青稞褐變籽粒中寄藏真菌多樣性及其致病性分析

潘 虎，達娃卓瑪，次 頓，王秋玲，李 穎，白軍平

(西藏自治區農牧科學院農業質量標準與檢測研究所，西藏 拉薩 850032)

青稞褐變籽粒中寄藏真菌多樣性及其致病性分析

潘 虎，達娃卓瑪，次 頓，王秋玲，李 穎，白軍平

(西藏自治區農牧科學院農業質量標準與檢測研究所，西藏 拉薩 850032)

【目的】研究青稞褐變籽粒中寄藏真菌的致病性?！痉椒ā坎捎闷桨宸蛛x藏青2000、藏青320、藏青85和喜拉22等4個青稞品種中的寄藏真菌，同時采用孢子懸浮液回接方法對分離真菌進行青稞籽粒致病性分析?！窘Y果】從4個品種的青稞籽粒中共分離得到86株真菌，真菌ITS區測序表明：寄藏真菌分屬于13屬19種，同時編號為22-1的菌株同源性僅為89 %，可能是一類真菌新種。對20種寄藏真菌進行青稞種子致病性分析表明：根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)、鐮刀屬真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉屬真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉屬真菌(Epicoccumsp. 320-9)、曲霉屬(Aspergillussp. 85-7)和未知種屬真菌(Endophytic fungi 22-1)等6類真菌能夠顯著降低青稞種子的發芽率，同時可引起種子褐變及腐爛，是青稞籽粒中寄藏的主要致病真菌類型?！窘Y論】青稞褐變籽粒中存在多種致病能力較強的寄藏真菌。

寄藏真菌；褐變；藏青2000；藏青320；藏青85；喜拉22

【研究意義】青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f. ) 又稱裸大麥，是青藏高原地區重要的糧食作物，西藏青稞種植面積約占全國的57 %，年產量約100萬噸[1]。青稞富含β-葡聚糖和“生育三烯酚”，具有提高免疫力和抗腫瘤等作用[2]，越來越多的受到全世界的廣泛關注。但落后的小農生產方式和簡陋的儲存條件導致西藏地區青稞籽粒中真菌污染較為嚴重，寄藏真菌主要引起青稞籽粒發生褐變，可降低種子發芽率和導致種苗喪失活力等，嚴重影響青稞品質；同時，部分寄藏真菌產生的毒素可導致大骨節病、克山病、癌癥等重大疾病[3]，嚴重影響青稞質量安全和西藏人民的身體健康?！厩叭搜芯窟M展】目前，有關青稞內生真菌的研究較少，僅2007年龔弘強等[4-5]對拉薩市尼木縣和林周縣青稞籽粒內生真菌區系研究后指出Cladosporium、Alternaria和Phoma是優勢種群，同時首次報道了從西藏地區青稞籽粒中分離得到燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)，該菌產生的毒素可引起癌癥、大骨節病、克山病等人類疾病?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對采集于西藏拉薩市尼木縣褐變青稞籽粒中的寄藏真菌進行了分離和鑒定，同時探討了寄藏真菌對青稞籽粒的致病性影響?！緮M解決的關鍵問題】明確青稞褐變籽粒中寄藏真菌的種類及其致病能力強弱，為防治由寄藏真菌引起的青稞病害提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞籽粒采集于2015年6月，為農戶家儲藏的去年產青稞籽粒，采集品種為藏青2000、藏青320、藏青85和喜拉22，采集地點為拉薩市尼木縣尼木鄉日錯村、東嘎村和尼榮村一組，每個村采集4個品種的青稞籽粒各1份，共采集青稞籽粒樣品12份。采集的青稞籽粒用無菌塑料袋包裝后 - 20 ℃ 保存備用 。

1.2 方法

1.2.1 寄藏真菌的分離篩選[6]將3個地點的同一品種青稞籽粒樣品充分混合，隨機選取50粒發生褐變的青稞籽粒，用5 %的NaClO溶液侵泡種子3 min，無菌水沖洗3次，用無菌刀將籽?？v切為2半，將縱切籽粒均勻放置于PDA培養基上，每皿擺放5顆籽粒。28 ℃黑暗培養7 d后，觀察并詳細記載長出真菌菌落的麥粒數和菌落數，對分離得到的真菌進行純化并在PDA斜面培養基上4 ℃保藏備用。

