兔肝VX2腫瘤射頻消融后不同區帶VEGF的表達和細胞凋亡

劉 亞，呂維富，朱先海，施長杲，王亞光，劉開才，成德雷，周春澤，魯 東

(安徽醫科大學附屬省立醫院影像科，安徽 合肥 230001)

·基礎與實驗研究·

兔肝VX2腫瘤射頻消融后不同區帶VEGF的表達和細胞凋亡

劉 亞，呂維富*，朱先海，施長杲，王亞光，劉開才，成德雷，周春澤，魯 東

(安徽醫科大學附屬省立醫院影像科，安徽 合肥 230001)

目的分析兔肝VX2腫瘤射頻消融(RFA)后不同區帶血管內皮細胞生長因子(VEGF)的表達和腫瘤細胞凋亡情況。方法將48只兔肝移植VX2腫瘤，建立動物模型，分為實驗組(n=42)和對照組(n=6)。對實驗組行RFA，分別在術后即刻、1天、2天、1周、2周、3周各處死7只實驗兔，留存腫瘤標本，進行HE染色、VEGF檢測、Annexin V-FITC/PI標記和流式細胞儀檢測，觀察不同時間段、不同區帶的VEGF變化及細胞凋亡情況。結果實驗組RFA術后針道炭化區、熱凝固區和消融邊界區平均VEGF值差異均有統計學意義(P均<0.05)；針道炭化區、熱凝固區及邊界區術后即刻與其他時間點間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；針道炭化區及熱凝固區VEGF在術后即刻達高峰，術后1天～3周呈整體下降趨勢，消融邊界區VEGF在術后即刻到1周呈上升趨勢，2周后下降。術后針道炭化區、熱凝固區和消融邊界區平均腫瘤細胞凋亡率與對照組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，各區帶細胞凋亡率均在術后1天達高峰，后呈下降趨勢。結論RFA后針道區和熱凝固區內腫瘤細胞VEGF下降和腫瘤凋亡顯著，而消融交界區仍可能有存活的腫瘤細胞；在RFA后第3周時，殘留腫瘤細胞的增殖能力可恢復到術前狀態，此時宜進一步采取相應的治療措施。

兔；肝；VX2腫瘤；射頻消融；血管內皮生長因子；凋亡

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，我國是HCC的高發國家。發現HCC時已多屬中晚期，加之多數患者合并肝硬化，僅20%的患者有手術切除機會[1]。因此，肝癌的微創治療得以迅速發展。目前，射頻消融(radiofrequency ablation, RFA)已廣泛應用于臨床[2]。有研究[3]報道單次RFA后殘癌復發率約3%～52%。殘癌復發與RFA后殘余腫瘤組織細胞活性變化有關，殘余腫瘤釋放血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)對新生血管的形成及觸發轉移至關重要。探討RFA后靶區內不同區帶細胞的凋亡變化規律，有利于在肝癌的RFA治療中制定科學的治療方案，獲得最佳的“安全邊界”。因此，本研究旨在分析RFA后腫瘤不同區帶VEGF的表達及腫瘤細胞凋亡的變化規律。

1 材料與方法

1.1模型制備 荷VX2瘤種兔1只，健康新西蘭大白兔48只(由我院動物試驗中心提供)，3～5月齡，雌雄不限，體質量2.2～2.5 kg。切取種兔后腿VX2腫瘤邊緣生長旺盛區，剪成直徑約2 mm的小塊，置于生理鹽水保存。經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質量)對實驗兔進行全身麻醉，開腹將VX2腫瘤種植于兔肝臟左葉深處，完成實驗模型的制備。

1.2RFA方法 于腫瘤成功植入第14天行CT平掃和增強掃描，確定移植瘤生長情況。按照隨機數字表法將48只實驗兔隨機分為2組：實驗組(n=42)，全身麻醉開腹后行RFA治療(治療模式：功率48 W，溫度60～90℃，時間12 min)。分別于術后即刻和術后1天、2天、1周、2周、3周處死實驗兔(每個時間點7只)，取出病灶置于-80℃冰箱保存，行病理學及相關實驗室檢查。對照組(n=6)，動物直接處死后取組織標本。

