遵循藥理學原理的細胞毒檢驗方法探討

趙承彥(河南省腫瘤研究院，河南 鄭州 450008)

遵循藥理學原理的細胞毒檢驗方法探討

趙承彥
(河南省腫瘤研究院，河南 鄭州 450008)

細胞毒檢驗是了解和評價機體免疫功能狀態的重要方法，歷來受免疫學家重視。51Cr釋放法是上世紀60年代建立的細胞毒活力檢驗方法，隨后又建立了多種檢驗方法，包括熒光標記流式細胞術方法，統稱為傳統細胞毒檢驗方法(TCA)。TCA方法用殺傷率表示細胞毒活力是概念應用錯誤，以效靶細胞比為條件檢測的殺傷率是實驗條件應用錯誤，違背藥理學原理，不反映細胞毒活力，沒有實用性。本文通過對TCA錯誤理念和方法條件的探討分析，遵循藥理學原理建立了一個比較實用的細胞毒活力檢驗方法。新方法以極限稀釋分析方法為基礎，以效應細胞密度為自變量，用效應細胞含有的細胞毒活性細胞頻率(CCF)和100%殺傷率限定的效應細胞密度(ID100)做細胞毒活力指標，通過量-效曲線和條件標準化測定CCF和ID100；不標記細胞，用全或無計數方法定量靶細胞；而且可以預置實驗誤差和可信度。新方法用K562細胞作為靶細胞，在96孔細胞培養板上檢測細胞毒活力，健康人外周血單核細胞(PBMC)的ID100為6.8×104/孔左右；CIK細胞ID100≤4.0×104/孔；人紅細胞的克隆抑制率為0；同一個細胞樣品，用紅細胞裂解液處理，克隆抑制率隨處理強度成比例變化；樣本批間檢測結果變異不大，表明該方法能真實反映細胞毒活力。

細胞毒性；細胞毒活力檢驗；細胞克??；極限稀釋分析方法；劑量-效應曲線

現代免疫學闡明，免疫是機體識別和排除抗原性異物的反應。免疫反應機制和反應過程非常復雜，有各種各樣的免疫細胞和免疫因子參與，協同作用，共同完成。免疫殺傷是免疫細胞和免疫因子引起感染、變異和癌變細胞死亡的反應形式，是免疫功能的集中體現。免疫殺傷既有免疫細胞的作用，也有免疫因子的作用，起殺傷作用的免疫細胞和免疫因子稱為效應細胞和效應因子，被殺傷的變異細胞稱為靶細胞。細胞毒性是指效應細胞殺傷靶細胞的作用，單純免疫因子的作用屬于藥物毒性。細胞毒活力是指效應細胞殺傷靶細胞的能力，是衡量機體免疫功能的重要指標。

細胞毒檢驗是分析和評價機體免疫反應能力的基本方法。細胞毒檢驗方法歷來為免疫學界所重視，半個多世紀來相繼建立了10多種細胞毒活力檢驗方法。51Cr釋放法[1-2]是較早建立的一種方法，該方法涉及輻射防護、污物處理和昂貴的檢測儀器，不易普及應用。隨后建立了時間分辨鑭系元素標記法[3]，各種酶釋放法[4-6]，生物發光法[7-8]，熒光標記流式細胞術方法等[9-11]，后續方法遵循同樣的方法原理和實驗條件，只是定量靶細胞方法不同，統稱為傳統細胞毒檢驗方法(traditional cytotoxicity assay，TCA)。

51Cr釋放法為世界各國所有相關實驗室接受，已經應用了半個多世紀，甚至有人將其奉為細胞毒實驗方法金標準。作者于上世紀90年代初從事細胞免疫學研究，選擇應用以51Cr釋放法為代表的多種實驗方法檢測細胞毒活力，均未獲得過滿意的實驗結果，主要表現是用同一個方法檢測同一個樣品，不同實驗室甚至同一個實驗室同一個人，不同批次之間實驗結果不相同。后來進行實驗方法考核發現，TCA的問題主要是方法原理違背細胞毒反應規律，用效靶比作變量是實驗條件應用錯誤，用殺傷率做細胞毒活力指標是概念應用錯誤，實驗結果不反映效應細胞性能。

