低溫鄰苯二甲酸二甲酯降解菌STX_2和STX_5的分離、鑒定及降解特性*

張 可 關 允 格 桑 羅鴻兵 陳 偉 陳 佳 陳 強

(1.四川農業大學土木工程學院，四川 都江堰 611830; 2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090; 3.四川農業大學資源學院，四川 成都 611130)

低溫鄰苯二甲酸二甲酯降解菌STX_2和STX_5的分離、鑒定及降解特性*

張 可1關 允2格 桑2羅鴻兵1陳 偉1陳 佳1陳 強3

(1.四川農業大學土木工程學院，四川 都江堰 611830; 2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090; 3.四川農業大學資源學院，四川 成都 611130)

在高海拔、低氣溫地區分離得到兩株以鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)為碳源的菌株STX_2和STX_5。經鑒定，STX_2和STX_5分別為假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅球菌屬(Rhodococcus)菌株。在單菌試驗的基礎上，對混菌降解DMP的條件進行了優化。結果表明，混菌在溫度為15 ℃、初始pH為8、140r/min振蕩培養72h的條件下，對1 000mg/L的DMP降解效果最好，4種表面活性劑并不能顯著提高混菌降解DMP的效果。動力學試驗表明，隨著DMP初始濃度的增加，降解速度常數降低，半衰期變長?；炀鷮Χ替溹彵蕉姿狨?PAEs)降解效果較好，而對長鏈PAEs降解效果較差。

低溫 鄰苯二甲酸二甲酯 生物降解 分離 鑒定

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類重要的有機化合物，被廣泛用作塑料助劑、油漆溶劑、合成橡膠增塑劑。由于其在工業生產中大量使用，當前PAEs已普遍存在于土壤、水體、大氣等環境介質中[1_2]。PAEs是一類環境內分泌干擾物，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)等對動物生殖系統具有嚴重的危害性，還對人體具有致癌風險[3]。PAEs在自然條件下的水解和光解速率很緩慢，微生物降解是其在自然環境中完全礦化的主要途徑[4]。近年來，PAEs微生物降解的研究工作主要針對鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)，已分離出的DBP降解菌有紅球菌屬(Rhodococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等[5_6]。對于DMP的降解菌研究相對較少，低溫條件下降解DMP更加困難，還未見相關研究報道。

本研究在高海拔的低溫地區河流沉積物中分離得到兩株以DMP為碳源的菌株，分別進行16S rDNA和鄰苯二甲酸雙加氧酶基因擴增、T/A克隆鑒定。在單菌降解DMP試驗的基礎上進行混菌培養，研究了其在不同溫度、初始 pH、表面活性劑條件下的DMP降解特性，以期為低溫條件下DMP等PAEs的微生物修復提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品采集

沉積物樣品采集于四川省阿壩州茂縣土門鄉境內，該區域海拔高、氣溫低，最高海拔達3 200 m，年均氣溫為11.0～13.7 ℃。采用多點采樣法采集樣品，混合后4 ℃保存。

1.2 培養基的配制

無機鹽液體培養基:MgSO4·7H2O 0.40 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，K2HPO41.50 g，KH2PO41.50 g，FeSO4·7H2O 0.04 g， NaNO30.50 g，(NH4)2SO41.00 g，FeCl30.15 g，H2O 1 000 mL。

LB液體培養基:酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 mL，調節pH=7。

在無機鹽液體培養基和LB液體培養基的配方中加入20 g 瓊脂即制成相應的固體培養基。PAEs濃度根據實際需要加入到無機鹽液體培養基中。

1.3 菌株分離與純化

稱取5 g沉積物樣品，置于DMP質量濃度為200 mg/L的無機鹽液體培養基中。于140 r/min、15 ℃條件下培養7 d，以10%(體積分數，下同)接種量轉接至DMP質量濃度為400 mg/L的無機鹽液體培養基中，重復上述培養和接種過程，逐漸提高無機鹽液體培養基中的DMP質量濃度至1 000 mg/L。再轉接至LB液體培養基中富集，取富集液涂布在含1 000 mg/L DMP的無機鹽固體培養基上，在15 ℃恒溫箱培養至長出單菌落，挑取12個單菌落轉接至含DMP 1 000 mg/L的無機鹽液體培養基中，于140 r/min、15 ℃條件下培養，篩選出DMP降解效果最好的兩個菌落，分別編號為STX_2和STX_5，并轉接至LB固體培養基，4 ℃保存。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 菌株的生理生化

