單環刺螠的人工苗種生產研究Ⅰ.環境因子對單環刺螠受精與孵化的影響

王力勇，胡麗萍*，姜黎明，孫靈毅，王鶴

(1.煙臺市水產研究所，山東 煙臺 264003；2.山東東方海洋科技股份有限公司,山東 煙臺 264000)

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單環刺螠的人工苗種生產研究Ⅰ.環境因子對單環刺螠受精與孵化的影響

王力勇1，胡麗萍1*，姜黎明2，孫靈毅1，王鶴1

(1.煙臺市水產研究所，山東 煙臺 264003；2.山東東方海洋科技股份有限公司,山東 煙臺 264000)

為對單環刺螠(Urechisunicinctus)的人工苗種生產提供科學有效的基礎資料，進行了受精方式和環境因子對單環刺螠受精與孵化的影響研究。結果表明，自然受精的受精率(95.67±2.32)%顯著高于人工授精(8.79±6.02)%～(57.83±8.23)%(P<0.05)；人工授精中，精卵比例為5∶1～10∶1時的受精率顯著高于其他人工授精組實驗組(P<0.05)，可達50%左右。環境因子中，水溫在15.0～21.0 ℃時，孵化率均達86%以上，顯著高于其他水溫組(P<0.05)；鹽度為24.1～30.0的實驗組中有幼蟲孵化，且鹽度為27.2時孵化率最高，為(86.70±2.24)%，與其他鹽度組差異均顯著(P<0.05)；pH為6.96～9.01的實驗組中有幼蟲孵化，且pH為8.02時孵化率最高，為(84.26±4.20)%，與其他pH組差異均顯著(P<0.05)；受精卵密度為1 ind./mL時的孵化率為(89.43±2.34)%，較其他實驗組稍高，但差異不顯著(P>0.05)；充氣+攪動實驗組的孵化率為(90.50±2.23)%，顯著高于其他組(P<0.05)，通過攪動水體可將孵化率提高30%以上，而充氣可將孵化率提高10%以上。綜上所述，受精方式的不同以及環境因子(水溫、鹽度、pH、充氣方式等)的變化會直接影響單環刺螠的受精率和孵化率。本研究通過對比實驗，獲得了單環刺螠人工授精的最佳精卵比例以及在較大實驗水體中受精卵孵化的最適環境因子條件，這將為單環刺螠的全人工苗種繁育工作提供參考依據。[中國漁業質量與標準，2017,7(4):37-44]

單環刺螠；人工苗種生產；受精；孵化；環境因子

單環刺螠(Urechisunicinctus)，屬螠蟲動物門(Echiurioidea)、螠綱(Echiurida)、無管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠屬(Urechis)，俗稱“海腸子”，系真體腔原口動物，自然分布于俄羅斯、朝鮮、日本以及中國的黃、渤海沿岸。單環刺螠對海水中的硫化物具有較強的耐受與解毒能力，對水質調節及海洋污染的緩解具有積極作用[1]。因其富含蛋白質、氨基酸和其他營養物質，味道鮮美，具有很高的經濟食用價值，是一類極具增養殖前景的海洋動物資源。

根據單環刺螠所具有的生長快、抗病力強等優勢和特點，盡快開展苗種繁育、養殖技術的研究，不僅可以緩解和改善因過度捕撈而日趨衰竭的自然資源量，提高經濟效益，也可以大大提高增殖放流個體的成活率，有效地補充自然資源，在保護生態平衡和種質資源方面具重大的應用意義。

目前有關單環刺螠的研究，主要涉及其對環境的適應性[2-3]、繁育及配子發生[4-7]、器官發生[8-9]、營養組分及活性肽分析[10-13]、代謝調節[1,14]以及分子生物學[15-16]等領域。牛從從等[5]曾報道海水鹽度和pH對單環刺螠胚胎發育中受精率和孵化率的影響，康慶浩等[17]對水溫在胚胎發育及幼體培育中的影響做了研究。然而，作為人工繁育的初始關鍵環節，有關單環刺螠受精與孵化方面還缺乏較為系統全面的研究數據。因此，本研究對人工繁育前期過程中，人工授精的精卵比例、孵化水溫、鹽度、pH、充氣方式等環境因子對單環刺螠的受精與孵化等的影響進行了測定分析，以期為實現單環刺螠全人工苗種繁育及育苗生產提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用個體為腎管飽滿的單環刺螠成體，取自“煙臺海腸”地理標志產品保護范圍的牟平金山港海域，取材時間為2015年5月9-15日。個體體長10～18 cm，體質量86～132 g。