1 傳統細胞毒檢驗方法存在原則性錯誤

1.1TCA違背細胞毒反應規律免疫細胞殺傷靶細胞相當于藥物毒性殺傷靶細胞，細胞毒性作用本質上與藥物毒性作用相似。藥理學研究表明：藥物毒性反應，效應是劑量的函數。如果用效應強度為縱坐標，劑量(濃度)為橫坐標作圖，呈二維雙曲線，將劑量改用對數值作圖，呈S型曲線，稱為量效曲線(圖1)。S型曲線表示，藥物劑量很低時不產生效應，達到閾值劑量以后效應隨著劑量增大而增強，在線性區效應隨劑量增加很快，接近飽和劑量時，效應隨劑量變化減慢。藥物毒性一般用劑量參數半數致死量(median lethal dose，LD50)和LD90作為指標[12-16]，通過測定量效曲線獲得。

圖1 量效曲線模式圖

細胞毒性反應規律與藥物毒性反應規律一樣，細胞毒效應是細胞劑量的函數，即殺傷率(killing rate,KR)是細胞密度的函數。細胞密度很低時，效靶細胞接觸機會很小，殺傷率很低；隨著細胞密度增高，效靶細胞接觸機會增多，殺傷率增高；達到飽和密度時，由于非活性細胞的阻礙作用，效靶細胞接觸機會不再增大，殺傷率也不再升高。TCA以效靶細胞比為變量檢測KR，效靶細胞比不是細胞密度，KR不體現量效關系，也不是劑量參數，不反映細胞毒活力。TCA沒有遵循藥理學實驗原理，違背細胞毒性反應規律。

1.2用殺傷率表示細胞毒活力是概念應用錯誤認識TCA的問題，需要先明確細胞毒實驗目的和細胞毒性反應原理。細胞毒實驗目的是定量分析效應細胞殺傷靶細胞的能力，了解機體細胞免疫功能狀態。細胞毒性反應是指免疫活性細胞殺傷或吞噬病原體的作用過程。免疫活性細胞有很多種類型，統稱為效應細胞。病原體包括體內變異的突變和癌變細胞，侵入體內的病原微生物等，統稱為靶細胞。細胞毒性不是所有效應細胞能夠殺傷所有靶細胞，具有選擇適應性，即一種效應細胞可以殺傷某幾種靶細胞，或幾種效應細胞可以作用于某一種靶細胞。細胞毒反應發生的條件：一是效應細胞中含有殺傷活性的免疫細胞，二是效靶細胞有接觸的機會。

殺傷率是TCA體外實驗測得的靶細胞被殺傷的比率。殺傷率的大小決定于：1)效應細胞中含有的免疫活性細胞頻率(cytotoxic cells frequency,CCF)；2)效靶細胞接觸機會。CCF是細胞樣本具有的屬性，不隨實驗條件而變。效靶細胞接觸機會決定于細胞密度。TCA檢測殺傷率不是以細胞密度為自變量，而是以效靶細胞比為實驗條件。效靶細胞比與細胞密度無關，同樣的效靶細胞比，細胞密度可以不同。維持效靶細胞比不變，可以做成許多個細胞密度，測出許多個殺傷率。同一個細胞樣本用同一個效靶比測出許多個殺傷率，而一個殺傷率反映細胞樣本細胞毒活力是不能明確的。這也是同一個細胞樣本各個實驗室，不同實驗者，不同批次，實驗結果都不相同的原因所在。殺傷率決定于實驗條件，隨實驗條件而變，而一個細胞樣本的細胞毒活力只有一個，不應該隨實驗條件變化，所以殺傷率不反映細胞毒活力。

再者，機體內的細胞密度與體外細胞毒實驗的細胞密度不是一個概念，體液內的細胞隨血液循環呈立體運動狀態，體外實驗細胞毒反應發生在平面上，細胞呈靜止狀態，兩者沒有相關性和可比性。即使TCA以細胞密度為變量測定殺傷率，因為體外無法建造與體內完全相同的細胞密度，測得的殺傷率也不反映機體細胞免疫殺傷活力。

