還原型谷胱甘肽脂質體的制備與表征研究

陳云輝馮珺蔡鑫君周中元

還原型谷胱甘肽脂質體的制備與表征研究

陳云輝1馮珺2蔡鑫君2周中元2

還原型谷胱甘肽；脂質體；制備；表征

還原型谷胱甘肽（GSH）是一種參與體內多種重要的生化代謝反應的化合物，是維持體內正常的氧化還原環境的關鍵因素。臨床上常用于藥物中毒、肝功能異常等[1-3]。但GSH屬于多肽類藥物，存在透過細胞膜能力差、易氧化、穩定性差等問題，給臨床應用造成了一定的影響。脂質體作為一種由脂質雙分子層包裹形成的微型泡囊體，因其磷脂雙分子層與細胞膜的親和力高，更容易將藥物輸送到細胞內，同時可以避免藥物被分解破壞，并能使藥物緩慢釋放，有利于減少給藥次數，提高生物利用度[4]。因此為了解決GSH存在的問題，更好地發揮GSH藥效，并使其具緩釋長效功能，本課題組制備GSH脂質體，并對其進行表征研究，從而為研究穩定長效的GSH制劑提供依據。

1 實驗材料

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Nano-ZS型粒徑分析儀（英國馬爾文公司）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；R202旋轉蒸發器（上海申勝生物技術有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海志威電器有限公司）；循環水真空泵（河南省予華儀器有限公司）；pH（酸度）計（上海天達儀器有限公司）；水浴恒溫震蕩器（常州溪華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑還原型谷胱甘肽對照品（中國藥檢所，批號130412）；還原型谷胱甘肽原料藥（上海寶曼生物科技有限公司，批號20150612）；庚烷磺酸鈉（山東禹王實業有限公司，批號2013110801）；大豆卵磷脂（德國Lipoid公司，批號X0515）；膽固醇（Sigma公司，批號）；甲醇、磷酸、氯仿、檸檬酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（以上皆為分析純）。

2 方法與結果

2.1 還原型谷胱甘肽含量測定方法

2.1.1 色譜條件色譜柱為Hypersil BDS C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鈉6.80g，庚烷磺酸鈉2.20g，加水溶解使成1000mL，用磷酸調節pH值至3.0）-甲醇（96:4）；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為210nm；進樣量為20μL。在此色譜條件下，空白脂質體和還原型谷胱甘肽對照品及含藥樣品色譜圖見圖1（封三）。

2.1.2 對照品的制備精密稱取還原型谷胱甘肽對照品7.5mg，置于25mL容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.3mg/mL還原型谷胱甘肽對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的建立還原型谷胱甘肽對照品溶液配成系列濃度，按“2.1.1”項進樣分析，以峰面積為縱坐標，相應進樣濃度為橫坐標做回歸方程，回歸方程為：Y=10770X+82.210（r=0.999），分析表明還原型谷胱甘肽在0.06～0.3mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗與重復性試驗精密吸取還原型谷胱甘肽對照品溶液20μL，按“2.1.1”項下方法重復進樣6次，發現其RSD=1.02%（n=6），表明本方法精密度良好。平行配制6份上述對照品溶液，按“2.1.1”項方法測定，結果為RSD=0.82%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗取同一還原型谷胱甘肽對照品溶液，在不避光條件下分別放置0、0.5、1、1.5、2、3、4h，按“2.1.1”項下方法進行測定，結果為RSD=0.19%（n=7），表明對照品溶液4h內保持穩定。

2.2 還原型谷胱甘肽脂質體的制備分別稱取膽固醇和卵磷脂置于燒杯中，加入氯仿溶解，磁力攪拌均勻后將類脂溶液置于圓底燒瓶中，在37℃水浴中旋轉蒸發除去氯仿，待類脂物在瓶壁上形成一層薄膜后，加入0.3mol/L檸檬酸10mL，繼續旋轉水合30min，得空白脂質體。將還原型谷胱甘肽溶液加入空白脂質體中，調節pH為到8.0，將還原型谷胱甘肽脂質體在冰水浴中短時超聲5min，即得。

2.3 還原型谷胱甘肽脂質體的表征研究

2.3.1 包封率的測定采用超速離心法測定還原型谷胱甘肽脂質體的包封率。取還原型谷胱甘肽脂質體溶液適量，15000r/min離心15min。HPLC測定上清液中的還原型谷胱甘肽含量，標為W1；再取等量的還原型谷胱甘肽脂質體溶液，加入甲醇超聲破壞脂質體，以HPLC測定還原型谷胱甘肽的總量，標為W0；計算包封率為EE=（W0-W1）/W0×100%，其中，EE：包封率；W0：還原型谷胱甘肽投藥量；W1：未包裹進脂質體中的藥物量。

