黑荊樹皮原花色素對小鼠急性毒性研究

張倫,王飛，劉夏睿

(1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000； 2.南京林業大學化學工程學院，江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室，南京 210037)

黑荊樹皮原花色素對小鼠急性毒性研究

張倫1,2,王飛2*，劉夏睿2

(1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000； 2.南京林業大學化學工程學院，江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室，南京 210037)

為研究黑荊樹皮原花色素提取物的結構及安全性，對黑荊樹皮原花色素的結構類型、小鼠經口急性毒性以及對小鼠肝腎病理學組織影響進行了試驗。結果表明：黑荊樹皮中的原花色素主要以原刺槐定為主(約占70%)，并含有較少原菲瑟定(約占25%)，而且黑荊樹皮中的原花色素低聚物主要是由二、三聚體組成，單體幾乎沒有。黑荊樹皮原花色素提取物的小鼠經口半致死量(wLD50)為3.970 g/kg，95%平均可信限為3.074 ～4.674 g/kg。按照毒理學分級為低毒物質。將死亡小鼠進行解剖，臟器顏色正常，并沒發現有腫大、縮小或病變等癥狀。當一次性服用達一定劑量，10 d后組織病理切片顯示存活小鼠肝腎組織正常。研究表明，黑荊樹皮原花色素毒性不高，安全性好，對小鼠代謝的器官并不會造成病變和傷害。

黑荊樹皮；原花色素；急性毒性

黑荊樹(Acaciamearnssii)是含羞草科、金合歡屬植物，常綠喬木，原產澳大利亞。樹木生長快，樹高18 m，是世界著名的栲膠原料，單寧質量分數高，為48.82%，純度81.9%，是珍貴的鞣料樹種之一[1]。木材堅硬致密，是良好的木器、礦柱、造紙用材，黑荊樹皮在民間還用來做止血劑和收斂劑。原花色素(proanthocyanidins，PAs)又稱為濃縮型單寧，由于其具有鞣革功能，故又稱為縮合單寧。它是一類天然的黃烷類單體及其聚合體的多酚類化合物，普遍存在于植物的根、莖、葉、花、果實中，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑[2]。20世紀80年代已有研究表明，黑荊樹皮中原花色素的組成比較復雜，以原刺槐定為主(約占70%)，此外還有原菲瑟定(25%)以及少量的原翠雀定[3]。Huang等[4]研究發現黑荊樹皮原花色素中的二聚體原刺槐定，刺槐亭醇-(4β→8)-棓兒茶素3-O-沒食子酸酯具有保護人體神經節細胞SH-SY5Y細胞抵抗丙烯醛誘發的氧化破壞作用。有學者對馬尾松、濕地松、火炬松、落葉松和黑荊樹等樹木的樹皮抗氧化劑提取進行對比，以黑荊樹樹皮作原料為最好，產品得率高，質量好[5]。樹皮中的單寧黑荊樹皮原花色素具有抑制真菌[6]、皮炎止癢[7]、美白防曬等作用[8]。在歐洲，黑荊樹皮原花色素被用來消除葡萄酒中的沉淀物[9]。此外，劉夏睿等[10]研究表明黑荊樹皮原花色素具有較高的抗腫瘤活性和一定的廣譜性。由于黑荊樹皮中含有豐富的低聚原花色素，而低聚原花色素由于每個分子中有多個鄰、間位酚羥基，因此具有較強的抗氧化能力。低聚原花色素加入食品中可以降低食品體系的含氧量，防止油脂氧化[11]。目前，對黑荊樹皮急性毒性的研究較少，為此，筆者對黑荊樹皮原花色素的結構進行分析，并對小鼠的急性毒性以及一次性給藥后存活小鼠肝腎病理學進行檢查，以期為黑荊樹皮原花色素的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 黑荊樹皮原花色素的提取

