微生物代謝路徑的優化與調控

陳修來，高 聰，劉 佳，羅秋玲，劉立明

(1．江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2．江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;3．江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

微生物代謝路徑的優化與調控

陳修來1，2，3，高 聰1，2，3，劉 佳1，2，3，羅秋玲1，2，3，劉立明1，2，3

(1．江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2．江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;3．江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

代謝路徑平衡對化學品、藥品和生物燃料的生產具有重要的作用。為了滿足工業化生產的需求，維持代謝路徑最優平衡是實現代謝流高效化導向目標代謝產物的必要手段。從DNA、RNA、蛋白質和代謝物四個水平，分析歸納了微生物代謝路徑的優化與調控策略，并展望了代謝路徑平衡進一步精深調控的發展方向。

代謝路徑;路徑優化;代謝工程;合成生物學

隨著石油資源的日益枯竭，以石油為基礎的化工產業面臨嚴重的挑戰。微生物發酵法能夠以廉價可再生碳源為底物生產多種化學品，具有可持續、綠色環保等優點。因此，微生物發酵法成為替代傳統石油化工方法的重要技術手段［1-2］。目前，微生物發酵法已經用于多種同源及異源代謝產物的生產［3］，包括：生物柴油、大宗化學品、精細化學品、藥物和營養品等，有效地實現了高產量、高得率和高生產強度的目標。

代謝工程通過對底盤微生物進行遺傳改造，重新配置細胞的生化代謝網絡，構建高效的細胞工廠，將可再生原料轉化為高附加值化合物。目前，代謝工程已經成功應用于多種生物基產品的工業化生產，如：青蒿素［4］和 1，4-丁二醇［5］等。然而，通過操縱內源基因和引入異源途徑改造微生物固有代謝網絡，通常會導致代謝途徑通量不平衡，引起中間代謝物過量積累，從而抑制胞內代謝活動，降低菌體生理活性和發酵性能［6］。Wu等［7］在代謝工程改造大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)生產白藜蘆醇的過程中，通過胞內表達源于黏紅酵母(Rhodotorul glutinis)的酪氨酸解氨酶(TAL)、香芹(Petroselinum crispum)的4-香豆酰輔酶 A連接酶(Pc4CL)、車軸草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的丙二酸酯合成酶(MatB)/丙二酸載體蛋白(MatC)和葡萄(Vitis vinifera)的芪合酶(STS)，白藜蘆醇的產量僅僅達到3．03 mg/L，主要原因在于中間代謝物香豆酰輔酶A的過量積累對菌株具有毒性［8］。為了有效降低香豆酰輔酶A的毒性，進一步提高白藜蘆醇的產量，可以將白藜蘆醇合成途徑分成3個模塊，并精細化調控3個模塊中基因表達水平，有效地實現了代謝途徑平衡，最終使得白藜蘆醇產量達到35．02 mg/L［7］。

因此，解決代謝失衡問題，可以有效改善微生物細胞生長狀況、代謝物產量及產率。其中，找到最佳途徑平衡點是微生物代謝工程改造過程中的最重要一步?；诖?，本綜述中，筆者從 DNA、RNA、蛋白質和代謝物四個水平 (圖1)詳細論述代謝路徑優化與調控相關的現代生物技術，并展望代謝路徑平衡進一步精深調控的發展方向。

圖1 微生物代謝路徑的優化策略Fig.1 Strategies for optimization of microbial metabolic pathways

1 基于DNA水平的代謝路徑優化

啟動子工程，借助基因表達元件，調節路徑酶的差異表達，實現代謝流平衡，從而提高細胞工廠的生產效率。啟動子工程常用的路徑優化控制策略：1)構建啟動子文庫［9］。借助iGEM、PlantCARE等在線分析工具，設計不同強度的合成啟動子，優化代謝路徑關鍵基因轉錄起始效率。該方法已經成功用于雙乙酰(圖 2)的生產［10］。2) 替換啟動子［11］。利用iGEM、CellML等軟件，選擇合適強度的啟動子替換合成路徑中限速酶的自身啟動子，提高代謝路徑限速酶的表達效率。該方法已經成功用于L-精氨酸［11］和2，3-丁二醇(圖2)［12］的生產。3)調控核糖體結合位點(RBS) 強 度［13］。 利 用 RBS Calculator［14］、RBS Designer［15］等預測軟件，設計具有不同翻譯起始速率的RBS，精確控制代謝路徑基因的翻譯效率。該方法已經成功用于蝦青素［13］和脂肪酸［16］的生產。4) 合成間隔區［17］。通過構建mRNA二級結構突變庫，借助GeneSplicer和SplicePort等在線工具，預測和改變RNA酶切割位點，實現多基因路徑間隔區的組合優化。該方法已經成功用于甲羥戊酸的生產［17］。

