楤木皂苷A在大鼠體內的組織分布研究

郭東艷　翟秉濤　呂楊　史亞軍　范妤　王露　王媚

[摘要]楤木皂苷A為太白楤木中的主要活性成分之一。該文通過建立SD大鼠主要臟器中楤木皂苷A的LCMS/MS分析方法，同時口服灌胃楤木皂苷A 50 mg·kg-1，測定大鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）中的楤木皂苷A含量，探討體內的組織分布特征。結果顯示楤木皂苷A在SD大鼠主要臟器中的方法學考察符合要求，口服灌胃楤木皂苷A 50 mg·kg-1，在心、肝、脾、肺、腎、腦組織均有分布且在1 h或2 h 時達到最大值。在給藥后不同時間點楤木皂苷A的組織分布情況不同：給藥20 min各組織含量：肝>心>脾>肺>腎>腦；給藥1 h各組織含量：肝>脾>腎>肺>心>腦；給藥2 h各組織含量：肝>腎>心>脾>肺>腦；給藥4 h各組織含量：腎>肝>脾>心>肺>腦；給藥8 h各組織含量：脾>心>肝>腎>肺>腦。提示楤木皂苷A主要分布于肝組織，這也與太白楤木常用于治療肝臟疾病具有一定的相關性。另外，楤木皂苷A在腦組織中雖含量低但有明顯分布，提示藥物可能會透過血腦屏障，也為楤木皂苷A在腦組織的研究提供了依據。

[關鍵詞]楤木皂苷A； 組織分布； HPLCMS/MS

[Abstract]Araloside A is one of the main active ingredients of Aralia taibaiensis In this study， HPLCMS/MS analysis method of araloside A in the main organs of SD rats was established At the same time， the content of araloside A in the main organs （heart， liver， spleen， lung， kidney， brain） after oral administration with araloside A （50 mg·kg-1） were determined to explore the tissue distribution characteristics of araloside A in vivo The results showed that the methodological study of araloside A in the main organs of SD rats met the requirements， araloside A distributed in heart， liver， spleen， lung， kidney and brain tissues reached peak at 1 h or 2 h after oral administration with 50 mg·kg-1The distributions of araloside A at different time points after administration were distinct as follows： the content of araloside A at 20 min：liver>heart>spleen>lung>kidney>brain； the content of araloside A at 1 h： liver>spleen>kidney>lung>heart>brain； the content of araloside A at 2 h： liver>kidney>heart>spleen>lung>brain； the content of araloside A at 4 h： kidney>liver>spleen>heart>lung>brain； the content of araloside A at 8 h： spleen>heart>liver>kidney>lung>brain Therefore， araloside A was mainly distributed in liver tissue， which had a certain correlation with the common use of Aralia taibaiensis in the treatment of hepatic disease In addition， araloside A shows a low content but an obvious distribution in brain tissues， which indicates that the drug can pass through bloodbrain barrier， and provides the basis for the study of araloside A in brain tissue

[Key words]araloside A； tissue distribution； HPLCMS/MS

楤木皂苷A（araloside A）為楤木屬植物太白楤木Aralia taibaiensis的主要活性成分之一，含量約占太白楤木藥材質量的12%，其化學結構見圖1。具有抗潰瘍、抗腫瘤、促纖溶、降血糖、抑制腎素活性等藥理作用[15]。1961年，楤木皂苷A首次被前蘇聯學者Kochetkov N K等[6]從遼東楤木中分離得到，并運用化學法初步確定其結構。隨后的幾十年，有關楤木皂苷A的研究報道主要集中在藥效方面，而相關的藥代動力學研究僅有2篇報道，1篇是Iskenderov G B等[7]1991年發表，而另1篇Qi D等[8]以楤木皂苷A作為指標成分之一，對竹節參提取物進行藥動學研究。眾所周知，1個藥物能否發揮藥效，在一定程度上是由胃腸道的吸收和靶器官的濃度決定。藥物口服吸收進入機體后，將通過循環系統轉運至機體的各組織臟器中，藥物分布的特征不僅與機體各部位的生理特征有關，而且與組織親和力，化合物自身的理化因素等密切相關。這將使藥物在體內各組織分布產生差異性，從而影響藥物的治療效果和藥物的蓄積以及毒副作用[9]。課題組前期已對楤木皂苷A的體內吸收進行了相關研究。本文擬在前期研究基礎上，探討楤木皂苷A的組織分布特征，了解其在體內各主要器官的濃度，為藥物的研究、開發及藥物作用至靶器官或更理想的靶部位提供參考。endprint

