豌豆蛋白的提取及利用次豌豆漿發酵乙醇的研究

鄧永東，呂西軍，吳學鳳，李興江

（合肥工業大學農產品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥 230009）

加工教研

豌豆蛋白的提取及利用次豌豆漿發酵乙醇的研究

鄧永東，呂西軍，吳學鳳，*李興江

（合肥工業大學農產品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥 230009）

目前，國內利用豌豆提取豌豆蛋白會產生大量廢棄液體，這些液體稱為次豌豆漿，其中含有大量的豌豆淀粉。一些企業將這部分液體直接排放或者用于生產飼料，造成了資源浪費和環境污染。為了解決這一問題，對豌豆蛋白的提取工藝及其余下的次豌豆漿發酵乙醇展開研究，采用酸沉法對豌豆蛋白進行提取，然后通過試驗探究次豌豆漿發酵乙醇的最適條件。結果表明，50 g碗豆中蛋白含量10.84 g，淀粉含量20.34 g，淀粉水解率達到理論值的83.7%；最佳發酵條件為發酵溫度30℃，菌液接種量10%，發酵液pH值4，搖床轉速200 r/min。在該條件下，乙醇產量達到28.36 g/L，糖利用率達到98%，乙醇產量達到理論值的88%。對次豌豆漿發酵乙醇工藝展開研究將為豌豆綜合利用率的提高奠定一定基礎。

次豌豆漿；豌豆蛋白；葡萄糖；乙醇；發酵

Abstract：At present，the domestic use of peas to extract pea protein left a large number of abandoned liquid，these liquids are called sub-pea pulp，which contain a lot of pea starch.Some companies will directly discharge this part of the liquid or for the production of feed，resulting in waste of resources and environmental pollution.In order to solve this problem，this paper studies the extraction process of pea protein and the fermentation of fermented ethanol from the other pea pulp.The pea protein is extracted by acid precipitation method，and then the optimum conditions of ethanol fermentation are studied.The results show that 50 g peanut protein content of 10.84 g，starch content of 20.34 g，and the hydrolysis rate of starch reaches 83.7%of the theoretical value.The optimum fermentation conditions are as follows：fermentation temperature 30℃，inoculation amount 10%，initial pH 4，shaking speed 200 r/min.Under the optimum conditions，the ethanol yield reaches 28.36 g/L，sugar utilization rate of 98%.Ethanol production reaches 88%of the theoretical value.The research on the fermentation technology of pea pulp is carried out，which las a foundation for the improvement of the comprehensive utilization rate of pea.

Key words：secondary pea pulp；pea protein；glucose；ethanol；fermentation

豌豆是世界第二大豆類作物，目前生產干豌豆的國家有60多個。豌豆蛋白具有較高的溶解度、吸水性和乳化性，其中氨基酸組成符合人體需要，富含維生素、礦物質元素、蛋白質和碳水化合物等物質，營養全面且均衡，在食品工業中用途廣泛。豌豆中含有膳食纖維，有助于消化、防止包括闌尾炎、心臟病和結腸癌等在內的多種疾病。淀粉和蛋白是豌豆中的重要組分。

干豌豆不僅含有大量的淀粉，而且還含有豐富的蛋白質；其成熟籽粒中分別含有蛋白質21%～28%，淀粉48%～52%。目前，國內許多企業利用豌豆提取豌豆蛋白，但未對其剩下的次豌豆漿進行有效利用，通常一些企業將這部分液體直接排放或者用于生產飼料，既造成了資源的浪費，又會對環境造成污染。為了解決這一問題，對豌豆蛋白提取及余下的次豌豆漿利用展開研究，利用次碗豆漿中的淀粉發酵生產乙醇，不僅可以提高豌豆的利用率，也能達到改善環境的目的。