1.3以效靶細胞比為條件檢測殺傷率是實驗條件應用錯誤效靶細胞比不影響殺傷率，TCA方法以效靶細胞比為自變量測定殺傷率，顯然認為殺傷率與效靶比有關，效靶比高殺傷率大。這種認識是不對的。TCA方法細胞毒性反應發生在平面上，效應細胞與靶細胞在平面上均勻分布，彼此之間相對靜止。效應細胞中有活性細胞，也有非活性細胞，只有活性細胞與靶細胞接觸才能發生殺傷反應。一般是效應細胞多靶細胞少。殺傷反應，細胞之間(效-效、靶-靶)沒有競爭，即一個效應細胞殺傷一個靶細胞，與其他效應細胞或靶細胞的存在沒有關系。細胞密度大，細胞之間距離小，效靶細胞接觸機會多，靶細胞被殺傷的風險大。即使一個靶細胞同時與一個或幾個效應細胞接觸，由于非活性細胞總是多于活性細胞，總有靶細胞不被殺傷。在細胞密度一定的條件下，效靶比低，相對靶細胞少，被殺傷的靶細胞也少，而沒有被殺傷的也少；效靶比高，相對靶細胞多，被殺傷的靶細胞也多，而沒有被殺傷的也多，殺傷比率不變。因此殺傷率決定于細胞密度，與效靶細胞比無關。

1.4細胞免疫殺傷活力的指標應該是效應細胞中活性細胞頻率細胞毒活力是指效應細胞產生細胞毒反應的能力，能力大小決定于效應細胞中對靶細胞敏感、能殺傷靶細胞的CCF。CCF具有樣本屬性，與免疫細胞殺傷活力直接相關，不同個體的CCF各不相同，決定細胞毒活力不同。健康人群CCF維持一個正常值水平，CCF水平低的個體免疫細胞殺傷活力會低。而且CCF在體內狀態與在體外實驗條件下一樣，不會隨實驗操作而改變。因此，CCF是理想的細胞毒活力指標。根據藥理學原理創建的細胞毒檢驗方法，可以檢測CCF。

1.5消除TCA錯誤理念的影響，建立實用的細胞毒實驗方法TCA因為不反映真實的細胞毒活力，所以至今沒有成為臨床檢驗方法。TCA的問題還沒有被認識，TCA現在還在應用，還在繼續影響細胞免疫學的研究和應用。這種狀況應該盡快改變。通過對TCA方法的認識和檢討再分析，我們建立了一個符合藥理學原理的細胞毒檢驗方法，叫做極限稀釋細胞克隆抑制試驗(limiting dilution clone inhibition assay,LDCIA)[17]。LDCIA以效應細胞密度為變量檢測殺傷率，通過量-效曲線確定100%克隆抑制率對應的效應細胞密度 (density of 100% inhibited,ID100)。ID100具有樣本屬性。健康人群的ID100有一個正常值，對應一個CCF值。只要測定樣本的ID100，通過與ID100正常值比較，就可以確定樣本的CCF。LDCIA根據極限稀釋分析方法(limiting dilution assay,LDA)[17-19]原理，用全或無計數方法定量靶細胞變化，不用標記細胞，實際應用證明是一個科學、實用的細胞毒活力實驗方法。

2 遵循藥理學原理的細胞毒檢驗方法

2.1LDCIA的基本原理

2.1.1 LDCIA實驗體系近似于體內環境條件 LDCIA是將靶細胞做極限稀釋，均勻分配至克隆單位內，平均1個單位內1個靶細胞；效應細胞按密度大小分成劑量組k，依次加入克隆單位內，每一個劑量組選定一個克隆單位數(n)。實驗體系內只有培養基、效應細胞、靶細胞。不對細胞作標記修飾。如果效應細胞沒有細胞毒性，培養3～5 d后靶細胞會生成克隆，如果效應細胞有細胞毒性，死傷的靶細胞不會生成克隆。病態靶細胞也不會生成克隆，能生成克隆都是有增殖能力的靶細胞，不存在假陽性和假性殺傷；選用的培養基不使靶細胞發生細胞衰亡，也不產生假陰性。

2.1.2 LDCIA用全或無計數方法定量靶細胞變化 靶細胞計數方法是細胞毒檢驗方法的核心技術。LDCIA成功地解決了靶細胞計數問題：1)克隆培養的靶細胞，如果未被殺傷，經過5 d左右增殖會形成10多個克隆細胞，在檢測單位內容易識別(圖2)；2)極限稀釋可以使克隆單位內平均1個靶細胞，但不會每個單位內都是1個靶細胞，有的可能是0、2、3、… x細胞。概率論證明這種不均勻分布是有規律的，分配到0、2、3、… x細胞的單位數的概率是一定的，服從Poisson分布，可以用Poisson分布函數處理。見公式1：

