不同測定因素對凱氏定氮法粗蛋白測定的影響

楊文華

（內蒙古民族大學動物科學技術學院，內蒙古通遼 028000）

不同測定因素對凱氏定氮法粗蛋白測定的影響

楊文華

（內蒙古民族大學動物科學技術學院，內蒙古通遼 028000）

本試驗依據凱氏定氮法測定粗蛋白含量的步驟，研究了不同消化溫度、消化時間、催化劑用量、硼酸吸收液是否加減、蒸餾時間以及鹽酸濃度等對飼料中粗蛋白含量測定值的影響。

測定因素 凱氏定氮法 粗蛋白

蛋白質是飼料中含氮化合物的總稱，是支持生命活動的先決條件，更是構成生命體細胞和抗體等不可或缺的關鍵成分[1]。飼料中蛋白質含量的高低直接影響到動物個體生長和新陳代謝速度，因而，準確測定飼料中的蛋白質含量顯得尤為重要[2]。

粗蛋白質的測定方法很多，包括凱氏定氮法、過氧化氫測定法、國標法和雙縮脲法等[3]。由于凱氏定氮法測定簡單，試劑和試驗條件容易獲得，因而在實際中使用最多、應用范圍最廣。諸多實踐證明，凱氏定氮法較適用于單一飼料粗蛋白、濃縮飼料粗蛋白等測定。凱氏定氮法的原理是用濃硫酸對試樣進行消化，使試樣中的蛋白質等含氮物的氮素轉化為氨[4]，被硫酸吸收生成硫酸銨，其后加入堿液進行蒸餾，當氨逸出后用硼酸予以吸收，最后用酸標準溶液完成滴定得到含氮量進行粗蛋白質換算。由于測定時涉及消化、吸收、蒸餾和滴定等眾多環節，因而凱氏定氮法的影響因素相應較多，如消化溫度、消化時間、催化劑、蒸餾時間、鹽酸濃度等。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗選用進口魚粉、玉米秸稈和大豆粕為試驗材料，試樣粉碎并通過0.45mm分樣篩，分別混合均勻后置于密封容器中保存待用。試劑按照《GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測定方法》[5]準備。粗蛋白測定儀器為KDN-08凱氏定氮儀。

1.2 試驗方法

試驗采用單因子試驗設計，分別研究不同消化溫度、消化時間、催化劑用量、硼酸吸收液加堿量、蒸餾時間、鹽酸濃度對凱氏定氮測定結果的影響。

1.2.1 消化溫度的影響試驗 試驗過程中選用材料為大豆粕。將消化溫度設為380 ℃、400 ℃、420 ℃、440 ℃、460 ℃共5個處理，使用凱氏定氮法對樣品進行消化蒸餾滴定，比較在不同消化溫度條件下的測量結果。

1.2.2 消化時間的影響試驗 試驗過程中選用材料為大豆粕。將消化時間設為30min、60min、120min、180min、240min、300min共6個處理，使用凱氏定氮法對樣品進行消化蒸餾滴定，比較在不同消化時間條件下的測量結果。

1.2.3 不同催化劑用量的影響試驗 選用大豆粕為試驗樣品，選用硫酸銅和硫酸鉀兩種混合催化劑進行對比試驗，其比例為1：15，催化劑用量設為3.4 g、4.4 g、5.4 g、6.4 g、7.4 g共5個處理，使用凱氏定氮法對樣品進行消化蒸餾滴定，比較在不同催化劑用量條件下的測量結果。

1.2.4 硼酸吸收液加堿的影響試驗 在試驗過程中參照《GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測定方法》[5]中硼酸的配置方法，同時設置2個處理，分別在1000 ml硼酸吸收液中加入0.5 ml 4%氫氧化鈉和不加氫氧化鈉。每個處理測定3個平行。

1.2.5 蒸餾時間的影響試驗 選用大豆粕為試驗樣品，試驗過程中將蒸餾時間設為3min、4min、5min、6min、7 min共5個處理，依據凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.2.6 鹽酸濃度的影響試驗 試驗過程中分別選用魚粉、大豆粕、玉米秸稈為試驗樣品，每個試驗樣品的鹽酸濃度依次設為0.10、0.05、0.01 mol/L共3個處理，依據凱氏定氮法進行消化蒸餾滴定。

1.3 數據處理

試驗采用單因子完全隨機化設計，數據采用SAS8.1統計軟件中的廣義線性模型（GLM）進行方差分析和多重比較（SNK）。

2 結果

2.1 消化溫度的影響

試驗結果表明，在380℃和400℃的消化管中的溶液為不透明的黑色，意味著其未能完全消化，其他溫度下消化試管中均為藍色透明。各處理的凱氏定氮法測定結果見圖1，圖1表明，消化溫度為420℃時所測得的粗蛋白相對含量高于其他處理，測定結果更準確。

圖1 不同消化溫度對凱氏定氮測定結果的影響

2.2 消化時間的影響

試驗結果表明，30min消化后的樣品為黑色，而60min消化的樣品為淡藍色，其他消化時間的樣品顏色均為藍色透明。各處理的凱氏定氮法測定結果見圖2，當樣品消化時間為30min時，其蛋白質含量偏低，隨著消化時間的逐漸增加，蛋白質測定值逐漸提高。當其消化時間為2h時，到達臨界點增長速度放緩，甚至和消化5h后的蛋白質含量無明顯差異，由此可以得出結論，消化時間控制在2h時最為適中。