1.2 方法

1.2.1 不同受精方法的受精率檢測

1.2.1.1 自然受精

選取腎管飽滿的單環刺螠親體200只，放于6.0 m×3.3 m×1.0 m的水泥池中。實驗用的海水為過濾海水，控制水溫在(18.0±1)℃，鹽度(29.0±1)，pH 7.8。待親體出現自然排放后，揀出正在排放的雄性個體，以避免精液過多；當水中卵子密度達到2 ind./mL時，將親體全部取出；精、卵在水中自然受精，1 h后，用200目篩網隨機撈取卵子，于Olympus CX21顯微鏡下觀察放出極體的情況，隨機選取幾個視野，計數100個卵子，統計受精卵數量，按照公式(1)計算受精率。實驗重復3次。

式(1)

1.2.1.2 人工授精

選取腎管飽滿的單環刺螠雄性個體10只，人工解剖法由腎管獲取成熟的精子，混合均勻后取精液3滴，滴加到100mL過濾海水中，再次混合均勻，即得精子懸液。在50cm×30cm×40cm玻璃水槽內進行人工授精。取同一雌體的卵子，計數后放入水槽內，保證不同實驗組水槽內的卵子數量相當，約為1～2ind./mL；按照精卵比例為2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1等6個梯度加入精子懸液并混勻。每組3個重復，實驗重復3次。1h后隨機取樣，并按照1.2.1.1的方法計數受精卵數量和計算受精率。

1.2.2 環境因子對受精卵孵化的影響

每個環境因子實驗均取同一雌體的受精卵為實驗對象，人工授精的精卵比例為10∶1，受精卵的密度為1 ind./mL(除密度組以外)。實驗在50 cm×30 cm×40 cm玻璃水槽內進行，實驗水體45 000 mL。除不充氣實驗組外，水槽內均設置100目散氣石2個，孵化過程中連續微量充氣，每間隔0.5 h攪水1次。每個實驗組均設3個平行組，實驗重復3次，每組計數受精卵數量不少于100只。孵化率按照下列公式(2)計算。

式(2)

1.2.2.1 水溫對孵化的影響實驗

設置 9.0、12.0、15.0、8.0、21.0、24.0、27.0 ℃共7個溫度實驗組，通過在玻璃水槽外加冰或在水槽內用控溫電熱棒調節實驗海水的溫度，觀察不同水溫對孵化的影響。培育海水鹽度為29.0，pH為7.81。

1.2.2.2 鹽度對孵化的影響實驗

設置15.0、17.8、20.9、24.1、27.2、30.0、32.9、36.1共8個鹽度實驗組，使用過濾海水加蒸餾水或加食鹽來調配實驗海水的鹽度。培育海水溫度保持在(18.0±0.5)℃，pH為7.81。

1.2.2.3pH對孵化的影響實驗

設置4.98、5.97、6.96、8.02、9.01、9.98共6個pH實驗組，使用1%的NaOH溶液和1%的HCL溶液調配實驗海水的pH。培育海水溫度保持在(18.0±0.5)℃，鹽度為29.0。

1.2.2.4 充氣方式對孵化的影響實驗

設置不充氣+不攪動、不充氣+攪動、充氣+不攪動、充氣+攪動共4種不同充氣方式實驗組，充氣為連續微量充氣，攪動為每0.5h攪動水體1次，使沉在水底的卵浮起。培育海水溫度保持在(18.0±0.5)℃，鹽度為29.0，pH為7.81。

1.2.2.5 密度對孵化的影響實驗

設置0.5、1、2、4、8ind./mL共5個孵化密度實驗組，觀察不同密度對孵化效果的影響。培育海水溫度保持在(18.0±0.5)℃，鹽度為29.0，pH為7.81。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0 軟件包對數據進行單因子方差分析，檢驗方差齊性，并對數據進行Duncan多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 自然受精的受精率高于人工授精

生殖季節，雄性腎管中精液的密度為4.2×109ind./mL。由圖1可見，自然受精的受精率(95.67±2.32)%，顯著高于人工授精(8.79±6.02)%～(57.83±8.23)%(P<0.05)；人工授精方法中，精卵比例為5∶1和10∶1的受精率分別為(43.47±8.54)%和(57.83±8.23)%，兩者差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他精卵比例實驗組(P<0.05)。

通過顯微鏡觀察可見，多數卵子周邊的精子數在2～4個；精卵比例過低或過高時的受精率均較低：精卵比例較低時，精子與卵相遇機會較小從而導致受精率下降；反之，當精卵比例較高時，卵子周邊附著的精子過多，精子間會存在較大的競爭，也將導致受精率的下降。

圖1 不同受精方法的受精率同一指標中標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0. 05)，下同。Fig.1 Fertilization rates by different fertilization methods In the same index, the differences between the groups with different lowercase letters were significant (P<0.05),and the same lowercase letters were not significant (P>0.05), the same below.

