豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌多重PCR檢測方法的建立及應用

何亞鵬，許信剛，付明哲，張 琪

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100)

豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌多重PCR檢測方法的建立及應用

何亞鵬，許信剛，付明哲，張 琪

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100)

為建立在臨床樣本能夠同時檢測豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的多重PCR方法，根據NCBI已收錄的布魯菌全基因，設計并合成4對特異性引物，通過優化多重PCR的反應條件，建立能夠同時檢測4種布魯菌的多重PCR診斷方法。特異性試驗結果表明，可以從4種布魯菌以及 4 種細菌混合物中擴增出大小分別為276、494、733和976 bp的特異性條帶，對照組的檢測結果為陰性；敏感性試驗結果表明，對4種病原菌基因組DNA的檢出量為豬種32.2 pg、牛種21.3 pg、羊種27.5 pg、綿羊種43.2 pg；人工模擬感染樣本檢測結果表明，能從混合感染的病料中特異地檢測出 4 種病原菌。應用該方法對 200 份臨床奶山羊乳樣進行檢測，結果檢出4份陽性。建立的多重PCR方法具有特異性強、敏感度高、穩定性好的特點，可以有效地檢測 4 種布魯菌的感染。

豬種布魯菌；牛種布魯菌；羊種布魯菌；綿羊種布魯菌；多重PCR

布魯菌病是由布魯菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病，嚴重危害經濟發展和公共健康，世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類重要傳染病，中國將其列為二類傳染病[1]?，F已確定的布魯菌有 7 個種(牛種、羊種、綿羊附睪種、豬種、犬種、沙林鼠種、海洋種)和20 個生物型[2]。布魯菌對牛、羊和豬的危害巨大，感染牛的有牛種、羊種和豬種布魯菌；感染山羊的有羊種、牛種布魯菌；感染綿羊的有綿羊種、牛種菌和羊種布魯菌；感染豬的有豬種、牛種和羊種布魯菌[3]。

布魯菌病臨床癥狀極為相似，在臨床上很難確定是那種病原感染所致，另外，臨床上還有混合感染的病例。目前，布病的診斷主要采用病原學和血清學方法，但這些傳統方法存在著檢測時間長、操作步驟繁瑣、假陽性和假陰性較高等問題，并對實驗人員的健康安全構成一定的威脅[4]。目前PCR方法對布魯菌的試驗鑒定多以種鑒定為主[5]，因此有必要建立能同時、快速、精確檢測鑒別 4 種布魯菌感染的多重PCR檢測方法。多重PCR技術是在同一PCR體系中加入多對引物對多種目的基因進行同時擴增的分子生物學檢測方法，它具有快速、靈敏、特異等優點。 IS711基因為布魯菌的轉座基因，一般布魯菌的基因組里都有多個 IS711插入序列，不同種布魯菌的 IS711插入序列數量也不同。 IS711基因序列本身在種間的差別很小，但不同種布魯菌的 IS711基因插入位置有種間特異性，可用于鑒別診斷[6]。本研究根據布魯氏菌不同種型 IS711序列拷貝數的差異設計引物檢測特異性目的基因，建立能同時檢測布魯菌 4 種種型的多重PCR方法，該方法具有較好的特異性、敏感性及重復性，比傳統的細菌學方法簡便、經濟，可以應用于獸醫臨床診斷以及食品安全的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 標準豬種布魯菌S2(CVCC 70502)、牛種布魯菌A19(CVCC 70202)、羊種布魯菌M5 疫苗株為新疆天康畜牧生物技術股份有限公司產品；綿羊種布魯菌由西北農林科技大學動物醫學院獸醫微生物實驗室分離，經測序鑒定后保存；金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙門菌、大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌由西北農林科技大學動物醫學院獸醫微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL 2000 DNA marker等均購自康為世紀生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 試驗動物 6 周齡雌性BALB/c小鼠購自第四軍醫大學實驗動物研究中心。

1.1.4 樣品來源 200 份乳樣采自陜西省某奶山羊養殖場。

1.2 方 法

1.2.1 模板的制備 將布魯菌及試驗用各菌株分別接種于各自適宜的液體培養基，放入搖床，37 ℃、220 r/min培養24 h。取1 mL細菌培養液，12 000 r/min離心1 min，棄上清后按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取的各細菌DNA保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 引物設計 根據GenBank中已發布的豬種(B.suis)、牛種(B.abortus)、羊種(B.melitensis)、綿羊種(B.ovis)布魯菌的 IS711基因序列，并參照國內外相關文獻[7-10]，利用Primer 5.0分析軟件，設計用于擴增布魯菌種特異性基因的4對特異性引物。引物序列及其位置、擴增產物的大小見表1，引物由Invitrogen上海貿易有限公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of primer for PCR

