凝溶膠蛋白對胃癌細胞凋亡及細胞中活性氧水平的影響研究*

倪猛，殷濤，鄭喜勝，劉馳，王博，樊宏偉

[1.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）消化內科一病區，河南 南陽 473000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 胰腺外科，湖北 武漢 430022；3.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）重癥醫學科，河南 南陽 473000；4.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）肝臟普外科，河南 南陽 473000；5.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）腫瘤內科三病區，河南 南陽 473000]

凝溶膠蛋白對胃癌細胞凋亡及細胞中活性氧水平的影響研究*

倪猛1，殷濤2，鄭喜勝3，劉馳4，王博5，樊宏偉1

[1.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）消化內科一病區，河南 南陽 473000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 胰腺外科，湖北 武漢 430022；3.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）重癥醫學科，河南 南陽 473000；4.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）肝臟普外科，河南 南陽 473000；5.鄭州大學附屬南陽醫院（南陽市中心醫院）腫瘤內科三病區，河南 南陽 473000]

目的探討凝溶膠蛋白（GSN）對胃癌細胞凋亡及細胞中活性氧（ROS）水平的影響。方法免疫印跡法（Western blot）檢測胃癌細胞SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細胞GES-1中GSN的表達水平。細胞轉染GSN siRNA（GSN siRNA組）和siRNA對照（siRNA control組），同時以只加入轉染試劑的細胞為對照組，培養48 h后，噻唑藍（MTT）檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，激光掃描共聚焦顯微鏡法檢測ROS水平，Western blot檢測細胞中GSN、Notch1胞內段受體（NICD1）、Notch2胞內段受體（NICD2）、DNA結合蛋白1（HES1）多克隆抗體及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）水平。結果GSN在胃癌細胞SGC7901、AGS及BGC823中的表達水平高于胃黏膜上皮細胞GES-1（P＜0.05），且在AGS細胞中的表達水平最高，后期選用胃癌細胞AGS為研究對象。siRNA control組細胞增殖、凋亡及細胞中ROS水平、GSN、NICD1、NICD2、HES1及Cleaved Caspase-3水平與對照組相比均差異無統計學意義（P＞0.05）。GSN siRNA組細胞增殖能力及細胞中GSN、NICD1、NICD2及HES1水平低于對照組（P＜0.05），而細胞凋亡能力及細胞中ROS水平、Cleaved Caspase-3水平均高于對照組（P＜0.05）。結論干擾GSN表達后，胃癌細胞增殖能力減弱，凋亡增加，作用機制可能與細胞中ROS水平及NOTCH信號通路有關。

胃癌細胞；凋亡；NOTCH信號通路；活性氧

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of GSN on the apoptosis and the level of ROS in gastric cancer cells.MethodsThe expression of GSN in gastric cancer cell lines SGC7901,AGS,BGC823 and gastric epithelial cells GES-1 were detected by Western blot.Cells were transfected with GSN siRNA(the GSN siRNA group),siRNA control(the siRNA control group)and transfection vehicle (the vehicle control group),respectively.Cell proliferation was determined by MTT assay.Cell apoptosis was determined by flowcytometry.ROS level was measured by laser scanning confocal microscopy.The levels of GSN,NICD1,NICD2,HES1,and cleaved Caspase-3 were detected by Western blot.Results Expression level of GSN in gastric cancer cell lines including SGC7901,AGS and BGC823 was significantly higher than that in gastric epithelial cells GES-1 (P＜0.05).Given that AGS witnessed the highest expression of GSN,following experiments were performed on it.There was no significant difference in cell proliferation,apoptosis,ROS,GSN,NICD1,NICD2,HES1 or cleaved Caspase-3 level between the siRNA control group and the vehicle control group (P＞0.05).Cell proliferation and the levels of GSN,NICD1,NICD2,and HES1 in the GSN siRNA group were dramatically lower than those in the control group (P＜0.05),while cell apoptosis and the levels of ROS and cleaved Caspase-3 were notably higher than those in the vehicle control group (P＜0.05).ConclusionsGSN decreases proliferation ability while increases apoptosis of gastric cancer cells through manipulation on ROS level and NOTCH signaling pathway.