1材料與方法

11儀器與試劑

島津Nexera XR LC20AD 高效液相色譜儀（日本Shimadzu；Dgu20A3RDegassing Unit；SIL20AXRAutosampler；CTO20A Prominence Column Oven）；AB Sciex Qtrap 4500型質譜儀（美國AB Sciex公司）；GeneSpeed X1型微量離心機（香港基因有限公司）；BT25s型電子分析天平（天美控股有限公司）；miVac樣品濃縮儀（英國GeneVac公司）。

楤木皂苷A（批號150916，純度>98%，成都普菲德生物技術有限公司 ）；川續斷皂苷Ⅵ（批號160211，純度>98%，成都普菲德生物技術有限公司）；甲醇和乙腈（Adamas Reagent，色譜級）。

健康的SD大鼠30只，雌雄各半，體質量（230±20） g，購于第四軍醫大學動物試驗中心，動物合格號SCXK（軍）20120007。

12色譜質譜條件

121色譜條件色譜柱采用Hypurity C18（46 mm×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃，流速08 mL·min-1，進樣量5 μL，流動相A 01%甲酸水，B為乙腈，洗脫程序：0～6 min，35%～50% B；6～8 min，35% B；在203 nm波長下測定。

122質譜檢測條件離子源采用ESI源；檢測方式為負離子檢測；采用MRM方式進行掃描；離子化電壓-4 500 V，氣簾氣35 psi（1 psi=6895 kPa），離子源溫度550 ℃，噴撞氣Medium，噴霧氣150 psi，輔助加熱氣250 psi。楤木皂苷A和內標的離子對及質譜參數，見表1。

13樣品溶液的配制

楤木皂苷A儲備液：精密稱量楤木皂苷A 1 mg，用50%甲醇溶解，制成質量濃度約為1 000 mg·L-1的儲備液。楤木皂苷A工作液：精密量取儲備液5，10，25，50，100，250，500，1 000 μL于離心管中，加入50%甲醇配制成不同系列濃度工作液，使得楤木皂苷A的質量濃度為50～1萬mg·L-1。川續斷皂苷Ⅵ儲配液：精密稱量內標川續斷皂苷Ⅵ 05 mg，用50%甲醇溶解，制成質量濃度約為50 mg·L-1的儲備液。川續斷皂苷Ⅵ工作液：精密量取儲備液適量于離心管中，加入50%甲醇，制成質量濃度約為2 mg·L-1的工作液。質量控制樣品：精密量取楤木皂苷A 10 μL，添加川續斷皂苷Ⅵ工作液10 μL于15 mL離心管內經濃縮儀干燥，再添加200 μL空白組織液，制得質量濃度約為5，500，4 000 mg·L-1的質量控制溶液。

14組織樣品采集[1012]

清潔級雌雄各半的SD大鼠30只，給藥前15 h禁食不禁水。以楤木皂苷A 50 mg·kg-1灌胃給藥（給藥體積為10 mL·kg-1），給藥后分別在033，1，2，4，8 h處死，立即解剖采集心、肺、肝、脾、腎、腦；生理鹽水洗凈，置于-20 ℃冷凍保存。

15組織樣品的處理[1315]

精密稱取各組織05 g，用生理鹽水洗凈，2倍量蒸餾水勻漿，從中取200 μL組織液，添加10 μL的川續斷皂苷Ⅵ，再添加乙腈600 μL渦旋2 min，13 000 r·min-1離心10 min后吸上清經濃縮儀干燥，200 μL色譜甲醇復溶殘渣后過022 μm濾膜，吸5 μL進樣分析。

16數據處理

采用Microsoft office Excel軟件進行數據統計和處理。數據測定值采用均值±標準差表示。

2結果

21方法學考察[1618]

211專屬性取空白肝臟、空白肝臟組織中添加楤木皂苷A（50 μg·L-1）和內標川續斷皂苷Ⅵ（2 mg·L-1），實測肝臟組織樣品（口服楤木皂苷A 2 h），按相應方法處理后進行分析，考察方法的特異性。結果表明，空白肝臟組織中沒有物質干擾楤木皂苷A及川續斷皂苷Ⅵ的測定，表明該方法的特異性良好，見圖2。

