氣質聯用法測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量

呂昱+王立雄+嚴敏+田仁奎

摘 要：采用固相萃?。⊿PE）結合氣相色譜-質譜聯用法建立測定醬油中氨基甲酸乙酯含量的方法，醬油試樣經過C18萃取柱凈化提純后，用丙酮-二氯甲烷溶液進行洗脫后進行氣相色譜-質譜聯用儀（GC/MS）檢測，利用選擇離子掃描模式以及外標法進行定性定量分析。氨基甲酸乙酯在1-10μg/mL濃度范圍之間線性關系良好，r2=0.9938，檢測限為0.014μg/mL，定量限為0.048μg/mL，加標回收率為97.78%（n=6），用這種方法對貴州地區市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量檢測，結果在340-440μg/mL之間。

關鍵詞：氣相色譜-質譜聯用；氨基甲酸乙酯；市售醬油；外標法

中圖分類號：O658.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）33-0067-03

1 概述

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種具有基因致癌的多位點致癌物質，在2007年2月被國際癌研究機構將其從2B類（“可能令人類患癌的物質”）升級為2A類（“能令人類患癌的物質”）致癌物質[1]，[2]，但是在它被定義為可能致癌物質以前，它曾經在醫學上作為抗腫瘤藥物和麻醉劑使用過[3]。它是發酵食品（如醬油、腐乳、奶酪）和酒精飲品在發酵過程中的中間產物[4]。

醬油是我國各大菜系中一種傳統的調味品，它是用豆、麥或者麩皮釀造的液體調味品，因為這種釀造技術屬于發酵工程，在發酵過程中容易發生各種復雜的化學反應，生成如氨基甲酸乙酯、氯丙醇、酚醛類等物質。其中氨基甲酸乙酯這一物質作為一種2A類致癌物質，它具有生物遺傳毒性，在進入人體后會對免疫系統造成不可逆的損傷，它在人體內被細胞色素P450氧化后，氧化產物能夠誘導Cμ2+調控的DNA發生損傷，從而導致癌變[5]。所以越來越多的國家認識到這種物質的危害性，國際上現行的氨基甲酸乙酯的檢測方法是氣質聯用檢測法[6]，我國目前對醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定及檢測方法尚無標準，本研究以固相萃取結合GC/MS建立一種使用外標法來測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量的方法，為貴州地區市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定參考。

2 試驗材料、試劑及儀器

正己烷使用液：（色譜純）天津市化學試劑廠

二氯甲烷使用液：（分析純）成都金山化學試劑有限公司

甲醇使用液；（分析純）純度≥99.5%，天津市富宇精細化工有限公司。

丙酮使用液；（分析純）天津市康科德科技有限公司

氨基甲酸乙酯標準品；

1號醬油；味莼園牌黃豆醬油，貴陽味莼園食品有限公司

2號醬油；味莼園牌特鮮醬油，貴陽味莼園食品有限公司

3號醬油；味莼園牌衛生醬油，貴陽味莼園食品有限公司

4號醬油；味莼園牌鮮醬油，貴陽味莼園食品有限公司

5號醬油；黃豆醬油，貴陽市白云區醬菜廠

氣相色譜-質譜聯用儀；安捷倫公司7890A/5975C型GC/MS

實驗室專用超純水機；四川沃特爾科技發展有限公司

固相萃取儀；12位方缸固相萃取裝置，月旭材料科技（上海）有限公司

3 實驗條件

3.1 儀器條件

進樣口溫度230℃，初始柱溫100℃保持3min，階升20℃至180℃，后運行230℃保持2min，分流模式，分流比1：10，溶劑延遲2min，全掃描模式。

3.2 固相萃取條件

醬油中成分復雜，基質種類繁多，極容易對檢測結果造成干擾，所以在進行儀器分析方法檢測含量之前對醬油進行預處理，盡可能的進行分離純化，將其中所含的EC提取出來[7]。由于氨基甲酸乙酯屬于極性易溶于水的物質[7]，為保證醬油中樣品檢測的回收率，經過實驗證明EC需停留在萃取柱中的萃取時間在30min，選擇添加丙酮-二氯甲烷（V/V）洗滌液來進行洗脫，而且體積比為1：9的丙酮-二氯甲烷洗脫液過C18萃取小柱時，回收效果最好。