2.2 環境因子對受精卵孵化的影響

2.2.1 水溫對孵化的影響較大

實驗結果表明，單環刺螠的孵化時間受水溫的影響較大。9.0～24.0 ℃時，受精卵均可孵化，但所需時間為54.0～19.0 h不等，水溫與孵化時間呈現負相關性；27 ℃時，胚胎發育可以持續至囊胚，之后發育停滯，胚胎逐漸死亡并分解，水體變渾濁并有異味產生。不同水溫條件下，胚胎發育不同階段所需時間詳見表1。

水溫對受精率和孵化率均構成一定影響(圖2)。經SPSS軟件Duncan法多重比較分析表明，除9.0 ℃水溫時的受精率(41.29±4.41)%顯著低于其他水溫實驗組的受精率(P<0.05)外，其他各組受精率無顯著差異(P>0.05)，較小的差異表現為：15.0～21.0 ℃水溫條件下，受精率可達50%以上；12和24.0 ℃條件下，受精率接近50%。

相較受精率，孵化率受水溫的影響較大。15.0～21.0 ℃時，孵化率均達86%以上，顯著高于其他水溫實驗組(P<0.05)；24.0 ℃時的孵化率也較高，達到(82.11±2.32)%，顯著高于9.0和12.0 ℃時的孵化率；27 ℃條件下，單環刺螠卵雖可正常受精，受精率為(45.29±2.32)%，但受精卵卻不能完成孵化過程。從胚胎發育以及后期生長情況來看，單環刺螠的適宜孵化水溫為15.0～21.0 ℃。

表1 不同水溫下受精卵孵化所需要的時間Tab.1 The incubation time of fertilized eggs at different water temperatures

注：鹽度29.0，pH 7.81。

圖2 不同水溫對單環刺螠受精和孵化的影響鹽度：29.0；pH：7.81。Fig.2 Effects of different water temperature on fertilization and hatching of Urechis unicinctus Salinity: 29.0; pH: 7.81.

2.2.2 鹽度對孵化有一定影響

如圖3所示，受精2 h時，鹽度為24.1、27.2和30.0的實驗組己有80%以上的受精卵卵裂為2細胞或4細胞，這3個不同鹽度實驗組的卵裂率相互之間差異不顯著(P>0.05)，但卻顯著高于其他不同鹽度實驗組(P<0.05)；鹽度15.0～20.9及鹽度36.1的實驗組90%以上的受精卵尚未卵裂，并且已經卵裂的受精卵分裂球不正常，近50%為畸形。

受精36h時，只有鹽度為24.1、27.2和30.0的實驗組中有幼蟲孵化，孵化率以鹽度27.2實驗組最高，達(86.70±2.24)%，顯著高于其他各組；鹽度24.1與30.0的實驗組孵化率差異不顯著，分別為(61.53±2.24)%和(69.22±2.26)%。鹽度32.9和36.1的實驗組中胚胎大部分在囊胚期停止發育，培養水體稍有渾濁；鹽度15.0、17.8和20.9的實驗組中卵己經分解，水體變渾濁。由此可見，單環刺螠受精卵孵化的適宜鹽度為24.1～30.0。

圖3 不同鹽度對單環刺螠受精和孵化的影響水溫：(18.0±0.5)℃；pH：7.81。Fig.3 Effects of different salinity on fertilization and hatching of Urechis unicinctus Water temperature: (18.0±0.5) ℃; pH: 7.81.

