響應面優化生姜多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

趙文竹，王欣珂，于志鵬，*，張瑞雪，李思慧，劉靜波，勵建榮

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧錦州121013；2.吉林大學營養與功能食品研究室，吉林長春130062）

響應面優化生姜多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

趙文竹1，王欣珂1，于志鵬1，*，張瑞雪1，李思慧1，劉靜波2，勵建榮1

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧錦州121013；2.吉林大學營養與功能食品研究室，吉林長春130062）

采用Box-Benhnken法優化生姜多糖的提取工藝參數，分別考察提取時間、提取溫度及液固比對多糖得率的影響，采用三因素三水平響應面法進行多糖提取工藝的優化，利用傅立葉紅外光譜分析其結構。結果表明，生姜多糖最佳提取時間為2 h 44 min，提取溫度為71.6℃，液固比為41∶1（mL/g），在此條件下，生姜多糖得率為3.13%。后經抗氧化活性測定，生姜多糖提取物具有一定抗氧化活性。

生姜多糖；提??；純化；抗氧化活性

Abstract：The extraction of polysaccharides from ginger was optimizition by Bom-Benhnken desing，a multiple quadratic regression describing the relationship between the parameters such as extraction time，extraction temperature，liquid-to-material ratio were established using a 3-factor，3-lever Box-Behnkon design，and the structure of polysaccharides was analysised by FTIR.The results showed，the optimal extraction condition was obtained as extraction time 2 h 44 min ，extraction temperature71.6 ℃，liquid-to-material ratio 41∶1（mL/g）.Under such conditon the yield of polysaccharides from ginger was 3.13%.From some experimengts，we find ginger polysaccharides have antioxidant activity.

Key words：ginger polysaccharides；extraction；purificaiton；antioxidant activity

多糖類化合物具有多重生理功效，如抗氧化、驅寒、止嘔、健胃解毒、延緩衰老、降低膽固醇、抗癌、抑菌、免疫調節、抗炎、抗輻射等。龔濤等[1]研究了枸杞多糖的抗氧化和抗腫瘤功能，研究表明枸杞多糖能提高血清SOD酶的活力，Kodama等[2]研究了灰樹花多糖的抗腫瘤的作用，研究結果表明，多糖對抑制干擾素-γ、腫瘤致死因子-α的水平均有提高，該多糖對腫瘤細胞有抑制作用，Nair等[3]研究表明茜草中提取的一種多糖（RRl）具有免疫調節作用。

生姜，屬于姜科姜屬，多年生宿根草本植物，是最常用的香辛料之一。生姜中含有豐富的營養物質，如姜黃酮、姜辣素、姜糖蛋白、姜精油和姜多糖[4]，生姜多糖具有一定的抗氧化活性[5]，但生姜多糖的純化及紅外結構研究相對較少。本研究以生姜為原材料，對生姜多糖提取工藝及其還原力活性進行研究，同時對生姜多糖的紅外結構進行初探，旨在為生姜多糖活性的提取、純化及結構研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜：錦州市興隆大家庭超市；苯酚、抗壞血酸、鐵氰化鉀：天津虔誠偉業科技發展有限公司；濃硫酸：錦州古城化學試劑廠；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市風船化學試劑科技有限公司；氯化鐵：天津永晟精細化工有限公司；氯化亞鐵：天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸：天津市福晨化學試劑廠；以上藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5100紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋：金壇市鑫鑫實驗儀器廠；電熱鼓風干燥箱：上?！憧茖W儀器有限公司；FA1204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；KF20002電子天平：浙江凱豐集團有限公司；TG16KR臺式高速冷凍離心機：長沙東旺實驗儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熱水浸提法提取生姜多糖

將鮮生姜切片60℃烘干24 h，粉碎后過60目篩，制得生姜粉。準確稱取一定量的生姜粉末樣品，放入圓底燒瓶中，加入適量的蒸餾水進行熱水浸提，按照試驗設定的提取時間、提取溫度和液固比進行熱水浸提，靜置冷卻至室溫，抽濾，得到生姜多糖提取液。

1.3.2 生姜多糖提取的單因素試驗

1.3.2.1 提取時間對生姜多糖得率的影響

取預處理的姜粉 2 g，以液固比為 30∶1（mL/g），水浴溫度為 70 ℃，提取時間分別為 1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，利用熱水浸提法進行提取。測定多糖得率，比較選取最佳提取時間。

1.3.2.2 提取溫度對生姜多糖得率的影響

取預處理的姜粉 2 g，以液固比為 30∶1（mL/g），提取時間為 3 h，水浴溫度分別為 30、40、50、60、70、80、90℃，利用熱水浸提法進行提取。測定多糖得率，比較選取最佳提取溫度。

1.3.2.3 液固比對生姜多糖得率的影響

取預處理的姜粉2 g，以水浴溫度為70℃，提取時間 3 h，液固比分別為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）利用熱水浸提法進行提取。測定多糖得率，比較選取最佳液固比。