圖2 微生物雙乙酰和2，3-丁二醇的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways for diacetyl and 2，3-butanediol production

2 基于RNA水平的代謝路徑優化

在正常條件下，RNA分子可以自組裝成具有不同生理功能的多種二級結構，因此，RNA分子結構被廣泛應用于合成生物學的研究領域。其中，典型應用是利用合成RNA開關調控微生物碳代謝流，實現目標代謝物過量積累。合成RNA開關常用的路徑優化控制策略：1)核酶開關［18］。通過適配子序列構成細胞敏感器(感應區)，并借助核酶序列控制胞內代謝物的時空波動(執行區)，實現目標基因理性控制和代謝物積累量的提高。該方法已經成功用于黃嘌呤的生產［18］。2) 核糖開關［19］。由一類順式編碼調控 RNA組成，如：腺苷鈷胺素(AdoCbl)、黃素單核苷酸(FMN)、S-腺苷甲硫氨酸和甘氨酸核糖開關等，通過誘導目的基因轉錄終止或者抑制轉錄起始來實現對基因表達的調控。該方法已經成功用于維生素B12的生產［20］。3)反義RNA開關［21］。主要由兩部分組成，包括：識別特定mRNA的結合區域和招募輔助蛋白的支架區域，通過控制mRNA降解速率，反義RNA開關可以針對多個基因的表達進行多尺度調控。該方法已經成功用于尸胺(圖 3)的生產［21］。

圖3 微生物尸胺的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways for cadaverine production

3 基于蛋白質水平的代謝路徑優化

蛋白質工程是合成生物學的重要組成部分，通過對酶的性質和酶的組件進行重新設計，可以獲得人們所需要的代謝物高效合成路徑［22］。蛋白質工程常用的路徑優化控制策略：1)提高酶的活性。傳統蛋白質表達量的改善方法，易形成包涵體，且容易增加菌體代謝負荷?，F代的方法，通過采用易錯PCR、點突變和交叉延伸技術，改變底物結合口袋和修飾蛋白質編碼序列，從而實現酶活力的提高［23-24］。該方法已經成功用于聚羥基脂肪酸酯［25］和左旋海松二烯［23］等化合物的生產。2)改變底物和產物的特異性。由于天然酶催化底物譜較窄，難以合成許多非天然化合物［24］。另外，某些底物特異性不高的天然酶在催化反應中容易催化底物類似物生成副產物，降低產品純度。因此，為了解決這些問題，針對酶的活性位點和結合口袋采取易錯PCR、定點突變和DNA改組等方式，可以有效地調整酶底物特異性，實現路徑催化效率的提高［26］。該方法已經成功用于L-高丙氨酸［22］和3-脫氫莽草酸(圖4)［27］等化合物的生產。3)修飾調控元件。在代謝物生產過程中，當代謝物濃度達到一定閾值時，代謝路徑就會啟動負反饋調控。因此，為了解決反饋抑制，通過對轉錄調控蛋白采取化學突變、DNA改組及定點飽和突變等方式，可以降低負反饋調節，提高路徑催化效率［28］。該方法已經成功用于氨基葡萄糖［29］和 L-苯丙氨酸(圖 4)［30］等化合物的生產。

4 基于代謝物水平的代謝路徑優化

在正常狀態下，微生物體內的代謝路徑能夠為細胞生長提供適量的構架化合物。然而，合成生物學是將異源代謝路徑引入到微生物中，該路徑超出了微生物自我調控的范圍，容易引起代謝負荷和代謝不平衡［31］。為了解決此問題，可以通過合成生物學的相關技術策略，系統性地優化代謝路徑，從而為實現細胞代謝網絡與代謝物合成的平衡奠定基礎［32］。常用的路徑優化控制策略包括：結構生物學、區間工程和模塊路徑工程等。

