曲霉菌半乳甘露聚糖抗原提取工藝優化

劉春龍

摘 要：近年來，隨著科技的發展，廣譜抗生素及免疫抑制劑在臨床被廣泛使用，免疫缺陷患者、癌癥患者、器官移植患者及血液病患者等感染侵襲性真菌病概率急劇升高。真菌病感染如果不能早期治療，死亡率極高。其中，曲霉特別是煙曲霉（Aspergillus fumigatus）已經逐漸成為臨床上一種重要的致病真菌。目前傳統的侵襲性曲霉菌感染檢測的金標準是無菌體液培養和組織活檢。但傳統的分離培養的方法陽性率低、周期長，極大的貽誤病情，因此，檢測煙曲霉抗原是目前臨床公認的快速早期診斷煙曲霉菌感染的有效方法。煙曲霉菌的主要抗原成分是半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM），所以血清中GM抗原檢測是一種快速、高效、特異性的早期診斷曲霉菌感染的方式。目前國內對曲霉菌半乳甘露聚糖提取純化的研究不多，本次研究以煙曲霉的菌體為原料，研究了GM抗原的提取工藝及后期純化的方式。通過液氮研磨、超聲等方式對曲霉菌半乳甘露聚糖進行提取，獲得粗提物后用無水乙醇以及水肼和亞硝酸處理。并將上述處理得到的溶液用MonoQ層析柱及超濾技術進行抗原純化，最終獲得了GM抗原純品。通過紫外分光光度及液相色譜等技術對提取的抗原進行驗證，發現通過優化曲霉菌半乳甘露聚糖提取工藝制備得到的半乳甘露聚糖抗體的得率較高且純度較好。

關鍵詞：曲霉菌；半乳甘露聚糖；侵襲性真菌??；優化工藝；生物活性

中圖分類號：R44 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）27-0052-02

常見的真菌比細菌大幾倍甚至幾十倍，因此結構也比細菌要復雜得多。真菌與細菌相比，細胞壁較厚，約占干重的30%以上，但真菌細胞壁缺乏黏肽，而是由結構不同的多糖如甘露糖、葡聚糖、脫乙酰殼多糖及幾丁質等組成，部分還含有蛋白質及類脂體成分[1]。

GM抗原廣泛存在于曲霉菌屬的菌絲及孢子中，在部分植物中也會存在這種成分，比如大豆，GM抗原干粉的外觀為白色、粉末狀，在酸、鹽環境下有極好的耐受性，比較耐熱，在水中溶解度非常大，可形成透明溶液，GM抗原是一種以甘露聚糖為主鏈，以呋喃半乳糖為側鏈的多糖。

根據不同的GM抗原中甘露聚糖與呋喃半乳糖的比例不同，從不同植物或真菌提取的抗原有很多不同的應用[2]。提取自豆類等植物中的半乳甘露聚糖具有很低的熱量，常被用于食品行業生產中作為黏稠劑和穩定劑使用，而且半乳甘露聚糖還具有很多生理功能，廣泛應用于醫藥和美容中。在煙曲霉整個生產周期中，GM抗原最早在穩定期出現，從菌絲端進行釋放，GM抗原也是最早釋放的曲霉菌的抗原，而GM抗原也是煙曲霉菌細胞壁獨有的組成部分，它還是一種致病性抗原，常作為臨床檢測和診斷的標志物[3]。

鑒于煙曲霉主要細胞壁成分為半乳甘露聚糖，其他種類的多糖量很少，因此考慮通過液氮及超聲波處理提高煙曲霉粗提物的得率。在利用超濾技術可有效去除溶液體系中特定分子量以下的高分子有機物[4]。對煙曲霉抗原粗提物進行純化，從而獲得了純度在93%以上的半乳甘露聚糖抗原。本方法原理簡單，操作時間短，條件易掌控，便于批量生產，非常有利于作為抗體生產過程的免疫原制備。

1 材料與方法

1.1 材料

本論文所采用的煙曲霉菌株購買自中國醫學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙曲霉菌活化及培養

配制沙氏液體培養基及配制沙氏固體培養基：之后將液體培養基趁熱倒入干燥無菌的培養皿中，每個培養皿倒15ml；在室溫下，生物安全柜中融化-20℃保存的菌液，每塊培養皿涂50μL，涂2塊，用封口膜封好，30℃培養2-3天。

待平板上菌體長大變綠之前，在平板上劃線轉接，用封口膜封好，30℃培養2-3天；待平板上菌體長大變綠之前，將長有新生菌絲的培養基取小塊，倒置轉接到6個平板上，30℃培養2-3天[5]。

1.2.2 半乳甘露聚糖粗提物提取

從曲霉菌平板上取帶有新生菌絲的小塊培養基，轉接在沙氏液體培養基上培養5-7天； 在沙氏液體培養基中加入甲醛溶液，使甲醛終濃度為3.7%，于4℃放置24小時滅活菌體；后用滅菌紗布過濾，用預冷的生理鹽水重懸菌體后，反復洗滌6-10次；在離心后的沉淀物中加入液氮，用滅菌的研缽研磨破碎5次，加水（20倍），冰浴下使用探頭式超聲破碎儀，破碎30min，破碎液在-20℃冰箱中保存。