1.2.2 寄藏真菌的鑒定 ①形態學鑒定：真菌形態學鑒定參考《真菌鑒定手冊》[7]；②分子生物學鑒定：純培養物真菌使用TIANGEN公司真菌基因組抽提試劑盒提取總 DNA，然后用于目的基因的擴增。真菌PCR擴增采用通用引物 ITS1/ITS4[8]。擴增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30 個循環；72 ℃ 10 min。取 2 μl PCR 產物， 1 % 瓊脂糖電泳進行產物檢測。擴增產物送交北京億明復興生物科技有限公司測序，利用 BLAST 軟件將測定得到的基因序列與NCBI 數據庫進行序列比對分析，獲取相近菌株的ITS區基因序列，然后用 CLUSTAL X 軟件進行全序列比對，利用 MEGA 3.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系統發育樹[9]。

1.2.3 寄藏真菌對青稞籽粒的致病性[10]將分離純化得到的真菌菌株在(25±2)℃ 12 h NUV光照12 h，黑暗交替條件下PDA平板培養7 d，然后分別配制成1×106個/mL孢子懸浮液備用。隨機挑選青稞健康籽粒50粒，經1 %的NaClO溶液表面消毒干燥后，在無菌條件下用2 mL孢子懸浮液接種24 h，重復3次，并設置無菌水為對照。將接種過孢子懸浮液的種子等距離放置于培養皿中(皿中置3層濕濾紙)，每天在25 ℃光照8h，15 ℃黑暗16h條件下培養7 d，觀測種子發芽率，培養28 d后記錄青稞種子褐變率和腐爛率。

2 結果與分析

2.1 青稞籽粒寄藏真菌的物種多樣性

從4個青稞品種籽粒中共分離得到86株真菌，其中藏青2000分離得到25株真菌，藏青320分離得到26株真菌，藏青85分離得到23株真菌，喜拉22分離得到12株真菌。通過形態學初步鑒定后選取34株真菌進行分子生物學鑒定，真菌ITS區測序結果表明：34株真菌分屬于13屬19種，分別為鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、微座孢屬(Microdochium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、青霉屬(Penicillium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、附球霉屬(Epicoccum)、單端孢霉屬(Trichothecium)、根霉屬(Rhizopus)、射脈菌屬(Phlebia)、節菱孢屬(Arthrinium)和毛霉屬(Mucor)；同時有代表編號為22-1的菌株同源性僅為89 %，可能是一類真菌新種(表1)。青稞籽粒寄藏真菌物種多樣性較為豐富，但不同品種青稞籽粒中寄藏真菌種屬存在較大差異。

2.2 寄藏真菌對青稞籽粒的致病性分析

對經過鑒定的20種寄藏真菌進行青稞種子發芽率、褐變率和腐爛率等致病性分析表明：根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)、鐮刀屬真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉屬真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉屬真菌(Epicoccumsp.320-9)、曲霉屬(Aspergillussp. 85-7)和未知屬真菌(Endophytic fungi 22-1)等6類真菌能夠顯著降低青稞種子的發芽率，同時可引起種子褐變及腐爛，是青稞籽粒中的主要致病真菌類型，其中根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)可導致所有供試青稞主籽粒幾乎不萌發、籽粒褐變率達到70 %～80 %、腐爛率高達95 %以上，有待對根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)進行更深入的研究(表2)。青稞籽粒中6種主要致病真菌有4種分離自藏青2000，有4種分離自藏青320，有1種分離自藏青85，有2種分離自喜拉22，其中根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)分離自藏青2000和藏青320，藏青2000是由藏青320與拉薩白青稞雜交的F1代和喜拉19與昆侖164雜交的F1代復合雜交選育的[11]，可能寄藏真菌在青稞籽粒中有一定的種傳性。藏青2000和藏青320作為西藏推廣面積較大的青稞品種，關系著西藏的糧食安全及人民的身體健康，然而其籽粒中寄藏真菌種類較多、致病性較強，同時還具有一定的種傳性，嚴重影響西藏地區的青稞質量安全，對藏青2000和藏青320籽粒中的寄藏真菌有待進一步加強防控措施研究。