用鏡檢法觀察菌體形態。生理生化鑒定參見文獻[7]，其中乙酰甲基甲醇試驗采用Barritt氏法，吲哚試驗采用Ehrlich法。

1.4.2 DNA提取與聚合酶鏈式反應(PCR)擴增

采用DNA提取試劑盒提取菌組的16S rDNA。PCR擴增采用細菌通用物27F(5’_AGAGTTTGATCCTGGCTCAG_3’)和1492R(5’_TAGGGCTACCTTGTTACGACTT_3’)。擴增體系:PCR Mix 15 μL，DNA模板1 μL，引物各0.2 μL，超純水補足至30 μL。PCR擴增程序:95 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min；56 ℃退火1 min；72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸7 min。

1.4.3 克隆測序

將PCR擴增產物用Universal DNA純化回收試劑盒純化后與pGM_T載體連接，轉入大腸桿菌DH_5α感受態細胞，通過氨芐抗性及藍白斑初步篩選陽性克隆進行測序。利用BLAST軟件在GenBank中進行同源性比對，利用Neighboring_joining 方法在MEGA 6.0軟件中進行系統發育樹構建。

1.5 菌株鄰苯二甲酸雙加氧酶基因的克隆

利用正向引物5’_ACACSCCBCARACSCACAC_3’和反向引物5’_CTTGTCCTGCTACAGCTCTTG_3’進行菌株鄰苯二甲酸雙加氧酶基因的PCR 擴增[8_9]。擴增體系:PCR Mix 15 μL，DNA模板1 μL，引物各0.1 μL，超純水補足至25 μL。PCR擴增程序:95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；56 ℃退火1 min；72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸8 min。 PCR擴增產物的回收、連接、轉導、克隆、測序方法同 1.4.3節。

1.6 DMP降解試驗

將LB固體培養基上的單菌落轉接至LB液體培養基中，于140 r/min、15 ℃條件下培養36 h后離心收集菌體，用不含DMP的無機鹽液體培養基重懸，作為母液。均以1%的接種量接種STX_2和STX_5，加入到含不同濃度DMP的無機鹽液體培養基中培養，并定時測定培養基在600 nm處的光密度(OD600)，用于表征菌株生物量，同時測定DMP濃度并計算降解率。分別考察溫度、初始pH、表面活性劑對DMP降解特性的影響。同時，考察混菌降解DMP動力學過程和混菌對其他PAEs的降解效果。

采用Aglient 1200系列的高效液相色譜儀(HPLC)測定DMP的濃度。色譜柱為Inertsil ODS_2151_K(6 mm×150 mm)，柱溫為40 ℃，流動相為甲醇∶水(體積比為90∶10)，流速為0.5 mL/min，進樣量為20 μL。采用UV_1800紫外—可見分光光度計測定OD600。

2 結果與討論

2.1 菌株鑒定結果

STX_2菌體呈橢圓形、無芽孢，菌落為圓形、淡黃色、表面濕潤光滑、邊緣規則；STX_5菌體呈短桿狀，菌落為圓形、橙紅色、不透明、表面濕潤光滑。其他生理生化特性見表1。

表1 菌株STX_2和STX_5的生理生化特性1)

注:1)+表示陽性；_表示陰性。

圖1 菌株16S rDNA 系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strains by 16S rDNA

圖2 菌株鄰苯二甲酸雙加氧酶基因系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains by phthalate dioxygenase gene

菌株STX_2和STX_5的16S rDNA分別獲得1 433、1 344 bp，GenBank登錄號分別為KR611863、KR611864，構建系統發育樹如圖1所示。從圖1可以看出，STX_2與異化硝酸鹽還原菌(Pseudomonasalcaliphila) JCM 10630(GenBank登錄號為AB030583)相似性為100%，歸屬于假單胞菌屬；STX_5與帶化紅球菌(Rhodococcusfascians) ATCC 12974(GenBank登錄號為X79186)相似性為100%，歸屬于紅球菌屬。假單胞菌屬廣泛存在于環境中。近年來，具有污染物降解能力的假單胞菌不斷被人們從環境中分離出來。張宏波等[10]從多環芳烴污染土壤中分離出能高效降解芘的3株假單胞菌屬菌株。王繼華等[11]從曝氣池污泥中分離到能降解苯胺的假單胞菌屬菌株。對于紅球菌屬菌株在低溫條件下對污染物的降解目前主要報道的是對氯氰菊酯和苯酚類污染物[12]。