圖2 LD細胞陰性克隆與陽性克隆表現

A、B對照組K562在FBM里生成的陽性克隆，B有紅細胞；C細胞病理性死亡形態；D細胞衰亡形態；E、F是殺傷實驗組陰性克隆形態，靶細胞被化解，周圍較多紅細胞被推開形成一片空斑；G陽性克隆形態，克隆的靶細胞周圍較多紅細胞；H效應細胞形成的簇

2)公式1是Poisson概率分布函數(x=0)的一種特殊形式，表示陰性克隆單位概率對數的負值等于單位內靶細胞均數(μ)。根據這一屬性，實驗只需計數克隆陰性單位數(r0)，由克隆陰性單位概率可以獲得靶細胞均數(μ)。陽性克隆比較復雜，單位內的陽性克隆會有1、2、3、…x細胞多種情況，克隆陽性單位只用作鑒別陰性單位，而不管單位內是幾個克隆，多少個細胞。于是LDA將靶細胞計數變成了全或無克隆單位計數，計數簡單而準確。

2.1.3 通過量-效曲線測定具有樣本屬性的細胞毒活力指標 效/靶細胞在檢驗單位里隨機相遇發生反應，檢測單位內的靶細胞均數μ決定于Poisson分布和細胞毒作用兩方面因素。各實驗組加入的靶細胞都一樣，如果細胞毒活力為0，檢測出來的μi與空白對照組的μ0相同；如果有細胞毒作用，μi值會隨著效應細胞密度(EDi)增加而減少。這與藥物作用于細胞發生的藥理效應類似[18]，量效關系，即μi和Di(EDi簡化用Di表示)的關系為S型曲線，一定劑量范圍區間對應S型曲線的一部分(圖3)。μi和Di的關系可用公式3表示：μi=e-bDi(公式3)，兩邊取對數，lnμi=a-bDi(公式4)

圖3 μ0與靶細胞的關系

其中1)b是斜率，因CCF不同而異。a是截距，與靶細胞有關，對檢測數據作標準化處理，使a=1可以消除靶細胞差異的影響(第3節詳細論述)；2)Di是實驗預置值，μi是根據公式1計算得到的，帶入公式4求得常數項a和b，得到實際回歸方程。根據回歸方程，選定Di和μi中任意一個即可求得另一個，用于確定細胞毒活力指標。

2.1.4 LDCIA能夠通過設置實驗條件控制實驗誤差和可信度 LDCIA是一個統計學實驗方法，實驗結果的可信度和實驗誤差與樣本數有關。公式2表明，靶細胞均數μ的誤差決定于μ0，r0和n，根據Sμ和n應用方差分析可以計算出μi的可信度；反過來，確定了置信限和誤差也可以計算出樣本數n。靶細胞和效應細胞稀釋極限值(μ0和Di)與克隆單位數n可以選定。極限稀釋分析方法原理限定μ0≌1；公式1要求r0必須>1，優選值≥10。如果選定克隆單位數n，Sμ和置信限也就確定。表1是以滿足95%置信限概率P(n’,0.95)為標準，計算確定的μ0,n與r0之間的匹配值。應用表1根據實驗要求的r0和置信限，可以選定μ0和n值。表中數值表明：1)理想的實驗條件要求置信限P(n’,0.05)≥95%，r0≥10，至少需要n>36；2)如果希望n在100以內， μ0值應小于2.0；3)如果選擇μ0=3，需要n>180。LDCIA根據表1選定μ0和n，實驗獲得的μi可信度>95%。