將樹皮在室溫下晾干，粉碎，過篩(0.25～0.60 mm)。以50%乙醇(質量分數)為溶劑，料液比為1∶11，采用超聲波輔助提取，超聲時間為30 min，超聲波功率為67 kHz，溫度為40℃。將提取液于旋轉蒸發儀上真空濃縮(0.1 MPa)，所得的濃縮液再用3倍體積的乙酸乙酯進行3次萃取。將乙酸乙酯層合并在40℃旋轉濃縮，在50℃干燥12 h，得到棕紅色黑荊樹皮乙酸乙酯原花色素。

1.2 原花色素結構成分分析

原花色素樣品采用HPLC-ESI-MS方法通過Agilent Technologies 1200 Series液相色譜儀、Agilent Technologies 6300 Ion Trap LC-MS液質聯用儀進行檢測，色譜柱選用安捷倫XDB-Phenyl(2.1 mm×150 mm，5 μm)。流動相為：超純水、甲醇、乙腈。洗脫液為20%的乙腈水溶液(體積比)；流速為0.2 mL/min，進樣體積為5 μL；檢測波長為280 nm。質譜采用離子源：ESI(-)；掃描范圍(m/z)：50～1 500；霧化氣壓力：241 kPa；霧化氣流速：9 L/min；霧化氣溫度：350℃。毛細管電壓：4 000 V；錐孔電壓：-40.0 V,毛細管出口電壓：-135 V。

1.3 試驗動物和儀器

ICR小鼠，由揚州大學比較醫學中心提供(許可證號：No.SCXK(蘇)2007-0001)，體質量18～22 g，70只，雌雄各半。全部動物引入觀察7 d后，投入試驗。RE52CS型旋轉蒸發器；FZ102型微型植物粉碎機；YD-335電腦切片機；生物顯微鏡BS-203。

1.4 試驗設計

將黑荊樹皮原花色素粉末用蒸餾水配成一定濃度的水溶液。試驗動物按0.1 mL/10 g用灌胃法在24 h內給藥，小鼠隨機分成5組，劑量分別為：0.825，1.650，3.300，6.600 g/kg，空白組用蒸餾水按0.2 mL/10 g代替。每天上午8：00—9：00稱質量并觀察給藥后10 d內小鼠的身體情況，并及時記錄，同時將每組死亡和存活鼠數進行統計以便計算半致死量(wLD50)。給藥后第11天頸部脫臼處死存活小鼠，解剖觀察體內臟器情況。

1.5 病理組織學檢查

試驗結束后，將小鼠肝、腎器官取出，生理鹽水沖洗掉表面的血污，經過10%中性甲醛固定、組織修切、石蠟包埋、常規切片、HE染色、酒精梯度褪色、透明、封片，光學顯微鏡觀察。

1.6 計算方法和數據處理

用改良寇氏法計算wLD50及95%平均可信限。wLD50=log-1[Xm-i(∑P-0.5)]，式中：Xm為最大死亡組劑量的對數；i為相鄰劑量組劑量比值的對數；∑P為各組死亡率總和。wLD50的95%平均可信限log-1(logwLD50±1.98Sx50)，式中：Sx50為logwLD50的標準誤差。