1.2.3 半乳甘露聚糖濃度的測定[3]

（1）配制5%苯酚溶液：量取一定量苯酚（AR），并對它進行高溫蒸餾，在180℃進行收集餾分，再稱取上述液體50g，用水溶解，最后定容于1000ml棕色容量瓶中，冷卻避光保存。（2）配制葡萄糖標準液（200mg/L）：精稱110℃恒重的葡萄糖20mg，用水溶解，定容至100ml；再精密吸取2.0，4.0，8.0，10.0ml分別置于100ml量瓶中加水定容至刻度，搖勻即得葡萄糖稀釋液。（3）樣品的測定：加入2mL上述葡萄糖稀釋液，加至25ml比色管中，加入1mL配制好的苯酚溶液，并立即加入5.0ml濃硫酸，充分搖勻，并在常溫放置30min，各樣品分別做兩組平行。（4）標準曲線的制備：以上述2.0ml水的空白溶液做對照組，用紫外分光光度計在490nm波長處測定各樣品吸光度，以標準液的濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出葡萄糖標準品的標準曲線。

1.2.4 半乳甘露聚糖純化

將所得粗提物轉移至潔凈燒杯中，按照體積比加入4倍體積無水乙醇。并放置在4℃冰箱進行過夜純沉。對純沉物進行收集，并溶于去離子水中。按照體積比加入4倍體積無水乙醇，靜置1小時。對沉淀物再次進行收集，沉淀物用無水乙醇洗滌三次。離心并棄去上清。將所得沉淀物用去離子水溶解，并將活性炭加入到上述溶液中，用磁力攪拌器進行混勻3h。endprint

室溫抽濾，除去活性炭顆粒。所得溶液經過0.22μm濾膜進行過濾。濾液轉移至10KD離心超濾管，5000g離心10分鐘。即得到半乳甘露聚糖純品。

2 結果分析

半乳甘露聚糖提取實驗影響因素分析。

（1）半乳甘露聚糖標準曲線。實驗結果如圖1，其線性回歸方程為Y=0.0577X-0.1506，R2=0.9961。

圖1 葡聚糖標準曲線

（2）用Dubois-硫酸苯酚法對本發明的制備方法得到的半乳甘露聚糖抗原純化樣品進行多糖含量測定，結果從5g煙曲霉菌體最終可得到150mg 半乳甘露聚糖抗原純品。

（3）對本論文的制備方法得到的GM抗原純化樣品進行紫外吸收檢測。分別在UV260納米、UV280納米、UV320納米波長下檢測樣本，檢測結果抗原濃度為1.35mg/mL含量占比93.18%，蛋白質濃度為87.64μg/mL含量占比為6.49%，DNA含量占比為0.33%?？梢娍乖兌容^高，能夠達到93%以上。

對本論文的制備方法得到的GM抗原純化樣品進行HPLC檢測。檢測器為示差折光檢測器，樣品出峰單一，尖窄，并無明顯雜峰出現，說明所含物質大小均一，純度較高。

3 結束語

GM抗原是侵襲性曲霉菌感染診斷標準中重要的微生物學依據，對實現侵襲性曲霉菌感染的早期診斷，給臨床提供輔助依據，同時動態監測血清水平GM變化有助于判斷抗真菌治療的效果?？梢?，擁有一套完整且高效提取半乳甘露聚糖抗原的工藝流程是廣泛生產并應用ELISA檢測試劑盒的關鍵，同時，半乳甘露聚糖具有生物活性，是醫學上IFD體外診斷試劑開發的優質實驗材料。

本實驗通過對傳統曲霉菌半乳甘露聚糖提取工藝流程優化改進，使半乳甘露聚糖的提取效率更加高效，增加生產的優勢；用時短，易取材，操作簡便。用該方法純化的煙曲霉半乳甘露聚糖抗原能達到較高純度。因此，這套工藝可用于血清半乳甘露聚糖檢測試劑盒的研發、生產和應用。

參考文獻：

[1]王麗.煙曲霉基因組與致病機制[J].中國真菌學雜志，2011，6（1）：1-2.

[2]廖萬青.深部真菌感染主要病原菌的致病機理研究進展[A].2005全國首屆深部真菌感染學術會議論文集[C].2005.

[3]徐杰偉，李啟欣，何艷嫦.檢測患者血清半乳甘露聚糖用于曲霉菌感染診斷的應用評價[J].檢驗與臨床，2012，50（20）：74-75.

[4]車小燕，等.1組曲霉單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國真菌學雜志.2008，3（3）：129-133.

[5]DIRK STYNEN，等.INFECION AND IMMUNITY.1992，60（6）：2237-2245.endprint