1.2.3 單項PCR檢測方法的建立 為確定單項PCR擴增的最佳條件及檢測單基因PCR擴增的特異性，分別以 4 個細菌的DNA為模板，用相應的引物進行單項PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)：模板DNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2 μL MgCl2(25 mmol/ L)，Taq酶0.2 μL(5 U/μL)，10×PCR buffer 2.5 μL，其余用滅菌ddH2O補足。PCR反應程序：95 ℃變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環；最后 72 ℃延伸10 min。為摸索不同退火溫度的影響，將退火溫度設定為51、53、55、57 ℃ 4個梯度進行PCR反應，以確定單項PCR最佳退火溫度。

1.2.4 多重PCR反應條件的優化 影響多重PCR反應的主要因素是退火溫度和引物濃度，因此對這2 個反應條件進行優化。將豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的DNA均稀釋為100 μg/mL，等量混勻作為模板。根據引物初始退火溫度，按照2 ℃梯度設定51、53、55、57、59 ℃的多重PCR退火溫度試驗；按照0.2 μmol/L濃度梯度設定各引物對濃度組合(0.2、0.2、0.2、0.2 μmol/L；0.4、0.4、0.4、0.4 μmol/L；0.6、0.6、0.6、0.6 μmol/L；0.8、0.8、0.8、0.8 μmol/L；1.0、1.0、1.0、1.0 μmol/L)的引物優化試驗，篩選多重PCR擴增的最佳反應體系和程序。

1.2.5 多重PCR特異性試驗 分別以豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌及4種細菌隨機組合混合物的基因組作為模板，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌、沙門菌、無乳鏈球菌等細菌DNA和雙蒸水作為陰性對照，使用4對引物的混合物，采用優化的多重PCR擴增條件進行擴增，測試多重PCR反應的特異性。

1.2.6 多重PCR靈敏性試驗 分別提取4種細菌DNA，經核酸蛋白定量儀測得豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌DNA的質量濃度分別為322.42、213.34、275.14、432.13 ng/μL，多重PCR從初始質量濃度開始，按101～106梯度進行倍比稀釋，采用優化的多重PCR條件進行擴增，以檢測其敏感性。

1.2.7 重復性試驗 用建立的多重PCR方法，分別對豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌及4者混合的陽性樣品、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌、沙門菌、無乳鏈球菌等細菌對照樣品各2份重復檢測3次，以驗證多重PCR方法的穩定性。

1.2.8 人工模擬試驗 將4種細菌進行不同種類的排列與組合，按照下列設計對16只小鼠進行腹腔感染細菌：豬種(0.2 mL)；牛種(0.2 mL)；羊種(0.2 mL)；綿羊種(0.2 mL)；豬種+牛種(每種菌0.1 mL)；豬種+羊種(每種菌0.1 mL)；豬種+綿羊種(每種菌0.1 mL)；牛種+羊種(每種菌0.1 mL)；牛種+綿羊種(每種菌0.1 mL)；羊種+綿羊種(每種菌0.1 mL)；豬種+牛種+羊種(每種菌0.07 mL)；豬種+羊種+綿羊種(每種菌0.07 mL)；牛種+羊種+綿羊種(每種菌0.07 mL)；豬種+牛種+綿羊種(每種菌0.07 mL)；豬種+牛種+羊種+綿羊種(每種菌0.05 mL)；生理鹽水(0.2 mL對照組)。24 h后將小鼠斷頸處死，無菌采取肝、脾、淋巴結等病料，混合樣品約100 mg，加液氮充分研磨后轉入組織勻漿器中，加入10 mmoL/L PBS(pH 7.2)充分勻漿。按照細菌DNA提取試劑盒方法提取細菌DNA，利用已建立的多重PCR方法進行檢測。

1.2.9 臨床樣品檢測 利用已建立的多重PCR方法檢測陜西省某奶山羊養殖場送檢的200份待檢乳樣。乳樣5 mL 10 000 r/min離心10 min，棄掉上清后按照細菌DNA提取試劑盒方法提取細菌DNA，利用已建立的多重PCR方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 單項PCR擴增

單基因PCR擴增后，可分別觀察到 276 bp(豬種)、494 bp(牛種)、733 bp(羊種)和 976 bp(綿羊種)的條帶(圖1)，大小與預期相符，表明設計的引物特異。采用不同的退火溫度進行PCR反應，結果表明，退火溫度為51、53、55、57 ℃時結果差異不大(圖1)。

a.豬種布魯菌B.suis；b. 牛種布魯菌B.abortus；c.羊種布魯菌B.melitensis；d.綿羊種布魯菌B.ovis；M.DL 2000 DNA marker；1～4.退火溫度分別為51、53、55、57 ℃ Annealing temperature were 51 ℃，53 ℃，55 ℃，57 ℃, respectively