1.3.3 響應面優化設計及數據分析方法[7]

響應面法以最經濟的方式、較少的試驗次數和較短的時間對3種試驗因素進行全面研究[6-7]。根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，將影響生姜多糖得率（Y）的3個主要影響因素：提取時間（X1）、提取溫度（X2）、液固比（X3）進行組合。以-1、0、1 代表自變量水平，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX對自變量進行編碼。式中：xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實值；X0為試驗中心點處自變量的真實值；ΔX為自變量的變化步長。試驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 因素編碼表Table 1 Experiment factors coding table

根據因素和水平共安排設計17次試驗，試驗號1～12是析因試驗，試驗號13～17是中心試驗。17個試驗點分為析因和零點，其中析因點和零點分別為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點和區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。采用Design-Expert8.0軟件對試驗數據進行回歸分析。

1.3.4 生姜多糖含量的測定

多糖測定采用苯酚-硫酸法[8]。將生姜多糖提取液，稀釋適當的倍數（N，稀釋倍數需要預試驗，使其在490 nm處測定吸光度值在0.2～0.8范圍內）。依次吸取1 mL的樣品稀釋液、0.5 mL的苯酚、2.5 mL的濃硫酸依次加入試管中，沸水浴加熱15 min，靜置到室溫，在490 nm處測定其吸光度值（A490nm），由葡萄糖標準曲線得到的回歸方程：y=（x+0.023）/0.01吸光度值為橫坐標（x）、多糖的質量濃度（mg/mL）為縱坐標（y）。由回歸方程計算出以葡萄糖計的稀釋后生姜提取液中多糖的質量濃度（y），計算出稀釋前生姜提取液中多糖的質量濃度（C=y×N）

式中：Y為生姜多糖得率，%；C為生姜提取液中多糖的質量濃度，mg/mL；V為提取液體體積，mL；W為原料質量，g。

1.3.5 生姜多糖抗氧化活性研究

生姜多糖DPPH清除率的測定、還原力測定、金屬熬合能力測定的測定按照參考文獻[4]的活性測定完成。

2 結果與分析

2.1 多糖提取單因素試驗結果分析

不同因素對多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同因素對多糖得率的影響Fig.1 Effect of different factors on the yield of polysaccharides

由圖1（a）可以看出在2.5 h之前多糖得率明顯增加，說明隨著提取時間的增加，提取液中多糖濃度明顯增加。在2.5 h之后上下浮動，但總體平緩上升，3.5 h到達峰值后下降。說明在2.5 h到3.5 h期間大部分多糖包括果膠、黏液質已溶出達到平衡，故多糖得率提高減慢，故不需要過長提取時間，因此提取時間選用2.5 h。由圖1（b）由圖可以看出隨溫度上升多糖得率逐漸增加，并在70℃達到峰值，70℃之后多糖得率趨于平緩并有所下降，說明溫度過高會使多糖降解，故多糖得率降低，故不需要過高提取溫度，因此提取溫度選用70℃。由圖1（c）可以看出液固比在40∶1（mL/g）之前多糖得率趨勢明顯增加，說明隨著液固比的增加，提取液中多糖濃度明顯呈增加的趨勢。在40∶1（mL/g）之后得率下降。說明水對多糖有一定的溶解度，一定量的水只能溶解一定的糖，但水分太大在一定加熱時間里，溫度升高速度減慢，多糖未充分溶于水中。故不需要過大液固比，因此液固比選用40∶1（mL/g）。綜上所述，最優條件為提取時間2.5 h、提取溫度70℃、液固比 40∶1（mL/g）。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 試驗設計

響應面優化試驗設計及結果見表2，方差分析表見表3。

表2 響應面優化試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of optimizing test by response surface method

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

續表3 方差分析表Continue table 3 Variance analysis

生姜多糖得率結果見表2，采用SAS RSREG程序對所得數據進行回歸分析[6]，3個因素經過擬合得到多糖得率（Y）回歸方程：

由表3可知，模型的P值小于0.05，表明二次方程擬合顯著，而且失擬項的P值大于0.05，表明失擬項不顯著，說明該模擬方程可行性較好，這種試驗方法是可靠的，即使用該方程模擬真實的三因素三水平分析是可行的。其中決定系數R2值為0.88，校正系數R2Adj值為0.73，則說明通過二次回歸得到的多糖得率的模型與試驗擬合較好。又因其變異系數CV值越低，顯示試驗穩定性越好。由表3中SAS RSREG回歸分析可知，方程中X1對Y值影響極顯著，表明提取時間對多糖得率影響較大，X1X1，X2X2，X3X3對Y值影響均顯著，表明試驗因子對響應值不是簡單地線性關系。綜上所述，該回歸方程為優化熱水浸提生姜多糖的工藝條件提供了一個良好的模型，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。