1.3病理學檢查和流式細胞儀檢測 首先取大體病理標本進行觀察，同時實驗組根據RFA消融后瘤體呈現的3個區帶(即針道炭化區、熱凝固區、消融邊界區)進行組織提取，對照組取瘤體生長旺盛部分組織(各3塊)分別行HE染色、VEGF表達、膜聯蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)染色。并進行熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測。VEGF表達強度以強度評分(intersity score, IS)[4]表示，每張切片中隨機選取10個視野，將細胞染色強度分為4級，并分別記分：0分為陰性，細胞無顯色；1分為弱陽性，細胞顯色為淺黃色；2分為中度陽性，細胞顯色為棕黃色；3分為強陽性，細胞顯色為棕褐色。按以下公式計算IS：IS=∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，F為每級染色強度細胞數占全部視野細胞數的百分比，數字表示染色強度級別。采用流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.4統計學分析 采用SPSS 19.0統計分析軟件，計量資料以±s表示；實驗組不同時間點VEGF表達及細胞凋亡率的比較、實驗組各時間點不同區帶細胞凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1組織病理學改變 對照組：瘤體無明顯包膜，切面呈魚肉狀改變，部分組織壞死；光鏡下腫瘤細胞異型性明顯，見浸潤性癌巢，胞核大且深染。實驗組：RFA后即刻，病灶區由內向外大致分為針道炭化區、熱凝固區及消融邊界區。光鏡下見針道炭化區腫瘤細胞大量壞死，細胞核碎裂、固縮，1周后腫瘤細胞結構顯示模糊，出現溶解液化及血栓形成，2周后液化溶解范圍進一步擴大(圖1A)；熱凝固區以腫瘤細胞壞死為主，少量腫瘤細胞殘存，大量巨嗜細胞、中性粒細胞及少量凋亡細胞共存，1周后較多的炎性細胞明顯浸潤，3周后見部分腫瘤細胞存活；消融邊界區第1天可見大量的炎性細胞，肝竇間隙紅細胞交界區內伴隨形態、分布較規則的腫瘤細胞，1周后可見少量膠原組織及纖維組織，2周后殘存腫瘤細胞增生(圖1B)。

表1 RFA術后各消融區的VEGF的表達IS值(±s)

表1 RFA術后各消融區的VEGF的表達IS值(±s)

區帶即刻術后1天術后2天術后1周術后2周術后3周針道炭化區0.62±0.120.23±0.080.25±0.070.18±0.050.20±0.080.21±0.11熱凝固區0.58±0.070.22±0.110.24±0.050.19±0.060.25±0.110.30±0.06消融邊界區0.63±0.192.15±0.142.31±0.052.40±0.172.16±0.171.85±0.09

表2 實驗組RFA后不同區帶腫瘤細胞凋亡率的變化(%，±s)

表2 實驗組RFA后不同區帶腫瘤細胞凋亡率的變化(%，±s)

區帶術后即刻術后1天術后2天術后1周術后2周術后3周針道炭化區7.08±0.8724.78±5.8824.01±4.5919.67±3.4313.86±4.368.12±0.35熱凝固區41.54±5.2642.14±5.5240.00±6.0432.14±6.9622.00±5.085.06±0.67消融邊界區45.52±6.1256.28±4.9150.69±6.5447.60±5.8022.57±3.374.96±0.71

圖1 RFA后2周病理改變(HE，×400) A.針道炭化區,大片腫瘤細胞溶解、壞死，炎性細胞浸潤; B.消融邊界區，腫瘤區與正常組織分界明顯，纖維組織增生，炎性細胞浸潤明顯

圖2 RFA后1天不同區帶腫瘤細胞凋亡情況 A.針道區凋亡率17.21%; B.熱凝固區凋亡率43.89%; C.消融邊界區凋亡率62.34%

2.2VEGF表達 實驗組術后針道炭化區、熱凝固區和消融邊界區VEGF表達強度IS值術后各時間點的差異均有統計學意義(F=19.809、13.045和128.452，P均<0.05)，針道炭化區、熱凝固區及消融邊界區3個區帶術后即刻與其他時間點間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，但術后各時間點VEGF的變化規律不同，針道炭化區及熱凝固區VEGF在術后即刻達高峰，1天～2周呈下降趨勢，術后2周和3周略有上升趨勢，消融邊界區VEGF在術后即刻到1周呈上升趨勢，2周后下降。見表1。