圖2 不同消化溫度對凱氏定氮測定結果的影響

2.3 催化劑用量的影響

試驗結果表明，當催化劑用量為3.4g和4.4g時，消化后試驗樣品顏色為黑色。當催化劑用量為6.4g時，消化后試驗樣品為藍色透明，當催化劑用量為7.4g時，試驗組消化管內存有黑色物體。

圖3 不同催化劑用量對凱氏定氮測定結果的影響

2.4 硼酸吸收液加堿的影響

試驗結果表明，硼酸吸收液加堿與否對試驗結果有直接影響。從表1中可知，硼酸加堿所測得的空白值大于不加堿的處理，但對樣品粗蛋白的測定結果的影響極小，可以忽略不計。

表1 硼酸吸收液加堿對粗蛋白相對含量測定結果的影響

2.5 蒸餾時間的影響

試驗結果見圖4，由圖可知，當蒸餾時間在5～7min時，粗蛋白測定值較為接近，可認為試驗消化管中存有的游離氨可被全部蒸餾出來，被硼酸完全吸收；當蒸餾時間為3～4min時，粗蛋白測定值偏低，可認為消化管內游離氨未蒸發完全；表明當蒸餾時間控制在5min時，消化管內的游離氨完全蒸發。

圖4 不同蒸餾時間對凱氏定氮測定結果的影響

2.6 鹽酸濃度的影響

試驗結果如表2所示。試驗結果表明，在魚粉粗蛋白的測定中，鹽酸的濃度越低，試驗測定差異就越大。在豆粕粗蛋白的測定中，鹽酸的濃度越低，試驗測定差異就越大。而玉米秸稈粗蛋白的測定中，鹽酸濃度越高，測定誤差越大。

表2 不同樣品鹽酸滴定的平均消耗用量，ml

3 討論

3.1 消化溫度的影響

凱氏定氮法測定粗蛋白過程中，消化溫度會直接影響樣品的消化速度，一般要求控制消化溫度不使消化速度過快，剛開始時以小火為宜，等到樣品焦化后再提高溫度。必要時可以晃動瓶身消除因消化而產生的泡沫，避免消化不完全。研究發現，當消化溫度低于420℃時，數據結果偏小。但若溫度升溫過快，部分含氨物質無法在規定時間內轉化為硫酸銨，甚至是以氣體形式損失掉，則容易造成測定結果偏低?！禛B/T6432-1994飼料中粗蛋白測定方法》[5]中規定消化溫度為360℃～410℃，但實際消化時可針對實際情況進行適當調整，當然消化溫度一般不超過450℃，否則造成蛋白質分解，影響試驗結果準確性[6]。

3.2 消化時間的影響

凱氏定氮法測定粗蛋白的消化時間比較容易控制，根據本試驗結果，樣品消化時間大于2h，即可消化完全。若消化時間超過2h，粗蛋白質含量不僅不會增加，反而降低，因此建議將消化時間控制在2h為宜。

3.3 催化劑用量的影響

試驗表明，當催化劑用量為6.4g時消化最為徹底，所獲取數據也最為準確。催化劑用量要求適宜，過少會致使消化不完全，過多則會留有難以消化的黑色物體，兩者都會對測定結果產生不利影響。

3.4 硼酸吸收液加堿的影響

就粗蛋白測定結果總體而言，硼酸對于粗蛋白測定結果產生的影響較小，很大程度上是因為硼酸吸收液的酸堿度對飼料樣品和對空白對照組的作用是相同的，這樣便可將這一影響消除。硼酸加堿的意義在于，加堿之后進行滴定試驗，所觀察到的顏色反應更加明顯，有利于試驗者進行滴定終點的判斷。

3.5 蒸餾時間的影響

盡管蒸餾時間為5min時，消化管內游離氨均可完全蒸發。但隨著蒸餾時間的延長，錐形瓶中的溶液體積逐漸加大，當蒸餾時間超過7min時，蒸餾液將超過試驗錐形瓶的三分之二，體積過大將影響后續滴定試驗。因而，以控制蒸餾時間為5min為宜。

3.6 鹽酸濃度的影響

經過試驗研究發現：當鹽酸在滴定量小于5ml或者大于40ml時，所造成的滴定誤差相對較大。因此，鹽酸的濃度選擇需要參照試樣大體的粗蛋白含量進行選擇，若蛋白質含量較高時，應當選用高濃度鹽酸予以滴定，反之亦然，這樣能夠保證測定結果的準確性[7]。

4 結論

實驗結果顯示，用凱氏定氮法測定粗蛋白時，消化溫度以420℃效果最好，消化時間最好控制在2h，催化劑用量以6.4g為宜，硼酸吸收液是否加堿對測定結果影響比較小，蒸餾時間在5min為宜，粗蛋白的大體含量則為鹽酸濃度的主要決定因素?？傮w而言，消化溫度、消化時間和催化劑用量為影響消化結果的主要因素。

[1]丁進海.飼料中粗蛋白測定的影響因素分析[J].現代農業科技，2015，（17）：302-304.

[2]劉新國.飼料蛋白質分析探討[J].江西飼料，2002，（6）：23-24.

[3]張峻炎，楊策，田亞平，等.啤酒泡沫蛋白質的初步分離及測定[J].釀酒，2002，（5）：66-67.

[4]曲玲，汪海棠，徐學博，等.食品中蛋白質測定方法的研究[J].中國新技術新產品，2015，（6）：68.

[5]飼料中粗蛋白測定方法：GB/T6432-1994[S].北京：中國標準出版社，1994.

[6]杜增鵬.海參活性肽口服液蛋白含量檢測技術研究[J].食品安全導刊，2015，（12）：63-64.

[7]屈健.非水溶液滴定法的影響因素分析[J].中國獸藥雜志，2002，（10）：42-43.