2.1.5 細胞毒活力檢驗指標

2.1.5.2 細胞毒活力檢驗指標 本實驗室用96孔細胞培養板做載體，用K562細胞作靶細胞，健康人PBMC做效應細胞，以靶細胞μ0=1,效應細胞密度(Di)在(1～4)×104/孔范圍內，作為標準檢驗體系，通過克隆抑制率曲線檢測了26例樣本的細胞毒活力。以D=6.8×104/孔為標準計算CIR，有50%的檢測樣本CIR-=100%，均值97%，值域90%～100%；如果以CIR-=100%標準計算對應的Di，均值6.8×104/孔，值域(4.5～11.8)×104/孔。這一實驗表明，不同樣本含有的CCF不同，達到CIR-=100%的細胞密度不同，CIR-=100%對應的效應細胞密度稱為ID100。同樣，不同樣本，以相同的標準細胞密度D=6.8×104/孔為條件，檢測的克隆抑制率各不相同。標準條件下的CIR值稱為標準克隆抑制率，為了直觀，用CIR6.8表示。ID100和CIR6.8是在低密度條件下由克隆抑制率曲線測定，不能直接以D=6.8×104/孔為條件測定。ID100和CIR6.8是由特定條件界定的實驗參數，界定條件根據效應細胞類型與屬性確定。CIR6.8適用于以K562細胞作靶細胞，健康人PBMC樣本。

表1 極限稀釋法中n與μ0、r0、P(n’0.95)(%)的匹配關系表

注：P0.5(0)為μ0=0.5時克隆陰性單位概率，其余類同。P(%)為置信限概率。

2.2極限稀釋細胞克隆抑制實驗方法

2.2.1 儀器設備和試劑 LDCIA實驗需要標準細胞實驗室，主要配置為凈化工作臺、倒置顯微鏡、離心機、CO2培養箱、細胞培養板、消毒器具等。主要試劑：細胞培養液，細胞分離液等。

2.2.2 細胞克隆培養體系 根據靶細胞和效應細胞生活特性選擇適宜的培養基，確保健康的靶細胞能夠形成克隆。推薦使用適合人淋巴細胞生長的無血清培養基，克隆培養載體通常選用96或384孔透明細胞培養板?？寺挝粌鹊募毎芏纫驐l件而異，靶細胞極限值為每單位1～2，效應細胞在350～1 400·mm-2，相當于96孔板(1～4)×104/孔左右。

2.2.3 靶細胞處理方法

2.2.3.1 靶細胞選擇 細胞毒活力檢驗用的靶細胞多為傳代培養的癌細胞，如K562、A549和Raji，也有用病原體感染細胞的。靶細胞類型構成細胞毒活力檢驗體系，如K562細胞檢測體系、Raji細胞檢測體系等。靶細胞性能決定效應細胞毒活力，同一個效應細胞作用于不同的靶細胞，細胞毒活力不同，互相沒有可比性。

2.2.3.2 靶細胞處理、計數與極限稀釋 實驗前靶細胞先克隆培養幾代，保證細胞無污染，能形成克隆的活性細胞>95%。實驗用傳代1 d的靶細胞。LDCIA實驗使用靶細胞很少，以96孔板為例，一個標本300個左右。靶細胞計數要求準確，先將靶細胞粗劣計數，然后取樣直接移至細胞培養池內，用帶有網格測微器的倒置顯微鏡直接計數。極限稀釋就是將靶細胞稀釋至一個極限值：1個克隆單位內平均1～2個細胞，可以是非整數，但要準確。根據細胞數量，用培養液稀釋至終濃度為10×μ0·mL-1，然后按每個克隆單位0.1 mL均勻分配至所有克隆單位內。

2.2.4 效應細胞處理方法

2.2.4.1 外周血細胞計數 外周血細胞計數獲得白細胞濃度，為計算CCF提供依據。

2.2.4.2 外周血細胞分離 選擇常規密度梯度分離方法，操作方法可查閱有關文獻。

2.2.4.3 效應細胞計數法 效應細胞密度的準確性決定實驗結果的準確度。用血球計數板計數細胞操作簡單，但要計數準確并不容易，需要掌握正確的方法，盡量消除影響計數準確性的因素：1)計數前顯微鏡載物臺要調水平；2)計數的細胞樣品內如果帶有紅細胞，要用帶有染液的紅細胞裂解液稀釋細胞；3)取樣時細胞懸液要混勻；4)向計數池內加樣時要滴在蓋玻片邊緣的中央，不能吹向池內；5)細胞樣品濃度在1.0×106·mL-1左右計數誤差較??；6)計數的細胞數越多誤差越小。