1 材料與方法

1.1 酵母菌

熱帶假絲酵母CICC1779。

1.2 培養基

YPD葡萄糖液體培養基（100 mL）：酵母膏1 g，葡萄糖2 g，蛋白胨2 g。

YPD固體培養基（100 mL）：酵母膏1 g，葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g。

種子培養基、擴大培養基，均用YPD培養基。

1.3 主要儀器

LY-B0.025型壓力蒸汽滅菌器，武漢市鴻雁醫療器械制造有限公司產品；AR1140/C型電子分析天平，奧豪斯（上海）公司產品；SWO-CJ-IP型超凈工作臺，蘇靜集團安泰公司產品；756MC型紫外分光光度計，上海第三分析儀器廠產品；ZHP-Y2102L型智能恒溫搖床培養箱，上海三發科學儀器有限公司產品；FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；MC型酒精計，上海長城儀器廠產品；WYT-4型手持糖量計，泉州中友光學儀器有限公司產品；溫度計，鄭州澤銘科技有限公司產品；RE-85Z型旋轉蒸發儀，上海五相儀器儀表有限公司產品。

1.4 主要試劑

葡萄糖、牛血清蛋白、重鉻酸鉀溶液、DNS溶液、蛋白胨、酵母膏、瓊脂（BR）、考馬斯亮藍試劑、95%乙醇、HCl和NaOH，以上試劑均為分析純。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種的活化與擴培

（1） 菌種活化。配置YPD葡萄糖固體培養基；將冷藏的酵母菌活化，使菌種從冷藏狀態恢復到室溫狀態。將冷藏的酵母菌用糖水活化后，接種到固體培養基中，置于恒溫培養箱中培養24 h，培養溫度30℃。挑選培養基茁壯的菌落接種到新的YPD固體培養基中培養，重復此步驟2～3次，從而得到生長良好的菌落。

（2）菌種保存。挑選茁壯的單個菌落接種到試管中，置于4℃冰箱中保存。

（3）菌種擴培。將保存的菌種接種到YPD液體培養基中，培養12 h（溫度30℃，轉速150 r/min），實現擴培[1]。

1.5.2 豌豆中蛋白的提取

將50 g豌豆與300 mL水混合，清洗后浸泡24 h（浸泡使纖維吸水膨脹增大，使之破碎后，與蛋白、淀粉易于分離，從而使蛋白和淀粉從中提取出來）。去除豌豆皮后，用豆漿機磨漿（磨漿是通過機械作用破壞豌豆內部纖維與蛋白的結構網，從而使淀粉和蛋白溶于磨漿液中）[2]，使用100目濾網過濾，濾渣部分主要為淀粉、纖維素等不溶成分，上層清液中主要為蛋白等[3]。

取上清液，調節pH值至4.6后，使用離心機以轉速10 000 r/min離心10 min，下層沉淀部分為豌豆蛋白。通過考馬斯亮藍法，標定出標準蛋白曲線[4]。

1.5.3 豌豆中淀粉含量的測定

將50 g豌豆與300 mL水混合，浸泡24 h后打漿，調pH值至4.6等電點去除蛋白后，取余下淀粉乳→烘干→稱量→蒸煮糖化→烘干→稱量，減少的質量即為淀粉糊化糖化減少的質量[5]。取最后的烘干產物，用一定水溶解后加入碘液，有輕微淡藍色出現，則淀粉分解較為完全[6]。

1.5.4 次豌豆漿的制備及糖化率的測定

次豌豆漿是指提取豌豆蛋白后所余下的部分，在這里通過制備得到次豌豆漿。將上一步分離蛋白之后的液體與之前的濾渣混合，得到的漿液即為次豌豆漿[7]。

調節次豌豆漿pH值至5.6（α-高溫淀粉酶最適pH值），加入α-高溫淀粉酶，于60℃條件下水浴30 min，隨后于100℃條件下水浴60 min；待漿液冷卻至60℃，加入糖化酶于60℃條件下水浴60 min，得到糖化后用于發酵的次豌豆漿。

取少量糖化后的次豌豆漿置于試管中，滴加2滴碘液，有輕微淡藍色出現，則淀粉水解較為完全[8]。

1.5.5 乙醇產量測定

重鉻酸鉀標準曲線的標定：①取8支10 mL比色管，分別加入2 mL重鉻酸鉀溶液和適量乙醇標準溶液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴10 min后流水冷卻至室溫，于波長600 nm處測定吸光度，以吸光度為橫坐標、乙醇含量為縱坐標繪制標準曲線[8]；②取發酵液10 mL，以轉速12 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測液；③取10 mL比色管加入2 mL重鉻酸鉀溶液，1 mL待測液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴10 min后流水冷卻至室溫，于波長600 nm處測定吸光度，根據重鉻酸鉀標準曲線回歸方程計算出乙醇粗測質量分數[9]。