3.3 氨基甲酸乙酯氣質聯用的定性離子的確定

建立一個氨基甲酸乙酯檢測方法，進樣口溫度230℃，選擇分流模式，分流比1：10；柱溫：初始100℃，保持3min，后20℃/min上升至180℃，后運行230℃，保持2min，輔助加熱器230℃；MS條件：溶劑延遲2min，全掃描模式，全掃描參數開始 30結束450。

以濃度為10μg/mL的EC標準溶夜進樣一次，檢測得到一個峰型較好的峰圖，對質譜圖進行Nist譜庫檢索，譜庫檢索為氨基甲酸乙酯這一物質，并確定保留時間為5.75min，確定氨基甲酸乙酯的定性離子為44、62、89，總離子流圖如圖1。

4 試驗過程

4.1 標準曲線的繪制

4.1.1 EC標準溶液的配置

用分析天平精密稱定100mg在120℃干燥至恒重的EC標準樣品，用甲醇定容至100ml得到濃度為1mg/mL的母液（冰箱里3℃存放）；準確吸取1000μL母液于100mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，所得溶液即濃度為10μg/mL的標準溶液。

4.1.2 梯度濃度的EC標液的配置

準確量取100μL、1000μL、2000μL、5000μL、10000μL濃度為10μg/mL的EC標準溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，即為0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的EC標準溶液。

4.1.3 標準曲線的制作：按照3.3的方法分別進樣5個不同濃度的EC標液，然后以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標建立標準曲線。

4.2 樣品處理

稱取1號市售醬油5mL于干燥潔凈的燒杯中，對固相萃取柱作如下處理，將固相萃取柱裝上樣，依次用2mL甲醇和正己烷活化萃取小柱，接著再用4mL純化水平衡萃取小柱。將燒杯中的醬油倒入萃取小柱中抽真空，讓醬油停留在萃取小柱中保持30min，然后將萃取小柱上的醬油緩慢抽到廢液管中，再用正己烷淋洗以洗去雜質，最后用1：9丙酮-二氯甲烷洗脫液以自然流速洗脫，洗脫液置于45℃恒溫水浴鍋中濃縮至0.3mL左右，轉移至進樣瓶中并用甲醇加至1mL，對2到5號醬油同操作。endprint

4.3 醬油中氨基甲酸乙酯含量的測定

將4.4中的1至6號醬油處理液用標簽紙做好相應標記，按順序放入GC/MS自動進樣器的旋轉盤上。調用方法，并且改變MS掃描模式為離子掃描模式，離子掃描參數44、62、89。分別進樣1至5號進樣瓶，檢測五個樣品中的氨基甲酸乙酯含量，每個樣品瓶分別進樣6次。

4.4 加標回收率試驗

取2號醬油樣品（含量約0.43μg/mL）1mL，分別添加0.5μg/mL和0.75μg/mL和1.0μg/mL的EC標準溶液各1mL，每個濃度的標準溶液都添加三份，共九份，按照3.3項下的檢測方法進行檢測，檢測出加標后的測定值。

加標回收率公式：加標回收率=（加標試樣測定值-試樣測定值）/加標量×100%。

4.5 精密度實驗

取5號醬油處理液，連續六次測定數據，計算相對標準偏差。

4.6 線性范圍

取濃度為10μg/mL的EC標準溶夜，GC/MS進樣1μL，選擇離子掃描模式檢測，以62離子作為定量離子峰，以氨基甲酸乙酯濃度為橫坐標，62離子強度為縱坐標做標準曲線[8]，在安捷倫工作站里建立曲線校正方法，得出它的線性條件和線性范圍。