術后即刻各區帶IS值無統計學差異(F=0.305，P>0.05)，術后1天～3周，各區帶VEGF值差異均有統計學意義(F=318.559、2 917.230、1 317.678、599.603、757.407，P均<0.05)；除術后即刻外，其余各時間點消融邊界區VEGF表達均較針道炭化區及熱凝固區增高，差異有統計學意義(P均<0.05)，1周后VEGF值針道炭化區、熱凝固區、消融邊界區依次呈上升趨勢。見表1。

2.3Annexin V-FITC/PI染色、熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測 熒光顯微鏡觀察顯示實驗組凋亡早期細胞膜呈綠色改變，中晚期凋亡細胞核呈紅色改變。對照組的細胞凋亡率為(4.05±0.29)%。實驗組針道炭化區、熱凝固區和消融邊界區術后各時間點腫瘤細胞凋亡率比較，差異均有統計學意義(F=37.539、74.942、151.697，P均<0.05)，3個區帶各時間點細胞凋亡率兩兩比較，差異均有統計學意義(P均<0.05)。實驗組術后各時間點不同區帶的細胞凋亡率差異均有統計學意義(F=112.463、26.838、23.777、48.751、19.299、51.794，P均<0.05)，術后各時間點3個區帶間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。各區帶細胞凋亡率均在術后1天達高峰，后呈下降趨勢。術后即刻到術后2周細胞凋亡率由針道炭化區、熱凝固區至消融邊界區呈上升趨勢，而第3周有所下降。實驗組各時間點的不同區帶細胞凋亡率與對照組兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05；表2、圖2)。

3 討論

本研究通過對RFA后不同區帶、不同時間窗腫瘤的病理檢查發現：針道炭化區及熱凝固區雖存在少量腫瘤細胞結構，但該類細胞多散在，不呈癌巢狀，且3周內腫瘤細胞形態幾乎無變化，可據此鑒別殘癌組織。由于RFA治療中是高溫瞬間凝固作用，病灶內部分腫瘤細胞形態被固定，雖然已經失活，但細胞的形態結構保存完好，與活體組織非常相似，被稱之為鬼影細胞[5]，HE染色下與活體細胞難以正確區分。本組中針道炭化區可見少量的類似腫瘤細胞，實驗組在2周內均可見腫瘤細胞形態，考慮為鬼影細胞，易誤認為消融治療不徹底，消融病灶仍存在殘癌[6]。有研究[7]通過尼可酰胺腺嘌呤核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)組織化學染色法區分鬼影細胞，發現由于殘癌組織中NADH含量高，顯色呈藍紫色，而鬼影細胞中無NADH，不顯色，可以據此鑒別。本研究通過觀察針道炭化區及熱凝固區細胞變化，認為可通過細胞分布的區帶判斷消融后組織為腫瘤細胞或鬼影細胞。

VEGF是由腫瘤細胞產生并分泌的一種二聚體糖蛋白，是一種最重要的調節血管生成的細胞因子[8]。血管內皮細胞及成纖維細胞表面有VEGF受體，VEGF與其受體結合后，可增加微血管通透性，促進血管內皮細胞分裂及毛細血管出芽生長，誘導新生血管產生，且可降低腫瘤細胞的同質黏附性，上調BCL-2的表達，介導癌細胞增殖，抑制其凋亡，與腫瘤預后密切相關[9]。因此RFA治療肝癌后，VEGF蛋白表達可提示肝癌的復發及轉移率的高低。本實驗針道炭化區及熱凝固區VEGF術后即刻達高峰，1天～2周呈下降趨勢，術后2周和3周略有上升，提示RFA后可短期抑制針道炭化區及熱凝固區的腫瘤血管生成，但隨著時間推移腫瘤可恢復血供；而術后消融邊界區的VEGF處于高表達，可能與RFA后引起局部組織缺氧，誘導VEGF轉錄有關[10]；1周后由針道炭化區至邊界區VEGF呈上升趨勢，可能因RFA范圍有限及熱沉降效應，消融邊界區的溫度較針道區和壞死凝固區降低，低溫亦可使VEGF表達上升，增加腫瘤轉移概率。