Keywords: gastric cancer cell;apoptosis;NOTCH signaling pathway;reactive oxygen specie

目前，全球胃癌發病率在全部惡性腫瘤中位居第4位，死亡率位居第2位[1]。每年大約有70萬人死于胃癌，占全部惡性腫瘤死亡人數的10%左右[2]。＞50歲的中老年人是胃癌高發人群，遺傳因素、飲食習慣及環境等均能夠引起胃癌的發生。尋找有效的靶基因治療胃癌是目前研究的熱點。凝溶膠蛋白（gelsolin，GSN）參與肌動蛋白合成及生物學功能的發揮，在肌動蛋白絲的切斷、聚集等過程中均發揮重要作用[3]。凝溶膠蛋白是細胞骨架蛋白的重要組成成分，在癌癥的發生過程中也具有重要作用[4]。GSN參與調控肝癌、食管癌等多種癌細胞的生長過程，而NOTCH信號通路是目前公認的與腫瘤細胞生長有關的信號轉導通路[5-6]。本研究中，首先檢測GSN在不同胃癌細胞中的表達水平，并通過小核糖核酸（RNA）干擾技術干擾胃癌細胞中GSN的表達，探討GSN對胃癌細胞增殖凋亡的影響及機制，以期為治療胃癌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

GSN siRNA、siRNA Control（購自上海吉瑪生物科技有限公司），GSN多克隆抗體、Notch1胞內段受體（NICD1） 多克隆抗體、Notch2胞內段受體（NICD2）多克隆抗體、DNA結合蛋白1（hairy and enhancer of split 1，HES1）多克隆抗體及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）單克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司），DMEM培養基、RPMI 1640培養基（購自美國Sigma公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒（購自北京鼎國生物技術有限公司），胎牛血清（購自美國Gibco公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測試劑盒（購自上海研拓生物科技有限公司）。

1.2 細胞培養

胃癌細胞SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細胞GES-1（購自于中國科學院細胞庫）。取出凍存在液氮罐中的人胃癌細胞SGC7901、AGS及BGC823，放置于37℃的環境下融化。在細胞中加入細胞培養液（胃癌細胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養液，胃黏膜上皮細胞GES-1用含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養液），混勻后，1 000 r/min離心10 min。棄上清液，加入5 ml細胞培養液懸浮細胞后，接種到細胞培養瓶中，放置于37℃，5%二氧化碳CO2培養箱中培養48 h后，觀察細胞密度＞90%時，棄掉細胞培養液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，用適量細胞培養液懸浮細胞后，根據實驗要求按照不同比例接種到細胞培養瓶中繼續培養。

1.3 Western blot檢測細胞中GSN表達水平

取胃癌細胞SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細胞GES-1，加入裂解液，放置于冰上裂解30 min。轉移裂解液至離心管中，12 000 r/min，4℃離心20 min，轉移蛋白上清至EP管中。BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品與Loading buffer混合后放置于100℃煮沸5 min。取變性蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔中加入蛋白樣品50 μl，80 V電壓電泳30 min后，調整電壓為120 V至電泳結束。取出蛋白凝膠，4℃轉印至PVDF膜上，經5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗（200倍稀釋）、二抗（1000倍稀釋）反應，在暗室中顯影，曝光后以GAPDH為內參，分析蛋白表達水平。

1.4 細胞轉染

取培養至對數生長期的細胞，加入胰蛋白酶消化后，用細胞培養液懸浮細胞沉淀，調整每毫升細胞懸浮液中含有細胞2×104個，接種于96孔細胞培養板中，每孔中加入100μl細胞懸浮液，放置于37℃，5%CO2培養箱中培養，觀察細胞融合度為60%時，轉染GSN siRNA（GSN siRNA組）和siRNA對照（siRNA Control組）。用不含胎牛血清的不完全培養液稀釋siRNA，混合后，加入轉染試劑LipofectamineTM2000，混合后，放在室溫下靜置15 min形成轉染的復合體。將細胞培養板中的培養液吸出，加入轉染復合體，培養6 h后，更換為含有胎牛血清的細胞培養液繼續培養。

1.5 MTT檢測細胞增殖

取轉染后的胃癌細胞，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞后，調整細胞濃度為每毫升2×104個。接種于96孔細胞培養板中，每孔加入100 μl的細胞懸浮液，放置于37℃培養細胞48 h。在細胞中加入噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液孵育4 h，加入DMSO溶液在室溫下孵育反應10 min。每組設置5個復孔提高實驗準確性，同時設置空白組，空白組中不加細胞。觀察結晶物完全融化后，酶標儀檢測細胞吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率=（轉染組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