對于生姜多糖得率模型，回歸方程的方差分析結果表明，方程中的3個因素的線性平方和項的影響為顯著（P＜0.05）（表3）。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對多糖得率影響的排序為提取時間（X1）＞提取溫度（X2）＞液料比（X3）。

2.2.2 影響生姜多糖得率的主要因素分析[7]

將建立的回歸模型中的任一因素固定在最優水平，得到另外2個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線如圖2～圖3所示。

圖2 交互作用對生姜多糖得率影響的響應面圖Fig.2 Three-dimensional response surface plot showing the interactive effects on the yield of ginger polysaccharides

由圖 2～圖 3 所示，圖 3（a）為 X1X2交互等高線，可以看出提取時間軸向等高線變化密集，而溫度軸向等高線變化相對稀疏，說明提取時間對生姜多糖得率的影響比時間大；由圖2（a）得率先隨X1的升高而上升，達到一定值后開始下降，可能與加熱時間過長易使多糖分解有關。如圖3（b）在X1X3交互等高線中，提取時間軸向等高線變化密集，而液固比軸向等高線變化相對稀疏，說明提取時間對響應值峰值的影響比液固比大；由圖2（b）可以看出得率先隨X1的升高而上升，達到一定值后開始下降，可能與加熱時間過長易使多糖分解有關。如圖3（c）在X2與X3交互作用等高線中，等高線密度在2個方向相差不大，沿X2軸方向略大于X3軸方向，說明提取溫度和液固比的交互作用中，提取溫度對響應值峰值的影響略大于液固比。

用“規劃求解”對方程進行求解，得最佳條件為：提取時間2 h 44 min、提取溫度71.60℃、液固比41∶1（mL/g），最佳生姜得率為3.10%。

圖3 交互作用對多糖得率影響的等高線圖Fig.3 Three-dimensional response surface plot showing the interactive effects on the yield of ginger polysaccharides

2.3 驗證試驗

根據響應面法得出的最優工藝參數，即提取時間2 h 44 min、提取溫度 71.60 ℃、液料比 41∶1（mL/g）的工藝條件提取生姜多糖。測定生姜多糖得率，以驗證響應面法的可行性。試驗結果顯示多糖得率的實測值3.13%，預測值3.10%。預測值與實測值非常接近，偏差較小，說明由響應面法所得到的優化區域符合設計目標，試驗設計和數學模型具有可靠性和重現性?？梢姴捎庙憫娣蓪崿F優化生姜的提取工藝的目標，得到具有實際應用價值的多糖提取工藝流程。

2.4 抗氧化活性研究

分別測定生姜多糖對DPPH自由基的清除率、還原力和Fe2+的清除率如圖4所示。

圖4 生姜多糖的抗氧化活性Fig.4 The antioxidant activity of polysaccharides from ginger

多糖的還原力和清除率都呈明顯的上升趨勢，生姜多糖具有一定清除DPPH自由基的能力，而且隨著多糖濃度的增大而增高，維生素C和生姜多糖的IC50值分別為4.8 μg/mL和0.42 mg/mL，生姜多糖對DPPH自由基的清除能力相當于維生素C的1.14%，生姜多糖具有一定的還原力，但還原力作用效果不大，相當于維生素C的0.5%。生姜多糖具有一定清除Fe2+的能力，而且隨著多糖濃度的增大而增高，維生素C和生姜多糖的IC50值分別為4.21 μg/mL和2.18 mg/mL。

3 結論

通過Box-Benhnken的中心組合設計響應面法建立了提取時間、提取溫度、液固比與多糖得率的數學模型，采響應面優化法實現了多糖提取的多指標優化，得出生姜多糖得率較高的最佳提取工藝參數為提取時間2 h 44 min、提取溫度71.6℃、液固比41∶1（mL/g），生姜多糖得率達到3.13%。生姜多糖DPPH自由基清除能力的IC50值為0.42 mg/mL，還原力相當于維生素C的0.5%，金屬螯合能力的IC50值為4.18 mg/mL。

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[4]趙文竹,張瑞雪,于志鵬,等.生姜的化學成分及生物活性研究進展[J].食品工業科技,2016,37(11):383-389

[5]Zhongshan Zhang,Xiaomei Wang,Jingjing Zhang,et al.Potential antioxidant activities in vitro of polysaccharides extracted from ginger(Zingiber officinale)[J].Carbohydrate Polymers:Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides,2011,86(2):448-452

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Optimizition Extraction of Polysaccharides from Ginger by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity

ZHAO Wen-zhu1，WANG Xin-ke1，YU Zhi-peng1，*，ZHANG Rui-xue1，LI Si-hui1，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

2017-01-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.006

國家自然科學基金項目（31601479）；渤海大學博士啟動項目（0515bs020）

趙文竹（1986—），女（漢），講師，博士，研究方向：植物活性成分研究。

*通信作者：于志鵬（1984—），男，講師，博士，研究方向：蛋白質及活性肽的功能研究與產品開發。