2.2.3pH對孵化有一定影響

由圖4可見，受精2h時，pH為6.96、8.02和9.01的實驗組受精卵已開始卵裂，3組的卵裂率差異不顯著(P>0.05)，且均在70%以上，其中以pH 8.02的實驗組卵裂比例最高，為(86.93±4.21)%；其他pH實驗組的卵裂率均顯著低于以上3組(P<0.05)，其中pH 4.98的實驗組中的胚體未見有正常卵裂的胚胎，大部分仍為未受精卵，并有相當一部分為畸形卵。

受精36 h時，只有pH為6.96、8.02和9.01的實驗組中有幼蟲孵化，其中，pH 8.02實驗組中的孵化率最高，為(84.26±4.20)%，顯著高于pH 9.01實驗組(67.95±6.56)%和pH 6.96實驗組(59.44±4.28)%。pH 4.98的實驗組中部分卵已經分解，水體變渾濁；pH 5.97和9.98的實驗組中均無幼蟲孵化，大部分發育停止在囊胚期，水體也變渾濁。根據實驗結果可認為單環刺螠受精卵孵化的適宜pH為6.96～9.01。

圖4 不同pH對單環刺螠受精和孵化的影響水溫：(18.0±0.5) ℃；鹽度：29.0。Fig.4 Effects of different pH on fertilization and hatching of Urechis unicinctus Water temperature: (18.0±0.5) ℃; salinity: 29.0.

2.2.4 充氣方式對孵化影響顯著

不同的充氣方式對卵子受精幾乎無影響，但對受精卵孵化效果卻影響很大(圖5)。充氣+攪動實驗組孵化率最高，達到(90.50±2.23)%，顯著高于其他各組(P<0.05)。攪動組和充氣組的孵化率差異顯著(P<0.05)，且兩者顯著高于既不充氣也不攪動實驗組(60.67±2.23)%(P<0.05)。單環刺螠的受精卵為沉性卵，通過攪動水體可將孵化率提高32.41%～34.36%，而充氣可將孵化率提高10.85%～12.49%。

圖5 不同充氣方式對單環刺螠受精和孵化的影響水溫：(18.0±0.5)℃；鹽度：29.0；pH：7.81。下同。Fig.5 Effects of different ways of inflating on fertilization and hatching of Urechis unicinctus Water temperature: (18.0±0.5)℃; salinity: 29.0; pH: 7.81. The same below.

2.2.5 密度對孵化影響較小

隨著孵化密度的增加，孵化率總體呈下降態勢；最高為1ind./mL孵化密度時的(89.43±2.34)%，最低為8ind./mL孵化密度時的(77.62±2.34)%(圖6)。不同孵化密度組間的孵化率差異不顯著(P>0.05)，即受精卵孵化密度對孵化率影響較小。

圖6 不同密度對單環刺螠受精卵孵化的影響Fig.6 Effects of different densities on the hatching of Urechis unicinctus

3 討論

大部分海洋無脊椎動物的早期胚胎發育均為經過完全卵裂后形成有腔囊胚，然后經內陷、內卷、分層等過程發育為原腸胚，包括像棘皮動物、多數軟體動物及環節動物等[18-19]。胚體繼續發育形成幼蟲，大多數海洋無脊椎動物能產生浮游生活的幼蟲，幼蟲經過一系列形態結構的變化，包括變態和固著等，發育成為幼體或成蟲[19]。在胚胎發育中，環境因子對其起著至關重要的作用，如海水的各種理化因子(如溫度、鹽度、pH和各種離子等)、餌料及生存底質等對胚胎發育影響顯著。本研究實驗結果表明，溫度、鹽度和pH均對單環刺螠的受精率和孵化率有不同程度的影響。

通過對單環刺螠受精卵孵化的環境因子分析得出，在較大培育水體(45 000 mL)中，單環刺螠孵化的適宜鹽度范圍為24.1～30.0，最適鹽度為27.2；適宜pH范圍為6.96～9.01，最適pH為8.02。該結論與牛從從等[5]的實驗室250 mL培育水體研究結果基本一致。本研究獲得的單環刺螠適宜孵化水溫為15.0～21.0 ℃，24.0 ℃時的受精卵孵化率也較高，與康慶浩等[17]報道單環刺螠幼體培育的適宜水溫為15.0～20.0 ℃略有差異。分析原因為康慶浩等[17]研究中幼體培育所涉及的階段較多，包括了從受精卵到13體節期的整個過程，而本研究是針對最初擔輪幼蟲期前的培育溫度進行的實驗測定。與其研究結論一致的是：在一定溫度范圍內，單環刺螠的胚胎發育速度隨水溫升高而加快，有明顯的正相關性。

需要指出的是，本文中獲得的對單環刺螠受精煉孵化的適宜環境因子數據，均是在環境單因素變化條件下得出的，對于不同環境因子間的相互影響未做驗證。在后續研究工作中，課題組將開展對不同環境因子的正交試驗設計和分析，以期獲得更準確的單環刺螠受精煉孵化的適宜環境因子數據。