式中，n為每組動物數。

用SPSS 18.0分析軟件進行數據統計、分析、處理和顯著性t檢驗[12]。

2 結果與分析

2.1 原花色素的結構分析

黑荊樹皮中含有豐富的低聚原花色素，黑荊樹皮乙酸乙酯-水或丙酮-水為溶劑的原花色素抗氧化活性物質主要成分是低聚原花色素、蒽醌和三萜皂苷類物質[13]。本實驗中，黑荊樹皮乙酸乙酯提取物通過HPLC-ESI-MS的方法檢測，并采用歸一化法定量測定其中的含量，結果表明其中所含化合物主要為低聚原花色素。雖然黑荊樹皮中的單寧組成比較復雜，但其低聚原花色素主要以刺槐定為主(約占70%)，此外還有原菲瑟定(25%)以及少量的原翠雀定。黑荊樹皮乙酸乙酯原花色素中主要含有原刺槐定、原菲瑟定(圖1，2)。根據化合物的出峰時間和分子量以及前人研究結果對小鼠灌胃前的黑荊樹皮原料成分結構進行了推斷。其中原刺槐定中的化合物為：P1、P7(出峰時間分別為9.5和15.5 min)：ES-準分子離子[M-H]-m/z=881，刺槐亭醇-(4α→8)-棓兒茶素-(6→4α)-刺槐亭醇，刺槐亭醇-(4α→8)-棓兒茶素-(6→4β)-刺槐亭醇。P2、P3(出峰時間分別為9.9和10.7 min)：ES-準分子離子[M-H]-m/z=593，刺槐亭醇-(4α→8)-棓兒茶素。P4、P10(出峰時間為11.7，17.4，20.7，23.7 min)：ES-準分子離子[M-H]-m/z=865，刺槐亭醇-(4α→8)-兒茶素-(6→4α)-刺槐亭醇，刺槐亭醇-(4α→8)-兒茶素-(6→4β)-刺槐亭醇，刺槐亭醇-(4β→8)-兒茶素-(6→4β)-刺槐亭醇。P5、P6(出峰時間分別為12.4和13.6 min)：ES-準分子離子[M-H]-m/z=577，刺槐亭醇-(4β→8)-兒茶素，刺槐亭醇-(4α→8)-兒茶素。原菲瑟定中的化合物為：P8、P9(出峰時間分別為17.4和20.7 min)：ES-準分子離子[M-H]-m/z=561，菲瑟亭醇-(4α→8)-兒茶素，菲瑟亭醇-(4β→8)-兒茶素。P11(出峰時間為41.4 min)：ES-準分子離子[M-H]-m/z=849，菲瑟亭醇-(4α→8)-兒茶素-(6→4β)-兒茶素。

圖1 黑荊樹皮原花色素總離子流圖及液相色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram and HPLC spectra of proanthocyanidins from black wattle bark

圖2 黑荊樹皮原花色素ESI-MS圖譜Fig.2 The ESI-MS spectra of proanthocyanidins from black wattle bark

結果顯示，原料內主要原花色素以原刺槐定為主，其余為原菲瑟定，原菲瑟定含量較少。而且黑荊樹皮中的原花色素低聚物主要是由二、三聚體組成，單體幾乎沒有，其分子結構如圖3所示，與前人研究結果一致[3]。

圖3 黑荊樹皮原花色素分子結構圖Fig.3 Chemical structure of proanthocyanidins from black wattle bark

2.2 小鼠黑荊樹皮原花色素經口急性毒性試驗

急性毒性試驗是藥物毒理學安全性評價的第一步，具有了解受試物急性毒性強弱的作用。其內容包括主要觀察動物中毒表現，其一般行為、外觀改變、大體形態改變及死亡效應、致死的和非致死的指標參數，以提供受試物質的急性毒性資料，以確定毒作用方式、中毒反應，并為其他蓄積毒性、亞急性和慢性毒性試驗的觀察及劑量分組提供參考，致死劑量通常用wLD50來表示。黑荊樹皮原花色素提取物對小鼠進行灌胃后，0.825 g/kg給藥劑量小鼠全部存活，毛色光滑，精神狀態良好，與對照組相當。6.600 g/kg劑量給藥小鼠24 h后，64%的小鼠死亡，其余小鼠48 h后全部死亡，該劑量小鼠出現腹瀉、胃部脹氣、腹式呼吸、毛豎起、呆滯、對刺激反應較明顯、步態不穩、叫聲異常、行動姿態緩慢、不再納食等癥狀。而3.300 g/kg劑量給藥小鼠灌胃后24 h沒有出現死亡，48 h后所有灌胃小鼠中的23%出現死亡，72 h后所有灌胃小鼠中的30%出現死亡，死亡小鼠均為雌性小鼠，雄性小鼠全部存活。該劑量小鼠在灌胃后仍然納食，大便呈藏青色，但是仍有個別體質較弱小鼠出現腹瀉現象。將死亡動物進行解剖，并沒發現其臟器有腫大或縮小，顏色正常，并未出現病變等癥狀。觀察10 d后，試驗動物死亡數統計見表1。采用改良寇氏法計算出wLD50為3 970 mg/kg。wLD50的95%平均可信限為3 074～4 674 mg/kg。根據我國衛生部的食品毒理學檢驗方法《保健食品檢驗與評價技術規范》可知，黑荊樹皮原花色素屬于低毒物質。