212線性范圍與定量下限精密吸取一定量的楤木皂苷A溶液，加入10 μL內標川續斷皂苷Ⅵ溶液和200 μL空白組織液，配制成5，10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L-1的楤木皂苷A標準添加組織樣品，處理后進行加權（1/X2）計算，見表2。

最低檢測限（LLOD）的S/N≥3；定量下限（LLOQ）的S/N≥10。取LLOQ濃度質控樣品，按相應方法求出楤木皂苷A的濃度。

213精密度與準確度取3個不同濃度質控溶液，按相應方法求出楤木皂苷A的濃度。于1 d內測6次，3 d測3批，計算批內、批間 RSD（%）和RE（%），見表3。

214基質效應與提取回收率取空白組織液200 μL，先加入楤木皂苷A，再加入600 μL乙腈，渦旋離心后吸上清用濃縮儀干燥，取200 μL甲醇復溶殘渣后過022 μm濾膜，吸5 μL進行分析，所得峰

A 空白肝組織勻漿液；B空白肝組織勻漿液加對照品及內標；C大鼠口服灌胃2 h后肝組織勻漿液；1楤木皂苷A；2川續斷皂苷Ⅵ。

。

面積記為A。取空白組織液200 μL，先加入600 μL乙腈，渦旋離心后吸上清用濃縮儀干燥，再加入一定量楤木皂苷A，渦旋混勻2 min后過022 μm濾膜，吸5 μL進行分析得數據記為B。取用流動相配制的楤木皂苷A 50 μL，混合均勻，吸5 μL進行分析得數據記為C。楤木皂苷A的提取回收率=A/B×100%，基質效應=B/C×100%，見表4。

215穩定性①反復凍融：取3個不同濃度質控溶液，在-20 ℃和室溫之間分別凍融 3 次，按相應endprint

方法算出楤木皂苷A的濃度，考察組織樣品是否有影響；②進樣室放置穩定性：取3個不同濃度質控樣品，按相應方法在進樣室放置6 h進樣，考察組織樣品是否受影響；③-20 ℃保存：取-20 ℃放置的3個不同濃度質控樣品，在放置30 d后按相應方法在當天的標準曲線上求出楤木皂苷A的濃度，考察藥物在組織中是否有影響；④4 ℃保存：取4 ℃保存的3個不同濃度質控樣品，在放置24 h后按樣品處理方法操作，在當天的標準曲線上算出楤木皂苷A的濃度，考察藥物在組織中是否有影響，見表5。

22組織分布研究

SD大鼠口服給藥楤木皂苷A（50 mg·kg-1），在各組織中的CT數據見表6。SD大鼠口服給藥 50 mg·kg-1后，在心、肝、脾、肺、腎、腦組織均有分布且在1 h或2 h 時達到最大值。在給藥后不同時間點楤木皂苷A的組織分布情況不同，給藥033 h各組織含量：肝>心>脾>肺>腎>腦；給藥1 h各組織含量：肝>脾>腎>肺>心>腦；給藥2 h各組織含量：肝>腎>心>脾>肺>腦；給藥4 h各組織含量：腎>肝>脾>心>肺>腦；給8 h各組織含量：脾>心>肝>腎>肺>腦。結果表明，楤木皂苷A在肝臟中的含量較其他組織高，在腦中的濃度相對較少。

3討論

實驗中組織樣品的處理比較了甲醇、乙腈以及二者混合的沉淀效果，發現乙腈能夠提供更高的回收率和更好的重現性，且組織勻漿液無其他物質干擾，而方法分析速度快，專屬性好，操作簡便，故最終選用色譜乙腈沉淀蛋白作為組織液的前處理方法。