表1 青稞籽粒中寄藏真菌的初步鑒定

表2 寄藏真菌對青稞籽粒發芽率、褐變率和腐爛率的影響

續表2 Continued table 2

菌株編號發芽率(%)褐變率(%)腐爛率(%)藏青2000藏青320藏青85喜拉22藏青2000藏青320藏青85喜拉22藏青2000藏青320藏青85喜拉2285-495.095.090.095.05.05.05.05.00.00.00.050.085-5100.085.090.095.00.050.050.00.050.00.00.00.085-6100.095.085.095.00.00.00.050.00.00.10.50.185-710.035.035.030.05.010.015.010.015.010.012.512.522-145.035.070.065.00.00.00.00.010.015.015.010.022-590.090.085.090.00.050.050.10.10.00.00.00.022-895.097.597.595.05.010.010.05.07.57.55.05.0

3 討 論

青稞是西藏地區的重要糧食作物，青稞的產量和品質直接關系著西藏地區的經濟發展和社會穩定。西藏地區傳統的青稞收獲方式使青稞從收割到入庫儲藏可在田間持續露曬一個多月，而西藏大部分產糧區溫度在10～27 ℃，非常容易導致病菌滋生。寄藏真菌容易導致青稞籽粒發生褐變，嚴重的可降低種子發芽率及產生真菌毒素，危害人畜安全。本文研究表明拉薩市尼木縣4個品種的青稞籽粒中寄藏真菌物種多樣性較為豐富，但不同品種青稞籽粒中寄藏真菌種屬存在較大差異，同時與內地傳統麥類作物籽粒以Aspergillus、Penicillium、Alternaria和Fusarium等為主的優勢菌群相比有一定差異[12-13]，這可能與青稞高寒生長環境及較長的生長周期有關。目前，有關青稞內生真菌的研究較少，龔弘強等從西藏地區青稞籽粒中分離得到燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)，該菌產生的毒素可引起癌癥、大骨節病 、克山病等人類疾病，需要重點研究與防控。本文也從藏青2000和喜拉22 2個青稞品種中分離得到鐮刀屬真菌(Fusariumsp.)，同時對該屬真菌的致病性研究表明其對青稞種子具有較強的致病性，針對該屬真菌的致病機理及其防控措施有待進一步研究。

4 結 論

青稞褐變籽粒中存在較高的真菌多樣性，根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)、鐮刀屬真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉屬真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉屬真菌(Epicoccumsp. 320-9)、曲霉屬(Aspergillussp.85-7)和未知種屬真菌(Endophytic fungi 22-1)等6類真菌是青稞褐變籽粒中寄藏的主要致病真菌類型。

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Seed-borneFungiDiversityofBrowningHullessbarleyandItsPathogenicityAnalysis

PAN Hu， Da-wa Zhuoma， CI Dun， WANG Qiu-ling， LI Ying， BAI Jun-ping

(Institute of Agricultural Product Quality Standard and Testing Research, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Tibet Lhasa 850032,China)

【Objective】The pathogenicity of seed-borne funji isolated from browning hullessbarley were studied. 【Method】The seed-borne fungi were isolated from Zangqing No.2000, Zangqing No.320, Zangqing No.85 and Xila 22 using plate separation method. Meamwhile, the spore suspensions of the isolated fungi were inoculated to the hullessbarley seeds in order to find out the pathogenicity. 【Result】86 isolated fungi strains were belong to 13 genera 19 species, while the strain named 22-1 with only 89 % homology may be was a new genera of fungi.Rhizopussp. 2000-4,Fusariumsp. 2000-5,Gibberellasp. 2000-7,Epicoccumsp. 320-9,Aspergillussp. 85-7 and Endophytic fungi 22-1 were the main pathogenic fungi which can significantly reduced the genmination rate of hullessbarley seeds, caused seeds browning and decay.【Conclusion】There are many kinds of pathogenic ability seed-borne funji existed in the Browning Hullessbarley.

Seed-borne fungi; Browning; Zangqing No.2000; Zangqing No.320 ; Zangqing No.85 ;Xila No.22

1001-4829(2017)5-1078-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.016

2016-06-23

西藏自治區自然科學基金(14-35)

潘 虎(1986-)，男，陜西漢中人，碩士，助理研究員，主要從事農產品質量安全研究工作，Tel：0981-6863726，E-mail：ph2032007@126.com。

S435.123

A

(責任編輯 李 潔)