膜上皮細胞致炎在 30 min 內和濃度在1 mg/L內是以時間和濃度“正依賴”方式導致p38MAPK的活性增強。

本實驗不足之處在于沒有用更多的刺激濃度刺激鼻黏膜上皮細胞，但目前誘導表達規律的揭示，為下一步通過信號通路基因芯片對鼻黏膜上皮細胞誘導hBD-2表達的調控信號通路進行檢測奠定了基礎。

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(本文編輯 楊美琴)

Roles of lipopolysaccharide in the expression of human β defensin 2 in human nasal mucosa epithelial cells

HU Xiu-juan, LIU Hai-bing, HE Guang-xiang＊.

Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the Affiliated Hospital of Chengdu University, Chengdu 610081, China

HE Guang-xiang, Email: hgx2000@163.com

Objective To explore the role of lipopolysaccharide (LPS) in the expression of human β defensin 2(hBD-2) in human nasal mucosa epithelial cells. Methods After the human nasal mucosa epithelial cells were stimulated with LPS, the expression of hBD-2 mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and the expression of hBD-2 protein was detected by immunocytochemistry. Results The hBD-2 mRNA could be detected 2 hours after LPS stimulation and expressed in a dose- and time-dependent manner. The hBD-2 protein could be detected in cytoplasm 4 hours after LPS stimulation. Conclusions A certain dose of LPS could induce the expression of hBD-2 in human nasal mucosa epithelial cells in a dose- and time-dependent manner. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:245-248)

Human nasal mucosa epithelial cells; Human β defensin 2; Lipopolysaccharide

湖南省自然科學基金項目(14JJ2038)；湖南省長沙市科技項目(K1203050-31)

成都大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 成都 610081;＊中南大學湘雅三醫院耳鼻咽喉頭頸外科 長沙 410013

賀廣湘(Email: hgx2000@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.04.005

2016-11-17)