圖1 單項PCR擴增及退火溫度的優化

Fig.1 Single PCR amplification and optimization of annealing temperature

2.2 多重PCR退火溫度優化

采用不同的退火溫度(51、53、55、57、59 ℃)進行多重PCR反應，結果表明，四重PCR反應在 53、55、57 ℃時都有較好的擴增結果(圖2)，以降低非特異性擴增的可能性及得到理想的擴增效果為原則，最終選擇55 ℃作為多重PCR反應的退火溫度。

M.DL 2000 DNA marker；1～5.退火溫度分別為51、53、55、57、59 ℃ Annealing temperatures were 51 ℃，53 ℃，55 ℃，57 ℃ and 59 ℃, respectively

圖2 多重PCR退火溫度的優化

Fig.2 Optimal annealing temperature in multiplex PCR

2.3 引物比例優化

取不同濃度的引物組合進行多重PCR反應，以摸索引物的最佳濃度及各引物間的最佳比例。結果表明，4種引物對的濃度均為0.6 μmol/L時多重PCR的擴增效果最理想(圖3)。

M.DL 2000 DNA marker；1～5.豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌引物的濃度分別為：0.2、0.2、0.2、0.2 μmol/L；0.4、0.4、0.4、0.4 μmol/L；0.6、0.6、0.6、0.6 μmol/L；0.8、0.8、0.8、0.8 μmol/L；1.0、1.0、1.0、1.0 μmol/L Primers concentration(μmol/L)forB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.oviswere 0.2, 0.2, 0.2, 0.2 μmol/L；0.4, 0.4, 0.4, 0.4 μmol/L; 0.6, 0.6, 0.6, 0.6 μmol/L; 0.8, 0.8, 0.8 0.8 μmol/L; 1.0, 1.0, 1.0, 1.0 μmol/L,respectively

圖3 多重PCR引物濃度的優化

Fig.3 Optimal primer concentration used in multiplex PCR

2.4 多重PCR反應特異性擴增

采用優化的擴增條件進行多重PCR反應。結果表明，豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌及 4 種細菌的混合樣品均可擴增出特異的目的片段，而其他細菌和水均無擴增條帶，結果與預期相符，說明方法特異性良好(圖4)。

2.5 多重PCR反應靈敏性試驗

采用優化的多重PCR擴增條件擴增倍比稀釋的 4 種細菌DNA，分別測出多重PCR對豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的最低檢出量分別為 32.2、21.3、27.5、43.2 pg(圖5)。

M.DL 2000 DNA marker；1.豬種布魯菌B.suis；2.豬種+牛種布魯菌B.suisandB.abortus；3.豬種+牛種+羊種布魯菌 suis,B.abortusandB.melitensis；4. 豬種+牛種+羊種+綿羊種布魯菌B.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovis；5.金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus；6.大腸埃希菌Escherichiacoli;7.多殺性巴氏桿菌Pasteurellamultocida；8. 沙門菌Salmonella；9.無乳鏈鏈球菌Streptococcusagalactiae；10.雙蒸水 ddH2O

圖4 多重PCR特異性試驗

Fig.4 Specificity test of multiplex PCR

M.DL 2000 DNA marker；1～6. 101～106倍比稀釋的4種細菌DNA混合物的PCR擴增結果 PCR result for different dilutions of template from 101to106

圖5 多重PCR靈敏性測定

Fig.5 Sensitivity of multiplex PCR assay

2.6 重復性試驗

用建立的多重PCR方法在不同時間進行 3 次重復試驗，結果獲得相同的檢測結果，表明該方法重復性良好。

2.7 人工模擬試驗

無菌采取1～16號小鼠病料并提取DNA，按照優化的多重PCR方法進行擴增，結果見圖 6。每份病料均擴增出所感染細菌相應的特異條帶，而生理鹽水對照無擴增條帶，證明建立的多重PCR方法可以應用于臨床病料的檢測。

M.DL 2000 DNA marker；1～16.1～16號小鼠樣品 Samples of 1-16 mice

圖6 人工模擬試驗多重PCR檢測

Fig.6 Multiple PCR detection results of artificial simulation test

2.8 臨床樣本檢測

對200份奶樣進行檢測，結果檢出 4 份陽性，均為羊種布魯菌，檢出率約為 2%。部分樣品的檢測電泳結果見圖7。4 份陽性樣品經回收后測序均為羊種布魯菌的特異性序列。