4.1 結構生物學

在代謝工程改造的過程中，一方面，代謝中間產物的過量積累會對宿主細胞產生毒性;另一方面，中間代謝物會被競爭途徑消耗，從而降低產物合成效率。為解決這些問題，支架技術作為一種新興的路徑優化策略，能夠在空間上縮短路徑酶的底物傳輸距離，構建多酶復合結構。支架技術常用的路徑優化控制策略：1)DNA支架技術［33］。借助鋅指DNA結合域，特定的DNA序列能夠與特異性的蛋白質結構相結合?；诖?，通過設定特定的DNA序列，能夠將路徑酶按照不同的順序、比例及空間位置排布在DNA鏈上，以此增加路徑酶的催化底物濃度，提高路徑催化效率。該方法已經成功用于1，2-丙二醇等化合物的生產［33］。2)RNA 支架技術［34］。利用RNA元件的適配體區域與路徑酶的結合作用，將路徑酶組裝成多維的空間結構，從而提高路徑催化效率。該方法已經成功用于氫氣(H2)的生產［34］。3) 蛋白質支架技術［35］。借助蛋白質的相互作用原理，蛋白質的互作區域能夠與特異性蛋白質相結合。通過將該相互作用區域定位于支架蛋白上，以此招募并結合特定的路徑酶，從而縮短路徑酶的實際催化距離，提高路徑催化效率。該方法已經成功用于丁酸(圖 5)［36］和 D-葡萄糖二酸［37］等化合物的生產。

圖4 微生物3-脫氫莽草酸和L-苯丙氨酸的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways for 3-dehydroshikimic acid and L-phenylalanine production

圖5 微生物丁酸的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways forbutyrate production

4.2 區間工程

區間工程通過區域化產物合成路徑與胞內自身代謝路徑，從而使二者彼此間的交互影響達到最小化。區間工程將路徑酶反應從無限制的胞質環境轉換到具有膜結構的細胞器中，有效地降低了底物擴散效應和酶催化的空間距離，提升了細胞工廠合成目標化學品的能力［38］。區間工程常用的路徑優化控制策略：1)線粒體工程［39-41］。線粒體中載有許多中心代謝途徑，如：檸檬酸循環、氨基酸合成和脂肪酸代謝等，而這些代謝路徑能夠為化學品的生物合成提供廣泛的前體譜。在狹小封閉的線粒體中進行催化反應合成化學品，將會進一步提高底物濃度，改善催化反應的速率和產品的生產強度。該方法已經成功用于異丁醇(圖6)［39］和富馬酸［42］等化合物的生產。2) 過氧化物酶體工程［43］。過氧化物酶體是由一層單位膜包裹的囊泡，內含豐富的酶類，如：氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶，不屬于內膜系統的膜結合細胞器。另外，過氧化物酶體區別于其他細胞器的特點在于清空這些膜內蛋白，不會影響菌體自身代謝，而這種密閉的微環境也為合成路徑的區間化提供了可能。該方法已經成功用于紫色桿菌素［43］和烷烴［44］等化合物的生產。3)羧酶體工程［45］。羧酶體由以蛋白質為主的單層膜包圍，內含固定CO2所需的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶和碳酸酐酶，是藍藻細菌和硫桿菌等自養微生物固定CO2的主要場所。因此，羧酶體適合進行涉及CO2固定的生物合成路徑。該方法已經成功用于異丁醛(圖6)［46］等化合物的生產。

圖6 微生物異丁醇和異丁醛的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways forisobutanol and isobutyraldehyde production

4.3 模塊路徑工程

針對涉及多條路徑的代謝優化，通常采用單條路徑逐一代謝工程優化的方式實現代謝流的平衡。但是，該方法往往需要經歷多輪的菌株構建、篩選和優化過程，時間和經濟成本較高，不利于進行大規模的優化操作。為了解決上述問題，路徑模塊化這一概念應運而生，即采用人為劃分的方式，將多條路徑劃分為幾個小的路徑模塊，并在轉錄(如啟動子、基因拷貝數)、翻譯(如RBS強度)或蛋白(如蛋白質工程)等水平上，調整途徑模塊催化特性，在不需要高通量篩選的條件下，實現多條代謝途徑的綜合優化［47-48］。根據實際的操作方式，模塊路徑工程常用的路徑優化控制策略：1)基于生化反應代謝物特點的模塊化［49］。以路徑中間代謝物濃度、特性等生化指標作為模塊劃分依據，通過優化不同模塊的表達強度，降低中間代謝物的積累，避免對菌體產生毒害作用和負反饋調節。該方法已經成功用于紫杉醇等化合物的生產［49］。2)基于代謝路徑分支節點的模塊化［6］。以分支代謝路徑和中心代謝路徑的代謝物交叉節點作為模塊劃分依據，通過優化不同模塊的碳流輸送強度，調控代謝流在路徑的實際分布情況，實現菌體生長和產品合成的最優協同。該方法已經成功用于(2S)-生松素(圖7)等化合物的生產［50］。3) 基于酶轉換數的模塊化［51］。針對路徑中酶催化效率的不同，以酶轉換數作為參考指標，將代謝路徑中的不同酶促反應劃分成不同模塊，通過優化不同模塊的催化效率，構建最適的底物傳輸通道，實現底物轉運效率和催化效率的提高。該方法已經成功用于黃酮類化合物(圖7)的生產［52］。