表1 黑荊樹皮原花色素對小鼠急性毒性Table 1 Acute toxicity of proanthocyanidins from black wattle bark in mice

2.3 不同劑量對小鼠生長情況的影響

一次性灌胃后，存活小鼠10 d的生長情況有所不同。一次性的大劑量灌胃，對小鼠身體有顯著的影響，但是劑量較低的小鼠身體狀況迅速恢復，精神狀態也大有改善；高劑量小鼠恢復需要的時間則更長。10 d內小鼠的質量變化情況見表2。將小鼠灌胃后每組的初始質量與最終質量進行對比發現,其空白組和低劑量組質量增長較為明顯。高劑量組、中劑量組末次質量與對照組小鼠相比差異顯著(P<0.05)。

表2 黑荊樹皮原花色素對小鼠生長情況的影響Table 2 Effect of proanthocyanidins from black wattle bark on mouse body weights (g)

注：“*”表示0.05水平差異顯著。

2.4 病理學檢查

由于原花色素主要是通過胃、腸道吸收進入血液，與白蛋白結合運轉[14]，腸道、肝與腎臟是其重要的代謝場所[15]。采用HE染色制作標本，HE染色后切片可充分顯示肝細胞結構、腎小球的細胞增生、腎小管上皮細胞的損傷和腎間質水腫等情況。正常肝細胞以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀排列，形成單個細胞厚度的細胞板。肝細胞質呈嗜酸性，HE染色為紅色。腎細胞核呈紫藍色，細胞質、基底膜、膠原纖維、肌纖維呈粉紅色。正常的腎小球血管內皮細胞呈扁平梭形，細胞核位于毛細血管的系膜側，與系膜細胞相鄰，光鏡下為深染的小圓形。而腎小球血管上皮細胞染色質細膩，染色較淺。斷頭處死各組存活動物后，對小鼠進行尸體解剖。用肉眼觀察其臟器并未發現體積腫脹和明顯水腫、脂肪變性等異?，F象。對小鼠肝腎組織進行固定、脫水、石蠟包埋等處理后，做成切片，對小鼠急性毒性后的肝、腎臟器進行病理組織學檢查(圖4,5)。結果表明：空白組、黑荊樹皮0.825和1.650 g/kg劑量組小鼠肝細胞結構正常，無腫脹，肝細胞胞質中也未見空泡，匯管區無炎細胞浸潤、無纖維結締組織增生。但是3.300 g/kg劑量組小鼠肝臟均可見不同程度的肝細胞索排列紊亂，其胞漿有輕微空泡。

圖4 黑荊樹皮原花色素對小鼠肝組織病理形態學的影響Fig.4 Effects of proanthocyanidins of black wattle bark on pathological morphology of mouse liver tissue

圖5 黑荊樹皮原花色素對小鼠腎組織病理形態學的影響Fig.5 Effects of proanthocyanidins of black wattle bark on pathological morphology of mouse kidney tissue

各劑量組小鼠腎臟細胞結構清晰，腎小體分布正常、大小均勻，毛細血管結構清楚，無系膜細胞和內皮細胞的增生。近曲小管、遠曲小管和集合小管分布正常，上皮細胞結構清晰，無細胞變性和壞死，腎臟細胞間質正常，無明顯充血和水腫及炎癥反應。說明黑荊樹皮原花色素一次性較大劑量內服用，其在小鼠體內的代謝都仍然正常，對代謝的器官并不會造成病變和傷害。小鼠病理切片也進一步說明黑荊樹皮原花色素口服毒性不高，安全性好，安全的范圍較大。這為后續的蓄積毒性以及其他生理活性提供劑量的選擇和相關產品的開發利用提供了一定的科學依據。