1.5.6殘糖量測定

（1）DNS試劑。量取750 mL去離子水，加熱至微熱后順序加入3,5-二硝基水楊酸10 g，NaOH 16 g，苯酚5 g，亞硫酸鈉5 g和酒石酸鉀鈉300 g，溶解后定容至1 000 mL，棕色瓶中室溫下暗處放置1周后使用。

（2）DNS標準曲線的標定。①取10 mL比色管，分別加入1.5 mL DNS試劑和適量葡萄糖標準溶液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴5 min后冷卻至室溫，于波長540 nm處測定吸光度[10]；②取發酵液10 mL，以轉速12 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測液；③取10 mL比色管，加入1.5 mL DNS溶液，50 μL待測液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴5 min后流水冷卻至室溫，于波長540 nm處測定吸光度，根據DNS標準曲線回歸方程計算出殘糖量[10]。

1.5.7 次豌豆漿發酵乙醇的單因素試驗

由以往發酵試驗得知，影響發酵的因素 包括發酵時間、菌液接種量、發酵溫度、發酵液 pH值、轉速以及通氣量等。試驗主要研究發酵液pH值、菌液接種量、發酵溫度，搖床轉速這4個因素對乙醇發酵的影響[7]。

發酵時間72 h，每個500 mL錐形瓶中裝入次豌豆漿300 mL，發酵液pH值分別取3，4，5，6，7共5個水平；菌液接種量分別取6%，8%，10%，12%，14%共 5個水平；發酵溫度分別取26，28，30，32，34℃共5個水平；搖床轉速分別取100，150，200，250， 300 r/min共5個水平。

1.5.8 次豌豆漿發酵乙醇的正交試驗在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與討論

2.1 豌豆成分含量測定

根據方法1.5.2測出蛋白溶液于波長595 nm處的吸光度，根據標準曲線計算出50 g豌豆中蛋白含量為10.84 g；根據方法1.5.3測得50 g豌豆中淀粉含量為20.34 g，其他含量為18.82 g。

2.2 糖化率

根據方法1.5.4利用淀粉酶和糖化酶對次豌豆漿進行水解，然后通過DNS法測得葡萄糖質量濃度為62.97 g/L，達到淀粉水解理論值的83.7%（理論值為1 g淀粉完全水解得到1.11 g葡萄糖）。

2.3 最適單因素試驗研究

2.3.1 最佳發酵溫度的確定

發酵溫度對乙醇產量的影響見圖1。

發酵溫度是影響乙醇發酵的主要因素之一。溫度會影響微生物細胞內的生物大分子活性，進而影響到微生物的生命活動。隨著溫度升高，細胞內的酶反應速度會加快；可是溫度過高或過低，生物活性物質（蛋白質、核酸等）會發生變性，細胞功能下降，甚至死亡。由圖1可知，隨著發酵溫度的升高，酵母菌利用次豌豆漿發酵乙醇的產量有明顯提高。在30℃時乙醇產量達到最高值26.58 g/L，殘糖量僅為5.2 g/L；隨著發酵溫度的繼續升高，乙醇產量明顯降低。當發酵溫度低于30℃時，發酵溫度越高越有利于發酵；而發酵溫度高于30℃時，由于發酵溫度過高，會影響乙醇產量[11]。

2.3.2 最佳搖床轉速的確定

搖床轉速對乙醇產量的影響見圖2。

圖1 發酵溫度對乙醇產量的影響

圖2 搖床轉速對乙醇產量的影響

搖床可以排出發酵液中生成的CO2，CO2會通過影響酵母細胞內外的pH值、細胞膜及酶來抑制酵母的生長代謝[2]。而搖床轉速對釀酒酵母的生長與發酵狀況也有一定影響，搖床能夠加速發酵過程中產生CO2的排出，并使酵母懸浮在培養液中，在一定程度上增加菌液濃度。由圖2可知，隨著搖床轉速的提高，乙醇產量有明顯的提高[12]。在搖床轉速200 r/min時，乙醇產量達到最高達到25.63 g/L；隨著發酵轉速繼續升高，乙醇產量有略微的降低。當搖床轉速為100～200 r/min時，搖床轉速越高，乙醇產量越高；當搖床轉速為200～300 r/min時，搖床轉速越高越不利于酵母菌的生長，乙醇產量越低。