本實驗研究了口服灌胃楤木皂苷A后8 h內5個時間點的組織分布情況，包含組織分布的吸收、平衡和消除相。大鼠灌胃楤木皂苷A后，原型藥物在不同組織的分布有著不同的速度與程度，脾、肺在給藥1 h達峰，而心、肝、腎、腦在給藥2 h達峰?？诜髽B木皂苷A在肝臟中的藥物濃度較高，提示與藥物可能在肝臟中代謝有關；其次是腎臟，提示與藥物主要在腎臟排泄相關，也可能與肝腎組織的血流大、循環好有關，因此楤木皂苷A的轉運量也相應較大；接著依次為脾臟、心臟和肺。楤木皂苷A主要分布于肝臟，也與太白楤木常用于治療肝臟疾病具有一定的相關性。另外，楤木皂苷A在腦組織中雖含量低但有明顯分布，提示藥物可能會透過血腦屏障，也為楤木皂苷A在腦組織的研究提供了依據。

[參考文獻]

[1]Lee E B，Kim O J，Kang S S，et alAraloside A， an antiulcer constituent from the root bark of Aralia elata[J]. Biol Pharm Bull，2005，28（3）： 523.

[2]Liu Y，Liu J F，Liu Z H，et alThe antitumor effects of araloside A extracted from the root bark of Aralia elata on human kidney cancer cell lines[J]. Afr J Pharm Pharm Sci，2011， 5（4）： 462.

[3]洪良健楤木和太白楤木中抗糖尿病皂苷成分的研究[D]西安：第四軍醫大學， 2012.

[4]錢麗娜竹節參中脂溶性成分的研究[D]武漢：武漢工業學院，2009.

[5]Saori T，Kazuyuki H，Mika H，et alInhibition of human rennin activity by saponins[J]. Biomed Res，2010， 31（2）：155.

[6]Kochetkov N K，Khorlin A J，Vaskovsky V E，et alTriterpene saponins Triterpene saponins I saponins from Aralia manschuric[J]. Zhur Obschei Khim，1961，31：658.

[7]Iskenderov G BThe metabolism of araloside A [J]. Farmakol Toksikol， 1991， 54（6）：33.

[8]Qi D， Yang X， Chen J， et al Determination of chikusetsusaponin V and chikusetsusaponin Ⅳ in rat plasma by liquid chromatographymass spectrometry and its application to a preliminary pharmacokinetic study[J]. Biomed Chromatogr， 2013，27（11）：1568

[9]胡嵐嵐生物樣本中鉤藤堿的濃度測定及其動物體內藥代動力學和組織分布研究[D]重慶：第三軍醫大學， 2013：74.

[10]Zhang R，Zhu H，Ding L，et al Determination of asperosaponin Ⅵ and its active metabolitehederagenin in rat tissues by LCMS/MS： application to a tissuedistribution study[J]. J Chromatogr B，2014，959： 22.

[11]Rachumallu R， Manisha B， Rajbir S，et al Plasma pharmacokine tics， bioavailability and tissue distribution ofagnuside following peroral and intravenous administration in miceusing liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. J Pharm Biomed Anal， 2016， 125： 154.endprint

[12]蓋蕓蕓人參皂苷CK在大鼠體內的組織分布及排泄研究[D]煙臺：煙臺大學，2007：80.

[13]李國龍伴生物質對知母皂苷類成分體內過程的影響研究[D]咸陽：陜西中醫藥大學，2015：53.

[14]劉卓，歐陽輝，李志峰，等. α常春藤皂苷鈉鹽在大鼠體內藥代動力學及組織分布研究[J]. 中國中藥雜志，2016， 41（13）：2543

[15]何凡，孫小玲，宿亞柳，等. 人參皂苷Rg3及其代謝產物在大鼠體內組織分布研究[J]. 中藥藥理與臨床， 2015， 31（4）：14

[16]Anu M， Bidur B， Lee M R，et al Determination of phenylbutyric acid and its metabolite phenylacetic acid in different tissues of mouse by liquid chromatogr amphy with tandem mass spectrometry and its application in drug tissue distribution[J]. J Chromatogr B，2012，903：118.

[17]Zheng Y L，Hu X J，Zhai Y，et al Pharmacokinetics and tissue distributio n study of camellianin A and its major metabolite in rats by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B，2015，997：200.

[18]Zheng Z X，Tang Y B，Lv H Y，et al Determination of meserine， a new candidate for Alzheimer′s disease in mice brain by liquid chromatographytandem mass spectrometry and its application to a pharmacokinetic and tissue distribution study[J]. Anal Bioanal Chem， 2014， 406：3451.

[責任編輯張燕]endprint