轉染后的細胞培養48 h后，棄掉上清液，胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入細胞培養液，調整細胞濃度為每毫升含有1×106個細胞。收集1 ml的細胞，加入500μl結合緩沖液混合均勻，加入體積為10 μl的膜聯蛋白V-FITC（Annexin V-FITC），放在避光條件下室溫反應30min，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μl，避光反應5 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，分析細胞凋亡率。

1.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ROS水平

取轉染后的細胞，接種到96孔細胞培養板中，每孔中加入4×103個細胞。放在37℃，5%CO2培養箱中培養48 h后，吸除上清液，每孔中加入100 μl的H2DCFDA染液（5 μmol/L），放置于避光條件下反應30 min后，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞熒光強度，激發波長和吸收波長分別為488和490 nm。熒光強度越強ROS水平越高。

1.8 Western blot檢測細胞中 NICD1、NICD2、HES1及Cleaved Caspase-3水平

收集轉染后48h的細胞，參照1.4中Western blot方法檢測細胞中 NICD1、NICD2、HES1及 Cleaved Caspase-3水平。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞中GSN表達水平比較

Western blot檢測人胃癌細胞 SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細胞GES-1中GSN表達水平依次為（0.52±0.06）、（0.86±0.06）、（0.73±0.09）及（0.19±0.02）。細胞 SGC7901、AGS、BGC823 中 GSN水平均高于細胞GES-1，差異有統計學意義（F=65.350，P=0.000）。細胞AGS中GSN水平最高，后續實驗中選擇胃癌細胞AGS繼續研究。見圖1。

圖1 細胞中GSN表達水平比較

2.2 轉染后細胞中GSN表達水平比較

對照組、siRNA Control組及GSN siRNA組GSN表達水平依次為（0.67±0.07）、（0.68±0.08）和（0.20±0.05），組間比較差異有統計學意義（F=49.065，P=0.000）。AGS細胞轉染siRNA Control后細胞中GSN表達水平與對照組比較無差異（t=0.163，P=0.879）。細胞轉染GSN siRNA后細胞中GSN表達水平低于對照組，差異有統計學意義（t=9.463，P=0.001）。見圖2。

圖2 轉染后細胞中GSN表達水平比較

2.3 細胞增殖凋亡檢測結果

轉染后的AGS細胞，經MTT和流式細胞術檢測細胞的存活率和細胞凋亡情況。對照組、siRNA C ontrol組、GSN siRNA組細胞存活率依次為（100.01±9.99）%、（100.5±9.33）%和（44.67±7.33）%，凋亡率依次為（9.70±2.61）%、（10.47±3.07）%和（34.55±4.34）%。細胞轉染GSN siRNA后細胞存活率下降，細胞轉染GSN siRNA后細胞凋亡率升高，與對照組比較，差異有統計學意義（F細胞存活率=38.531，P細胞存活率=0.000）。細胞轉染 siRNA control后細胞存活率和凋亡率與對照組比較均無差異（F細胞凋亡率=51.236，P細胞凋亡率=0.000）。見圖3。

圖3 細胞增殖凋亡檢測結果

2.4 細胞中ROS水平比較

檢測各組AGS細胞中ROS水平，熒光強度越高，ROS水平也就越高。對照組、siRNA Control組及GSN siRNA 組 ROS水平依次為（42.33±3.66）、（42.92±3.87）和（65.67±6.31），組間比較差異有統計學意義（F=23.376，P=0.002）。轉染 GSN siRNA 后的細胞ROS水平高于對照組，差異有統計學意義（t=5.542，P=0.005）。轉染siRNA Control后的細胞ROS水平與對照組比較無差異（t=0.192，P=0.857）。見圖4。