2.3.3 最佳發酵液pH值的確定

發酵液pH值對乙醇產量的影響見圖3。

培養基或環境中的pH值與微生物的生命運動有著密切的聯系。培養基或環境中的pH值不光影響細胞對營養物質的吸收、促進或抑制微生物的生長，還可影響環境中有害物質對微生物的毒性；影響培養基中某些營養物質的分解或中間代謝產物的解離，從而影響微生物對這些物質的利用；并且酵母對酸度耐受性的高低是評價乙醇酵母優劣的重要指標[13]。由圖3可知，隨著發酵液pH值的提高，乙醇產量有明顯提高。在發酵液pH值4時，乙醇產量達到最高值26.98 g/L，殘糖量為3.69 g/L；發酵液pH值繼續升高，乙醇產量有明顯降低。因此，發酵液pH值為5是最適發酵液pH值。

2.3.4 最佳菌液接種量的確定

菌液接種量對乙醇產量的影響見圖4。

圖3 發酵液pH值對乙醇產量的影響

圖4 菌液接種量對乙醇產量的影響

酵母菌菌液接種量不同，其中酵母菌的含量也不同。菌液接種量過多，培養基成分會對發酵造成一定影響；這里接種量較少，不考慮培養基成分的影響，僅觀察酵母菌量對發酵的影響。菌液量過少會使得發酵速率大大降低，菌液量過多酵母菌之間會相互抑制。由圖4可知，隨著菌液接種量的提高，乙醇產量有明顯提高。在菌液接種量為10%時，乙醇產量達到最高值27.52 g/L，殘糖量為2.36 g/L；隨著菌液接種量繼續增高，乙醇產量又有明顯降低。因此，菌液接種量為10%是最佳菌液接種量。

2.4 正交試驗

正交試驗結果見表2。

由表2可知，4個因素中對乙醇產量影響的主次順序為發酵液pH值＞搖床轉速＞菌液接種量＞發酵溫度，其中發酵液pH值對乙醇產量影響最為顯著，搖床轉速次之。發酵液pH值不僅影響細胞對營養物質的吸收、促進或抑制微生物的生長，還可影響環境中有害物質對微生物的毒性；影響培養基中某些營養物質的分解或中間代謝產物的解離，從而影響微生物對這些物質的利用。搖床轉速影響了培養基中CO2的含量，影響較強；發酵溫度影響最小。

由正交試驗分析可知，最佳乙醇發酵條件為發酵液pH值4，搖床轉速200 r/min，發酵溫度30℃，菌液接種量10%。

表2 正交試驗結果

3 結論

通過對豌豆蛋白的提取工藝及對其余下的次豌豆漿發酵制備乙醇進行研究，采用酸沉法對豌豆蛋白進行提取，分析得到蛋白含量為21.68%，淀粉含量為40.68%。然后，對次豌豆漿發酵制備乙醇進行單因素試驗及在此基礎上進行正交試驗優化，最終得到最佳的發酵條件為發酵溫度30℃，菌液接種量10%，發酵液pH值4，搖床轉速200 r/min；最終乙醇產量達到28.36 g/L，糖利用率達到98%。

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Studyon the Extraction ofPea Protein and the Fermentation of Ethanol fromSub-pea Pulp

DENG Yongdong，LV Xijun，WU Xuefeng，*LI Xingjiang
（Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products in Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009，China）

TS201.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.026

1671-9646（2017） 09b-0001-04

2017-06-26

安徽省重大科技專項“利用次淀粉漿廢液發酵酒精資源綜合利用的關鍵技術研究及產業化”（15CZZ03100）。

鄧永東（1992— ），男，碩士，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：李興江（1978— ），男，博士，副教授，研究方向為發酵工程。