2.2.4.4 效應細胞稀釋方法 效應細胞稀釋和分配是影響細胞密度準確性的另一個重要環節。稀釋是將計數好的細胞進行適當稀釋，首先計算總細胞數，用計數值乘以樣品量，樣品量必須計量準確，如果樣品量為1 mL左右，計數前稀釋的細胞壓積和計數取樣量都不能忽略。效應細胞稀釋分為4個密度點：1.0、2.0、3.0、4.0(×104)·mL-1，先將細胞稀釋成5.0×105·mL-1?？寺挝粩狄话闶莕=48，一個密度點的樣品量至少10 mL。稀釋從低密度做起：第1個密度點，先在稀釋槽里放5.0 mL培養液，取出1.0 mL棄之，然后取細胞液1.0 mL放入混勻，按每孔0.1 mL均勻分配至48個克隆單位內。第2和第3密度點分別取2.0 mL和3.0 mL細胞樣品，按同樣方法操作，剩余的細胞樣品補加1.0 mL稀釋液作為第4個實驗點樣品，加入培養池內。如果效應細胞是誘導培養的各類免疫細胞，直接稀釋分配。

2.2.4.5 滋養細胞制備方法 取血細胞分離的底層純紅細胞，洗滌2次用培養液稀釋成4.0×105·mL-1，按每孔0.1 mL加入對照組的克隆單位內。

2.5細胞克隆培養與克隆單位計數處理好的克隆培養板置于37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下培養?？寺∨囵B3～5 d，在倒置顯微鏡下記錄陰性克隆和陽性克隆單位數，必要時可延至7 d，超過5 d需更換培養液。

表2 LDCIA實驗數據計算用表

圖4 克隆抑制率曲線

3 LDCIA可行性檢驗

3.1穩定的LDCIA培養體系是細胞毒活力檢驗成功的必要條件極限稀釋細胞克隆培養，一個培養孔內平均只有1～2個靶細胞，單個細胞培養很難存活和生長，生成克隆更不容易。實驗證明，含有活力正常的15% FBS-DMEM,15% FBS-RPMI-1640培養基都能使健康的K562細胞生成克隆，克隆率達到90%以上，血清活力高克隆率也高，但是細胞培養過程中會有細胞分化衰亡。不含血清的DMEM、RPMI-1640及無血清培養基SFM都不能使K562細胞生成克隆，但是K562細胞也不分化衰亡。無血清培養基GT-T551既能使K562形成克隆又無細胞分化衰亡。見表3。

3.2LDCIA克隆單位計數的可行性與準確性Poisson概率分布函數從理論上把復雜的靶細胞計數變成全或無計數?？寺挝粌戎灰锌寺〉陌屑毎?，不管多少均為克隆陽性單位，無靶細胞克隆的為克隆陰性單位。靶細胞克隆是指聚集的多個靶細胞，克隆細胞多少與培養液活力、克隆時間長短有關系。陰性克隆單位是指沒有靶細胞，或靶細胞已經死亡。死亡的靶細胞膜破裂，或細胞收縮，外觀灰暗、無光澤。在LDCIA克隆單位里靶細胞很少，而且細胞形態、大小、活力狀況外貌特征與效應細胞差別明顯。陽性克隆單位里的靶細胞與效應細胞，差別明顯，容易區別。用紅細胞做滋養細胞的對照實驗，紅細胞與靶細胞明顯不同。有些效應細胞聚集形成的簇，與靶細胞克隆也明顯不同。因此陰性單位與陽性單位容易分辨，克隆單位計數準確率很高，誤差一般不超過1或2個克隆單位。如果靶細胞是貼壁細胞，計數克隆單位前將非貼壁細胞洗去，計數會更快捷、準確。見圖2。