另外，實驗還發現，單環刺螠孵化過程對溫度、鹽度和pH的適應范圍要比受精時對3個環境因子的適應范圍縮小。這說明隨著發育的進行，胚胎逐漸開始對環境因子，包括海水溫度、鹽度和pH等的作用敏感。這可能與前期胚胎發育有卵膜的保護有關，當發育至幼蟲失去卵膜的保護而與水體直接接觸時，環境因子對其影響變大，該結果與牛從從等[5]的實驗結論相吻合。

本課題組還對單環刺螠成體暫養階段對環境因子的耐受能力做了研究(未發表)。研究結果表明，單環刺螠成體對鹽度的適應能力較強，適應鹽度范圍19～35，適宜pH范圍6.5～8.5。對比單環刺螠在生長發育的初始階段與成體階段，其幼蟲孵化時期對鹽度和pH的適應能力均要弱一些。這是由于單環刺螠隨著發育到成體，機體功能已經完善和增強，對環境的適應能力也變的更強。因此，單環刺螠的胚胎發育階段在人工養殖過程中對環境的要求尤其嚴苛，做好受精與孵化階段的水質管理，為胚胎發育提供適宜的環境條件是做好單環刺螠苗種繁育工作的前提。

4 結論

人工授精是單環刺螠全人工苗種繁育的第一步，水溫、鹽度、pH等環境因子對單環刺螠的受精卵孵化均構成較大影響。本研究確定了人工授精適宜的精卵比例為5∶1～10∶1；單環刺螠受精卵孵化的適宜水溫為15.0～21.0 ℃，適宜鹽度為24.1～30.0，適宜pH為6.96～9.01；受精卵孵化時應連續充氣并伴以攪動，可有效提高孵化率。

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Artificial seed production ofUrechisunicinctusⅠ. Influence of environmentalfactors on fertilization and hatchingUrechisunicinctus

WANG Liyong1, HU Liping1*, JIANG Liming2, SUN Lingyi1, WANG He1

(1.Yantai Fisheries Research Institute, Yantai 264003, China;2.Shandong Oriental Ocean SCI-TECH CO., LTD, Yantai 264000, China)

In order to obtain the basic data for artificial seeding production ofU.unicinctus, the fertilization methods and environmental factors that affected the fertilization and hatching ofU.unicinctuswere investigated in the study. The results showed that the fertilization rate of natural insemination (95.67±2.32)% was significantly higher than that of artificial insemination(8.79±6.02)%～(57.83±8.23)% (P<0.05). In the experiment of artificial insemination, the fertilization rate with the sperm and egg ratio of 5∶1 to 10∶1 was significantly higher than that of the other groups (P<0.05), and it was about 50%. In respect of the environmental factors, the hatching rate was above 86% when the water temperature was 15.0～21.0℃, significantly higher than that of the other water temperature groups (P<0.05). The larvae hatched in the 24.1 ～ 30.0 salinity and the highest hatching rate (86.70 ± 2.24)% happened at the salinity of 27.2, which was significantly different from the other groups (P<0.05). The larvae hatched in the pH 6.96～9.01 and the highest hatching rate (84.26 ± 4.20)% appeared at pH 8.02, which was significantly different from the other groups (P<0.05). The hatching rate of the fertilized eggs at 1 ind./mL was (89.43 ± 2.34)%, which was relatively higher than the other experimental groups, but the difference was not significant (P>0.05). The hatching rate of the group with aeration and agitation (90.50 ± 2.23)% was significantly higher than that of the other groups (P<0.05). The hatching rate was increased by more than 30% by agitating the water, and it was increased by more than 10% by aeration. In conclusion, the fertilization rate and hatching rate ofU.unicinctuswere significantly affected by the different fertilization methods and the changes of environmental factors (water temperature, salinity, pH, means of aeration etc.). In the present study, the optimal proportion of sperm-egg artificial insemination and the optimum environmental factors for hatching of fertilized eggs in large experimental water were obtained, which would provide a reliable reference for the whole artificial seed breeding ofU.unicinctus. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(4):37-44]

Urechisunicinctus; artificial seeding production; fertilization; hatching; environmental factors

HU Liping, liping.hu1985@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.04.006

2017-01-16；接收日期：2017-04-06

山東省科技發展計劃項目(2014 GHY 115028)

王力勇(1968-)，男，本科，高級工程師，研究方向為海洋經濟生物育種與人工養殖技術，wly6812@163.com 通信作者：胡麗萍，工程師，研究方向為海洋生物遺傳育種及水產品質量檢測，liping.hu1985@163.com

S96

A

2095-1833(2017)04-0037-08