圖7 微生物(2S)-生松素和(2S)-柚皮素的代謝途徑Fig.7 Metabolic pathways for(2S)-pinocembrin and(2S)-naringenin production

5 結論與展望

針對微生物代謝路徑的優化與調控，國內外研究人員從四個方面開展了卓有成效的研究：在DNA水平(如，啟動子工程等);在 RNA水平(如，合成RNA開關);在蛋白質水平(如，蛋白質工程);在代謝物水平(如，結構生物學、區間工程、模塊路徑工程)。上述代謝工程新技術的應用，能夠從不同層次水平上對菌株及其代謝路徑進行系統的調節和優化，實現系統、簡約、高效調控代謝通路中通量平衡的目標。然而，路徑代謝反應速率同時受到多種因素擾動的影響，包括：路徑基因的表達水平、路徑酶的催化能力和中間代謝物的濃度等?，F有的代謝路徑優化策略，缺乏實時俘獲與控制細胞代謝狀態的能力，不能有效地維持代謝路徑穩態，從而影響目標代謝物的積累。因此，一方面，借助系統生物學的相關技術手段，如：基因組規模代謝網絡模型、基因組規模轉錄調控網絡模型、基因組規模蛋白質互作網絡模型以及全細胞模型等，從細胞整體水平上理解和把握微生物的生理、代謝和功能狀態，有助于實時識別代謝路徑優化過程中的關鍵因素。另一方面，利用精確代謝工程［53］與動態代謝工程［54］的相關策略，如：RNA敏感器(包括天然RNA敏感控制元件、合成的RNA敏感部件等)和蛋白質敏感器(包括轉錄激活敏感器、蛋白激活敏感器、熒光敏感器、細胞敏感器等)，設計可實時調控的微生物代謝系統，動態改造與調控基因的整體表達水平，實現代謝路徑的穩態調控。第三方面，基于高通量篩選技術，優化代謝路徑 DBTL循環［55］的速率，強化DBTL循環的操作效率，提高單輪DBTL循環所能構建菌株的通量。綜上所述，新技術的進一步發展與應用，必將進一步推進微生物細胞工廠的構建效率，提高目標化學品的生產能力，降低生物制造化學品的成本，為各種化合物的綠色生產奠定基礎。

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(責任編輯 荀志金)

Optimization and regulation of microbial metabolic pathways

CHEN Xiulai1，2，3，GAO Cong1，2，3，LIU Jia1，2，3，LUO Qiuling1，2，3，LIU Liming1，2，3
(1．State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2．Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;3．Laboratory of Food Microbial-Manufacturing Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Metabolic pathway balance plays an important role in producing chemicals，pharmaceuticals andbiofuels．To meet thedemand of industrial production，microbes should maintain a maximal carbon flux towards target metabolites withoutfluctuations in metabolic pathway．We reviewed the detailed strategies to optimize and regulate metabolic pathwaybalance at four levels，i．e．，DNA，RNA，protein and metabolite level．Furthermore，we indicated future research directions to further optimize and regulate metabolic pathway balance．

metabolic pathway;pathway optimization;metabolic engineering;synthetic biology

Q815

A

1672-3678(2017)05-0001-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．001

2017-06-07

江蘇省自然科學基金(BK20160163);中國博士后科學基金(2016M600362);江南大學自主科研計劃重點項目(JUSRP51611A);江南大學自主科研計劃青年基金(JUSRP116022)

陳修來(1985—)，男，山東莒縣人，副教授，研究方向：系統代謝工程與合成生物學;劉立明(聯系人)，教授，E-mail：mingll@jiangnan．edu．cn