4.7 檢測限的測定

取濃度為2μg/mL的氨基甲酸乙酯標準液，GC/MS進樣1μL，對其進行性能報告分析，然后根據信噪比公式D=3S/N，由此推算出學院GC/MS儀器用這種方法檢測氨基甲酸乙酯的檢測限。

5 結果分析

由實驗結果可知氨基甲酸乙酯標準溶液在1-10μg/mL濃度范圍之間線性關系良好，實驗所得線性方程為Y=2.906X-7.925（r2=0.9938）。

由性能報告峰譜圖89，所以其檢測限應該為0.014μg/mL，按照信噪比S/N為10得出定量限為0.048μg/mL。

回收率實驗的結果分析

平均回收率為97.78%，RSD為2.59%，表明該方法準確度較高，可以準確地檢測出醬油中的氨基甲酸乙酯的含量。

精密度實驗結果分析

5號醬油的相對標準偏差RSD（n=6）為6.5%，表明該儀器精密度良好。

市售醬油中的氨基甲酸乙酯含量確定

貴州地區5種市售醬油結果見表1，表明1至4號醬油中氨基甲酸乙酯濃度較5號醬油中的多。

6 結束語

經過固相萃取和液液萃取的結果分析，該方法用到固相萃取對醬油進行凈化和提純是因為EC這一物質在C18萃取柱中溶解度比在液體中的溶解度高，固相萃取法能有效分離提取醬油中EC。經過GC/MS儀器檢測后，利用系統自帶的質譜可以輕易的發現EC這一物質，雖然學院的氣質聯用儀在這個實驗中檢驗的質譜和標準譜庫中的EC質樸圖并不完全一樣，但是這是由于EC的物質結構和我們所用的質譜檢測器的檢測原理不同而造成的[9]，這并不影響實驗結果。

GC/MS檢測法的相對標準偏差為6.5%（n=6），這種方法的檢測限為0.014μg/mL，線性范圍為1-100μg/mL，加標回收率可達到97.78%，加標回收率的RSD可達2.59%，這種方法具有靈敏度高、緊密度良好、線性范圍較廣等特點，貴州地區市售醬油中氨基甲酸乙酯含量在0.34-0.44μg/mL（既是340-440μg/Ml）之間，超過20μg/L。結果表明采用SFE結合GC/MS法對貴州地區市售醬油中氨基甲酸乙酯的檢測進行定性、定量分析能達到檢測目的。

參考文獻：

[1]Lachenmeier DW.Conseqμences of IARC re-evalμation of alcoholic beverage consμmption and ethyl carbamate on food control[J].Deμtsche Lebensmittel-rμndschaμ.2007，103（7）：307-311.

[2]Internation Agency for Research cancer（IARC）.consμmption of Alcoholic Beverages and Ethly carbamate （Μrethane）.Meeting sμmmary vol 96 [EB/OL].2007-2-6.

[3]International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evalμation of Carcinogenic Risk to Hμmans[S].1974，7：111.

[4]李擁軍.SPE-GC/MS 外標法測定酒中氨基甲酸乙酯[J].中國食物與營養，2012，18（10）：51-53.

[5]陳可.醬油中氨基甲酸乙酯的定量分析與形成條件初探[D].江南大學，2012.

[6]高年發，寶菊花.氨基甲酸乙酯的研究進展[J].中國釀造，2006，162（9）：1-4.

[7]豐帆.醬油中氨基甲酸乙酯檢測方法的研究[D].天津科技大學，

2010：4-5.

[8]鐘其頂，姚亮，熊正河.采用GC/MS和HPLC-FLD2種方法測定黃酒中EC含量[J].食品與發酵工業，2007，33（3）：115-119.

[9]周萍萍，趙云峰，張珙，等.穩定性同位素稀釋技術結合氣相色譜-離子阱質譜法檢測葡萄酒中的氨基甲酸乙酯[J].中國食品衛生雜志，2007，06：492-495.endprint