2.2 菌株鄰苯二甲酸雙加氧酶基因的克隆與分析

菌株STX_2和STX_5的鄰苯二甲酸雙加氧酶基因構建系統發育樹，結果見圖2。STX_2和STX_5的鄰苯二甲酸雙加氧酶基因序列與施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri) (GenBank登錄號為U26262)、RhodococcusDK 17(GenBank登錄號為AAR90178)質粒上編碼鄰苯二甲酸雙加氧酶的基因序列相似度分別為99%、100%，說明STX_2和STX_5與目前報道的微生物好氧降解DMP機制相吻合[13_15]。

2.3 環境因子對混菌降解DMP的影響

2.3.1 溫度對混菌降解DMP的影響

在初始pH為7、140 r/min振蕩培養72 h條件下，考察溫度對混菌降解1 000 mg/L 的DMP的效果，結果如圖3所示。由圖3可見，經72 h培養后，溫度為15 ℃的條件下，混菌對DMP的降解率最高，達到76.3%。以往對PAEs降解菌的研究中，分離出的菌株最適降解溫度通常為25～37 ℃，在低溫10～20 ℃的條件下降解率很低。金雷等[16]101曾從長期受垃圾污染的土壤中分離出1株DBP降解菌，在30 ℃時降解率最高。因此，菌株STX_2和STX_5適合在海拔高、氣溫低的地區降解DMP等PAEs。

圖3 溫度對混菌降解DMP的影響Fig.3 Effect of temperature on DMP degradation by strains

2.3.2 初始pH對混菌降解DMP的影響

在15 ℃、140 r/min振蕩培養72 h的條件下，考察了初始pH對混菌降解1 000 mg/L的DMP的影響。由圖4可見，在pH為8時， 混菌對DMP的降解率最高，達89.4%?；炀趬A性條件下對DMP的降解率明顯高于酸性條件，這可能與菌株在降解DMP過程有鄰苯二甲酸、原兒茶酸等酸性物質產生有關[17]。在單菌降解DPM試驗時發現，兩種菌株均在pH為7時具有最高降解率，混菌的最適pH向堿性偏移。在相同條件下，混菌對DMP降解率高于單菌，推測可能是由于紅球菌在降解過程中產生的酸性中間產物正好可被假單胞菌利用[16]106，對反應體系中的pH起到緩沖作用。目前已有研究發現，菌株組合能促進污染物的降解，但其相互關系仍不清楚，其篩選和組合仍是一個相對隨機的過程，有待進一步研究。

圖4 初始 pH對混菌降解DMP的影響Fig.4 Effect of initial pH on DMP degradation by strains

2.3.3 表面活性劑對混菌降解DMP的影響

DMP水溶性低、微生物可利用性差，表面活性劑可強化其微生物降解性能。DAS 等[18]研究印度東北部石油烴污染土壤中枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌產生的生物表面活性劑(BS)對多環芳烴的降解效果時發現，加入 BS后芘溶解度提高5 倍，微生物降解效果明顯提高。眾多研究表明，鼠李糖脂對污染物的微生物降解均有促進作用[19_20]。在15 ℃、初始pH=8、140 r/min振蕩培養72 h的條件下，考察4種不同濃度的表面活性劑(質量分數為0～3%)對混菌降解800 mg/L的DMP的影響，結果見圖5。由圖5可見，十二烷基硫酸鈉(SDS)和鼠李糖脂質量分數為1%～3%時與0相比，均表現出顯著抑制作用。1%的曲拉通和吐溫_80可以提高混菌對DMP的降解率，但影響不大；2%、3%的曲拉通和吐溫_80反而表現出顯著的抑制作用。因此，本研究所研究的4種表面活性劑并不能顯著提高混菌降解DMP的效果。