圖4 細胞中ROS水平比較

2.5 細 胞 中 NICD1、NICD2、HES1 及 Cleaved Caspase-3水平比較

檢測各組AGS細胞中 NICD1、NICD2、HES1水平，對照組、siRNA Control組、GSN siRNA組CleavedCaspase-3 水平依次為（0.21±0.05）、（0.21±0.06）及（0.48±0.06），NICD1 水平依次為 （0.56±0.06）、（0.55±0.07） 及（0.28±0.06），NICD2水平依次為（0.84±0.05）、（0.84±0.06） 及（0.20±0.05），HES1水平依次為（0.30±0.05）、（0.30±0.06）及（0.18±0.02），組間比較差異有統計學意義（FCleavedCaspase-3=22.546，PCleavedCaspase-3=0.002；FNICD1=18.769，PNICD1=0.003，FNICD2=142.884；PNICD2=0.000，FHES1=6.646，PHES1=0.030）。GSN siRNA組細胞中NICD1、NICD2及HES1水平均低于對照組，而Cleaved Caspase-3水平高于對照組，差異有統計學意義（t1=5.716，P1=0.005；t2=15.677，P2=0.000；t3=3.860，P3=0.018；t4=5.988，P4=0.004）。siRNA Control組細胞中 NICD1、NICD2、HES1 及 Cleaved Caspase-3水平與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 細胞中NICD1、NICD2及HES1水平比較

3 討論

胃癌的發病率在20世紀以前呈逐年上升趨勢，隨著生活條件的改善，胃癌發病率的上升趨勢有所減緩。世界范圍內每年新增的胃癌患者中有50%左右的患者在中國，而胃癌也是我國癌癥中死亡人數最多的惡性腫瘤[7-8]。胃癌發生早期癥狀不明顯，大部分患者在確診時基本已經處于胃癌的晚期，這為治療帶來很多的困難。胃癌嚴重危害著人類的生命健康。

GSN是一種近年來發現的與腫瘤有關基因，在細胞的生長、死亡過程中均發揮作用[9]。既往的研究表明，GSN在肝癌患者血清及癌癥組織中均表達上調，過表達肝癌細胞中GSN的水平，能夠抑制肝癌細胞的凋亡[6,10-11]。本研究結果與之前的報道相一致，胃癌細胞株中GSN的水平均高于胃黏膜細胞，這提示GSN可能是一種癌基因，能夠促進癌癥的發展。

細胞凋亡是一種正常情況下的細胞死亡，受多種基因蛋白和細胞內ROS水平的調控[12]。有研究表明，GSN能夠通過作用于Caspase-3的活化水平，進而影響癌細胞的凋亡[13-14]。Caspase-3的活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[15]。本研究結果顯示，干擾GSN表達后的胃癌細胞增殖能力下降，而流式細胞術結果顯示，干擾GSN后胃癌細胞的凋亡數目增多，細胞中Caspase-3活化增多，細胞內ROS水平升高，這進一步提示，GSN是一種癌基因，干擾其表達后能夠抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡。

NOTCH能夠調控海膽、人等多種生物體內細胞的生長和死亡[16]。多項研究已顯示，NOTCH在多種腫瘤中異?；罨?，能夠調控腫瘤細胞的多種生物學功能的發揮[17-18]。NICD1、NICD2是NOTCH信號通路的胞內段基因，DNA結合蛋白1（HES1）含有α螺旋-環-螺旋結構，能夠調控靶基因的轉錄，是NOTCH信號轉導過程中的重要傳遞因子[19]。本研究結果發現，干擾GSN后胃癌細胞中NICD1、NICD2及HES1蛋白表達均出現下調。這說明GSN對胃癌細胞的作用機制可能與NOTCH信號通路有關。

綜上所述，GSN在胃癌細胞株中的表達水平高于人正常的胃黏膜細胞，干擾胃癌細胞中GSN表達后，胃癌細胞的增殖受到抑制，凋亡增多，作用機制可能與NOTCH信號通路及細胞內的ROS水平有關。這為后期進一步在體內研究GSN對胃癌的作用機制奠定基礎，為治療胃癌提供新思路。

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Effect of GSN on apoptosis and ROS level in gastric cancer cells*

Meng Ni1,Tao Yin2,Xi-sheng Zheng3,Chi Liu4,Bo Wang5,Hong-wei Fan1
(1.Department of Gastroenterology,Nanyang Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Nanyang,Henan 473000,China;2.Department of Pancreatic Surgery,Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430022,China;3.Department of Critical Care Medicine,4.Department of Liver Surgery,5.Department of Oncology,Nanyang Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Nanyang,Henan 473000,China)

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.005

1005-8982（2017）21-0025-06

2017-03-13

國家自然科學基金（No：81372665）

樊宏偉，E-mail：xhnkfhrr@sohu.com；Tel：13507638051