為了驗證上述制備處方工藝的穩定性，根據確定工藝制備還原型谷胱甘肽脂質體，實驗重復3次，所得還原型谷胱甘肽脂質體的平均包封率為82.31%，RSD為3.45%，表明該工藝穩定可靠。見表1。

表1 還原型谷胱甘肽脂質體的包封率檢測結果

2.3.2 平均粒徑的測定取適量脂質體用激光粒度測定儀測定平均粒徑，顯示平均粒徑為109.8nm，見圖2（封三）。

2.3.3 外觀形態取少量脂質體溶液滴于銅網上，靜置10min后用濾紙片吸干，再滴加2.0%磷鎢酸溶液對其進行染色，待自然揮干后，在透射電鏡鏡下觀察脂質體外觀形態。結果見圖3（封三），脂質體結構完整，外觀呈球形，分布均勻。

2.3.4 體外釋放測試采用透析袋法對還原型谷胱甘肽脂質體的體外釋藥特性進行研究。精密量取相同的還原型谷胱甘肽脂質體3份，置于經蒸餾水浸泡處理過的透析袋內，將袋口扎緊。將含藥透析袋置于（pH7.4）緩沖液，于37℃恒溫水浴振蕩（100r/min），分別于0.1、1、2、3、4、5、6、8、12、18、36h取樣，取樣后補加等量同溫釋放介質，樣品用0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液測定還原型谷胱甘肽含量，計算累積釋放百分率（Qn）。見圖4（封三）。結果發現還原型谷胱甘肽脂質體溶液在18h時已基本釋放完全。

為探討釋放機理，將釋藥曲線分別用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程、Weibull方程對釋藥數據進行擬合，見表2。結果表明，還原型谷胱甘肽脂質體溶液的體外釋放曲線符合Weibull方程模型，為lnln（1/1-Q）=0.3817lnt-0.3227，r=0.9922，其中Q為累積釋放百分率，t為取樣時間。

3 討論

目前，薄膜分散法、反相蒸發法、注入法和復乳法等是常用的脂質體制備方法[5-6]，本文選擇的pH梯度法屬于“主動載藥”技術，與傳統的“被動載藥”技術相比，可以更顯著地提高脂質

表2 還原型谷胱甘肽脂質體體外釋藥曲線擬合結果

體的包封率和穩定性。通過調節脂質體內外的pH梯度，使得更多的脂質體外水相中藥物進入脂質體內部，可以明顯提高藥物的包封率，特別適合水溶性藥物的包裹。

通過還原型谷胱甘肽對脂質體的體外釋放度研究可以為體內藥動學過程提供一定的參考，本研究制備的還原型谷胱甘肽脂質體體外釋放度實驗結果表明，還原型谷胱甘肽可以有效地緩釋18h，明顯優于原藥，可以預測還原型谷胱甘肽脂質體可增加還原型谷胱甘肽在體內循環時間，并能減少藥物降解，從而提高藥物療效。這一研究結果將為還原型谷胱甘肽脂質體體內藥動藥效提供基礎數據。

［1］王祖君，李小丹.還原型谷胱甘肽聯合丹參注射液治療酒精性肝病臨床觀察［J］.現代中西醫結合雜志，2016，25（12）：1304-1306.

［2］雷澈.還原型谷胱甘肽注射液治療小兒肺炎合并肝功能損害的療效觀察［J］.臨床合理用藥，2016，9（6）：52-53.

［3］夏毅如，陳振華.聯合應用還原型谷胱甘肽和促肝細胞生長素治療嬰兒肝炎綜合征療效研究［J］.中國現代藥物應用，2016，10（9）：175-176.

［4］楊文秀.脂質體主動載藥的研究與應用進展［J］.現代醫藥衛生，2011，27（17）：2647-2648.

［5］沈丹，張蕊，薛婧等.柔性脂質體研究進展［J］.中國醫師雜志，2014，16（3）：425-427.

［6］盛竹君，徐維平，徐婷娟，等.脂質體藥物傳輸系統的研究新進展［J］.中國藥業，2015，24（23）：6-9.

（收稿：2016-12-29修回：2017-01-20）

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浙江省藥學會醫院藥學專項百特醫院藥學專項科研（No. 2013ZYY38）

1杭州市江干區人民醫院藥劑科（杭州310021）；2浙江省中西醫結合醫院藥劑科（杭州310003）

馮珺，Tel：057156109723；E-mail：492933372@qq.com