3 結論與討論

上述研究表明，黑荊樹皮中的原花色素主要以原刺槐定為主(約占70%)，其余為原菲瑟定(約占25%)，原菲瑟定含量較少，且黑荊樹皮中的原花色素低聚物主要是由二、三聚體組成，單體幾乎沒有。黑荊樹皮原花色素提取物的小鼠經口wLD50為3.970 g/kg，wLD50的95%平均可信限為3.074～4.674 g/kg，按照毒理學分級為低毒物質，比毛楊梅樹皮原花色素的急性毒性(wLD50為5 g/kg)稍高[16]，而比葡萄籽原花青素小鼠口服wLD503.451 g/kg略低[17]。一次服用黑荊樹皮原花色素一定劑量，10 d后組織病理切片顯示存活小鼠的肝腎功能沒有受到任何影響，即短期劑量服用黑荊樹皮原花色素達3.300 g/(kg·d)，小鼠的體內代謝都仍然正常，對小鼠的代謝器官并不會造成病變。不同植物來源的原花色素由于其酚羥基位置不同而具有不同的性質，本研究探討了以刺槐定、原菲瑟定為主的黑荊樹皮原花色素急性毒性的影響，對今后不同酚羥基結構原花色素的毒理性研究具有重要意義。

[1]安鑫南.林產化學工藝學[M].北京:中國林業出版社,2002.

[2]石碧,狄瑩.植物多酚[M].北京:科學出版社,2000.

[3]孫達旺.植物單寧化學[M].北京:中國林業出版社,1992:372-373.

[4]HUANG W,NIU H,XUE X,et al.Robinetinidol-(4β→8)-epigallocatechin 3-O-gallate,a galloyl dimer prorobinetinidin fromAcaciamearnsiiDe Wild,effectively protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against acrolein-induced oxidative damage[J].Journal of Alzheimer’s Disease,2010,21(2)：493-506.

[5]宋金表,周維純,王金秋,等.松樹皮提取碧蘿芷天然抗氧劑的研究[J].林產化工通訊,2000,34(6):3-7.SONG J B,ZHOU W C,WANG J Q,et al.Study on the natural antioxidant of pycnogenol from pine bark[J].Journal of Chemical Industry of Forest Products,2000,34(6):3-7.

[6]OLAJUYIGBE O O,AFOLAYAN A J.Pharmacological assessment of the medicinal potential ofAcaciamearnsiiDe Wild.：antimicrobial and toxicity activities[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(4)：4255-4267.

[7]IKARASHI N,SATO W,TODA T,et al.Inhibitory effect of polyphenol-rich fraction from the bark ofAcaciamearnsiion itching associated with allergic dermatitis[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2012,2012:1-9.

[8]劉功駿,周蒙,葉鳳霞,等.黑荊樹皮原花色素的提取及美白防曬效果試驗[J].林業工程學報,2016,1(3):42-47.LIU G J,ZHOU M,YE F X,et al.Study on the whitening and sunscreen effects of proanthocyanidins fromAcaciamearnsiibark[J].Journal of Forestry Enigneering,2016,1(3):42-47.

[9]IKARASHI N,TODA T,OKANIWA T,et al.Anti-obesity and anti-diabetic effects of acacia polyphenol in obese diabetic KKAy mice fed high-fat diet[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2011,2011:1-10.

[10]劉夏睿,王飛.黑荊樹樹皮原花色素生物活性的研究[J].林產化學與工業,2007,27(3):43-48.LIU X R,WANG F.Investigation on biological activities of proanthocyanidins from black wattle bark[J].Chemistry and Industry of Forest Products,2007,27(3):43-48.