細胞凋亡是在體內、外一些因素的作用下，觸發細胞死亡程序而導致細胞主動死亡的一種方式，是細胞損傷的結果。研究[11]表明，Fas、Bax及P53等基因可以促進凋亡作用，BCL-2和BCL-XL等基因可以抑制細胞凋亡發生。本研究結果表明，在RFA術后不同時間由針道炭化區至消融邊界區腫瘤細胞凋亡率與對照組比較均呈上升趨勢，針道炭化區出現大量凝固性壞死，消融邊界區則以腫瘤細胞凋亡為主，提示射頻消融中心溫度高，直接殺滅腫瘤細胞主要為細胞壞死，向外隨著熱效益衰減，而表現為以凋亡為主；術后即刻到術后2周細胞凋亡率由針道炭化區、熱凝固區至消融邊界區呈上升趨勢，術后1天各區帶處于凋亡高峰，可能與RFA引起的漸進性損傷有關[12]，術后三個區帶均比對照組凋亡率上升，說明RFA可促進細胞凋亡。但術后第3周消融邊界區凋亡率接近對照組，隨著時間推移，RFA由內向外，凋亡率逐漸下降，提示腫瘤細胞漸進性損傷作用隨著時間推移減退，這也成為腫瘤復發的基礎。

總之，本實驗通過對兔VX2肝移植瘤在RFA后不同區帶和不同時間段腫瘤組織的病理學改變、VEGF表達和腫瘤細胞凋亡的分析，發現RFA后腫瘤組織不同區帶、不同時間的損傷情況及變化規律，可為進一步完善肝癌RFA的科學決策[13]、減少腫瘤轉移和復發、提高RFA效果提供科學依據。

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ExpressionofVEGFandapoptosisoftumorcellsindifferentregionsofVX2tumorinrabbitliverafterradiofrequencyablation

LIUYa,LYUWeifu*,ZHUXianhai,SHIChanggao,WANGYaguang,LIUKaicai,CHENGDelei,ZHOUChunze,LUDong

(DepartmentofRadiology,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

ObjectiveTo explore the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and apoptosis of the tumor cells in the different regions of rabbit liver VX2 tumor after radiofrequency ablation (RFA).MethodsForty-eight experimental rabbits were implanted with VX2 tumor. After successfully established the model, the rabbits were randomly divided into control group (n=6) and RFA group (n=42). In the RFA group, 7 rabbits at each time point were killed at immediately, 1 day, 2 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks after RFA, and the tumor specimens were retained and performed with HE staining, VEGF, Annexin V-FITC/PI labeling, flow cytometry analysis. The changes of VEGF and apoptosis of the cells in different periods and different zones after RFA were observed.ResultsAfter the operation, the difference of the VEGF value of the needle zone, coagulation necrotic zone and junction zone had statistically significant (allP<0.05). The difference of the VEGF value in each zone between immediately and the other time points after operation by pairwise comparisons were significantly different (allP<0.05). The VEGF value of the needle zone and coagulation necrotic zone reached the peak after operation immediately, which declined from 1 day to 3 weeks after operative. And VEGF of the junction zone increased from immediately to 1 week after operation, and declined 2 weeks after operation. There were significant differences in the apoptosis rate of the three zones after RFA compared with control group (allP<0.05). The apoptosis rate in all zones were at the peak on the 1 day after operation, and then showed a downward trend.ConclusionThe reduction of VEGF and apoptosis of tumor cells in the needle zone and coagulation necrotic zone are significant, but tumor remnant remains visible in the junction zone. In the third week after RFA, the proliferation of the remaining tumor cells can be recurrent to preoperative levels, which suggests that the further treatment should be performed at this period.

Rabbits; Liver; VX2 tumor; Radiofrequeney ablation; Vascular endothelial growth factor; Apoptosis

國家衛計委醫學科研專項項目(w2015xr13)、安徽省科技攻關項目(1704a0802152)。

劉亞(1982—)，女，安徽合肥人，在讀碩士。研究方向：介入放射學。E-mail: xiniuniu0615@126.com

呂維富，安徽醫科大學附屬省立醫院影像科，230001。E-mail: lwf99@126.com

2017-01-24 [

] 2017-06-01

10.13929/j.1672-8475.201701038

R735.7; R-332

A

1672-8475(2017)09-0561-05