M.DL 2000 DNA marker；1～9. 9個臨床樣品 Nine clinical samples；；10.陰性對照 Negative control

圖7 部分臨床樣品的多重PCR檢測

Fig.7 Multiple PCR detection results of some clinic samples

3 討 論

布魯菌可感染豬、牛、羊、綿羊、鼠、犬和人類，對養殖行業以及人類健康構成嚴重威脅[11]。布魯菌病在全世界許多國家都有分布，不論它在哪個國家暴發都會給該國帶來巨大的經濟損失，甚至造成人員的死亡，因此它在公共衛生上有很重要的意義。由于傳統的檢測方法有很多的缺點和局限性，不能在全世界范圍內消滅布氏桿菌病。近年來，隨著分子生物學的不斷發展和各項技術的廣泛應用，為細菌分類鑒定提供一些有效的新方法，可以在基因水平上對布氏桿菌病進行檢測，提高檢測的準確性和速度。

IS711是布魯菌基因組中特有的插入序列，該序列在不同種布魯菌基因組中非常保守，但卻存在拷貝數差異[6]。本研究參照Genbank提供的豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的 IS711基因序列和相關文獻[6-7,12]，選取 4 對特異性引物，擴增片段大小分別為 276 bp(豬種)、494 bp(牛種)、733 bp(羊種)和 976 bp(綿羊種)。本研究首先經過摸索反應條件建立單項PCR反應，然后通過預試驗確定多重PCR反應的循環體系及反應條件，重點對影響多重PCR反應的主要因素如退火溫度和引物濃度進行適當的調整和優化，最終確定多重PCR的最佳退火溫度為 55 ℃，最佳引物濃度為 0.6 μmol/L。本研究建立的多重PCR反應對豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌DNA的最低檢出量分別為32.2、21.3、27.5、43.2 pg，具有較高的靈敏性，這樣的敏感性遠高于傳統的檢測方法，并且已經可以滿足臨床檢測和監測的需要。

本試驗中目的片段均間隔 200 bp以上，擴增結果顯示，目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區分且無非特異性擴增出現。用本試驗建立的PCR方法對臨床模擬樣品和臨床奶樣品進行檢測，結果模擬試驗顯示完全能夠檢測到四重、三重、兩重、單一細菌的感染，臨床奶樣也檢出布魯菌的污染。本研究建立的多重PCR檢測方法可以為快速檢測豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌提供敏感和特異的技術手段，以期達到對導致動物疫病以及動物奶產品污染的布魯菌的快速檢測。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Foundation and Initial Application of Multiplex PCR Method for DetectingB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisInfection

HE Yapeng, XU Xingang, FU Mingzhe and ZHANG Qi

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to develop multiplex PCR assay for clinical detection ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisinfection, four pairs of primers were designed and synthesized based on highly conserved regions ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisgenome sequence in Genbank. The multiplex PCR reaction condition was optimized and multiplex PCR method for detectingB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisinfection was established. The specificity test showed that fragments of 276 bp, 494 bp, 733 bp and 976 bp were amplified from genomic DNA ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovis，respectively. No amplification was achieved from control groups of other bacteria. The sensitivity test showed that the multiplex PCR could detect genome DNA of 21.3 pg forB.abortus, 27.5 pg forB.melitensis, 43.2 pg forB.ovisand 32.2 pg forB.suis. The artificial simulation test showed that the multiplex PCR could detect four kinds of pathogens from co-infection disease material. The initial application test showed 200 clinical goat’s milk samples were subjected to PCR. Among 4 clinical samples wereB.melitensis-positive. The result indicated the multiplex PCR method had advantages of specificity, sensitivity, repetition, and it could effectively detect the infection ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisin clinical samples.

B.suis;B.abortus;B.melitensis;B.ovis; Multiplex PCR

2016-05-03 Returned 2016-05-23

Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province (No.2016NY-092); Project of Major Industrial Innovation Chain of Shaanxi Province(No.2016KTZDNY02-06);Project for Technology Achievement Extension of Demonstration Station(Base)of Northwest A&F University(No.TGZX2015-32).

HE Yapeng, male, master student.Research area:molecular etiology and immunology. E-mail:879533817@qq.com

ZHANG Qi, female, Ph.D, lecturer.Research area:molecular etiology.E-mail:273010466@qq.com

日期：2017-08-18

2016-05-03

2016-05-23

陜西省農業科技創新與攻關(2016NY-092)；陜西省重點產業創新鏈(2016KTZDNY02-06)；西北農林科技大學試驗示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)。

何亞鵬，男，碩士研究生，從事分子病原學與免疫學研究。E-mail：879533817@qq.com

張 琪，女，博士，講師，主要從事分子病原學研究。E-mail：273010466@qq.com 付明哲，男，高級獸醫師，主要從事羊病研究。E-mail：286567031@qq.com

S855.1

A

1004-1389(2017)08-1135-06

FU Mingzhe, male, senior veterinarian.Research area:sheep diseases.E-mail:286567031@qq.com

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170818.0938.012.html