[11]HEIM K E,TAGLIAFERRO A R,BOBILYA D J.Flavonoid antioxidants：chemistry,metabolism and structure-activity relationships[J].The Journal of Nutritional Biochemistry,2002,13(10)：572-584.

[12]王蘇斌.SPSS統計分析[M].北京:機械工業出版社,2003.

[13]張加研,付惠,劉祥義.黑荊樹皮中抗氧化性物質化學成分研究初探[J].林產化工通訊,2004,38(2):14-16.ZHANG J Y,FU H,LIU X Y.A preliminary study on oxidation resistance of the bark extract fromAcaciaMearnsiiDe Wilde[J].Journal of Chemical Industry of Forest Products,2004,38(2):14-16.

[14]VAN HET HOF K H,KIVITS G A A,WESTSTRATE J A,et al.Bioavailability of catechins from tea：the effect of milk[J].European Journal of Clinical Nutrition,1998,52(5)：356-359.

[15]HOLLMAN P C,DE VRIES J H,VAN LEEUWEN S D,et al.Absorption of dietary quercetin glycosides and quercetin in healthy ileostomy volunteers[J].The American Journal of Clinical Nutrition,1995,62(6)：1276-1282.

[16]張倫,劉功駿,何柏球,等.毛楊梅樹皮原花色素對小鼠急性毒性及抗氧化性的影響[J].南京林業大學學報(自然科學版),2013,37(4):85-89.ZHANG L,LIU G J,HE B Q,et al.Acute toxicity of proanthocyanidins fromMyricaesculentaBuch.Ham.bark on mice and its antioxidative properties[J].Journal of Nanjing Forestry University(Natural Sciences Edition),2013,37(4):85-89.

[17]陳會叢,翟建英,張廣平,等.葡萄籽原花青素的毒理學研究[J].食品工業科技,2014,35(2):317-323.CHEN H C,ZHAI J Y,ZHANG G P,et al.Experimental studies on the toxic effect of grape seed proanthocyanidinextract[J].Science and Technology of Food Industry,2014,35(2):317-323.

Acute toxicity of proanthocyanidins from black wattle bark in mice

ZHANG Lun1,2,WANG Fei2*,LIU Xiarui2

(1.College of Chemistry and Life Science,Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,Yunnan,China;2.College of Chemical Engineering,Jiangsu Key Lab.of Biomass-Based Green Fuels and Chemicals,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

In this paper,the chemical structure and the toxicity of proanthocyanidins extractive from black wattle bark were investigated.The structural type of proanthocyanidins from black wattle(Acaciamearnssii) bark,acute oral toxicity of the extract,and effects of the extract on pathological morphology in mice liver and kidney tissue were studied.The results showed that the proanthocyanidins are mainly composed of prorobinetinidins (about 70%) and profisetindins (about 25%).The proanthocyanidins oligomers are mainly composed of dimers and trimers,and monomers can barely be found.ThewLD50value of proanthocyanidins in mice is 3.970 g/kg,and the 95% confidence limit are 3.074-4.674 g/kg.It is graded as low-toxic substance according to the acute toxicity grading.The organ color of the dissected mice was normal,and no symptoms such as enlargement,shrinkage or lesion were found.When the single dose reached certain amount,the pathological section of liver and kidney for the surviving mice were normal 10 d after the ingestion.It can be concluded that the proanthocyanidins from black wattle bark is low toxic and safe,and it cannot cause lesion and injury to the mouse metabolic organs.

Acaciamearnssiibark;proanthocyanidins;acute toxicity

TQ351

A

2096-1359(2017)05-0064-06

2016-12-18

2017-04-25

國家重點研發計劃(2016YFD0600801)；江蘇高校品牌專業建設工程項目(PPZY2015C22)；云南省應用基礎研究項目(2014FD052)；楚雄師范學院學術骨干培養資助項目(13XYGG03)。

張倫，女，講師，博士，研究方向為天然產物化學。

王飛，男，教授。E-mail:hgwf@njfu.edu.cn