注：字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著，圖7同。

圖5表面活性劑對混菌降解DMP的影響
Fig.5 Effect of surfactant on DMP degradation by strains

2.4 混菌對DMP的降解動力學

為了解混菌對DMP的降解動力學，在15 ℃、pH=8、140 r/min、不添加表面活性劑的條件下，對其在不同濃度DMP中的降解特性進行了考察，降解曲線見圖6。對曲線按一級反應動力學方程(見式(1))進行擬合。

lnc=_kt+A

(1)

圖6 混菌對不同初始質量濃度DMP的降解曲線Fig.6 Degradation curve of different DMP concentrations by strains

式中：c為DMP質量濃度，mg/L；k為降解速率常數，h_1；t為時間，h；A為常數。

半衰期根據式(2)進行計算。

t1/2=ln2/k

(2)

式中：t1/2為半衰期，h。

混菌對不同初始質量濃度DMP的降解動力學參數如表2所示。由表2可以看出，隨著DMP初始濃度的增加，降解速度常數降低，半衰期變長。

表2 混菌對不同初始質量濃度DMP的降解動力學參數

2.5 混菌對其他PAEs的降解效果

為了測定混菌對其他PAEs的降解效果，將其分別接種到含800 mg/L的DBP、鄰苯二甲酸二(2_乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸(PA)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DINP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)的無機鹽液體培養基中，在15 ℃、pH=8、140 r/min、不加表面活性劑的條件下培養60 h時后，對OD600進行測定，結果如圖7所示?；炀诤珼EHP、DINP、DOP的無機鹽液體培養基中培養后OD600小于0.35，而在含DBP、DEP、BBP、PA的無機鹽液體培養基中OD600高于0.58，說明混菌能利用短鏈PAEs，但長鏈PAEs對混菌有抑制作用，且不同的長鏈PAEs(DEHP、DINP、DOP)具有顯著差異(P<0.05)。FANG等[21]也發現，PAEs降解菌能快速降解短鏈的DMP、DEP，而對長鏈的DEHP降解速率很慢。

圖7 混菌對其他PAEs的降解效果Fig.7 Degradation effects of strains on other PAEs

3 結 論

(1) 從高海拔、低氣溫地區分離到兩株以DMP為碳源的菌株STX_2和STX_5，經鑒定分別為假單胞菌屬和紅球菌屬。

(2) 混菌在溫度為15 ℃、初始pH為8、140 r/min振蕩培養72 h的條件下，對1 000 mg/L的DMP降解效果最好，4種表面活性劑并不能顯著提高混菌降解DMP的效果。

(3) 動力學試驗表明，隨著DMP初始濃度的增加，降解速度常數降低，半衰期變長。

(4) 混菌對短鏈PAEs降解效果較好，而對長鏈PAEs降解效果較差。

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Isolation,identificationanddegradationcharacteristicsofdimethylphthalatedegradationstrainsSTX_2andSTX_5atlowtemperature

ZHANGKe1,GUANYun2,GESang2,LUOHongbing1,CHENWei1,CHENJia1,CHENQiang3.

(1.CollegeofCivilEngineering,SichuanAgriculturalUniversity,DujiangyanSichuan611830;2.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,HarbinHeilongjiang150090;3.CollegeofResources，SichuanAgriculturalUniversity,ChengduSichuan611130)

Two strains (STX_2 and STX_5) capable of utilizing dimethyl phthalate (DMP) as carbon source were isolated from high altitude area with low temperature. STX_2 and STX_5 were identified asPseudomonasandRhodococcus,respectively. Based on single strain test,DMP degradation conditions were optimized for mixed strains. Results showed that the best degradation conditions for 1 000 mg/L DMP were temperature of 15 ℃,initial pH of 8,140 r/min of 72 h. Four surfactants were inefficient to improve DMP degradation. Kinetic experiment revealed that as DMP initial concentration raised,degradation kinetic constants declined and half_time elongated. Mixed strains were easy to degradate short_chain phthalic acid esters (PAEs),but hard to degradate long_chain PAEs.

low temperature; dimethyl phthalate; biodegradation; isolation; identification

10.15985/j.cnki.1001_3865.2017.01.004

2016_01_18)

張 可，女，1982年生，碩士，講師，主要從事環境微生物及市政污水處理研究。

*國家自然科學基金資助項目(No.51278318)；四川省科技支撐計劃項目(No.2014NZ0044、No.2013SZ0103)。