表3 不同培養基的極限稀釋細胞克隆形成率與細胞衰亡率

3.3靶細胞分化衰亡是影響細胞毒活力檢驗的重要因素細胞生長、增殖、分化一定時期以后都會衰老死亡。衰亡是細胞衰老死亡的過程，凋亡是細胞程序死亡的形式。靶細胞衰亡在對照組和實驗組里表現一樣，與細胞毒作用無關，但是與生活環境有關，在無血清培養基里看不到細胞衰亡，加入血清以后細胞出現衰亡。在密度很低，細胞互不依附情況下，細胞凋亡形式完整可見。光鏡下細胞衰亡首先是停止增殖和分化，然后變圓和膨大，胞內出現空泡，大空泡或破滅或分解成小空泡，胞質和核變化看不清，最后胞膜破裂，胞質蛋白攤開成一片，上面黏附聚集空泡小體，有的小泡可分散到培養基里。衰亡的細胞不具有完整的細胞特征(圖2)。密集培養的細胞，眾多衰亡細胞產生的膠原黏附在一起漂浮在培養基內，看不到完整的細胞凋亡形態。在無血清或血清活力低的培養基里細胞不表現衰亡，而是呈現病理性死亡，是由饑餓、理化因素和免疫殺傷引起的死亡，表現為細胞收縮，胞膜和胞質化解，進而成碎片消失(圖2)。細胞衰亡發生在細胞有增殖分化能力的培養基里，如果不是衰亡就會形成克隆，因此在LDCIA實驗中有衰亡細胞的克隆單位是陽性單位。

衰亡是細胞生長過程中的普遍現象，我們檢查了懸浮生長的細胞K562、NS/1和貼壁生長細胞A549，在克隆培養過程中都有細胞衰亡，形態相同。51Cr釋放法等也存在細胞衰亡的問題，細胞衰亡，膜破裂標記物釋放造成假性殺傷。衰亡的靶細胞在有效應細胞的克隆單位內不易識別，影響克隆單位的準確計數。細胞毒活力檢驗必須解決好細胞衰亡的問題。解決辦法是使用具有細胞克隆活力的無血清培養基，如GT-T551培養基。本實驗室檢查了1個批次樣品，K562細胞克隆率94.5%(表3)，新配制的GT-T551克隆率達到95%以上。

3.4細胞毒活力決定于效應細胞密度與含有的活性細胞頻率

3.4.1 效靶細胞互相接觸是發生細胞毒反應的必要條件 具有細胞毒作用的免疫細胞發揮殺傷作用都需要與靶細胞接觸。體外條件下細胞不會自主運動，即使有趨化能力也是范圍有限，因此一般情況下，在體內或體外實驗體系內，效靶細胞的接觸機會是隨機的。如果克隆培養單位內的細胞密度很低，效靶細胞沒有接觸機會，即使有細胞毒活力也表現不出來。隨著細胞密度增大，效應細胞有了接觸靶細胞的機會，才有殺傷靶細胞的可能，當細胞密度大到一定程度時，每一個靶細胞至少會接觸到一個效應細胞，這時，如果每一個效應細胞都具有殺傷活力，靶細胞全部被殺傷，檢測到的細胞毒活力就是100%；如果效應細胞有一部分沒有殺傷活力，靶細胞不會被全部殺傷，檢測到的細胞毒活力低于100%。這就是說，在低密度條件下測定的細胞毒活力，有時測定值低，或等于0，不表示細胞毒活力低，或沒有活力，而是條件不具備。

3.4.2 效靶細胞在細胞毒實驗體系中的分布狀態決定細胞毒反應發生的概率 效靶細胞的形態特征和在細胞毒實驗體系中的分布狀態。以K562細胞作為靶細胞，PBMC作效應細胞為例，K562細胞直徑18～23 μm，均值21 μm；效應細胞有大有小(大型細胞群：單核細胞，直徑15～20 μm，所占比率3%～5%；中型細胞群：中性粒細胞、嗜酸、嗜堿粒細胞，直徑12 μm左右，所占比率55%～75%；小型細胞群：淋巴細胞，直徑7 μm左右，所占比率20%～40%)，兼顧細胞群的比例和直徑大小，取平均直徑11 μm。效-靶細胞直徑合計32 μm。要滿足一個靶細胞平均接觸2個效應細胞，2個效應細胞之間的距離≤32 μm，1 mm2面積上有效應細胞977個。要滿足一個靶細胞平均接觸3個效應細胞，2個效應細胞之間的距離≤28 μm，1 mm2面積上有效應細胞1 302個。以此類推。96孔和384孔培養板底面直徑分別為6 mm和2.7 mm，表面積分別為28.274 3 mm2和5.725 6 mm2。表4列出不同細胞密度條件下效靶細胞接觸類型、細胞間距以及在96孔或384孔細胞培養板中的細胞數。

表4 不同效-靶細胞接觸類型對應的細胞間距與細胞密度

3.4.3 效應細胞密度決定細胞毒性反應發生的概率 體外細胞毒活力檢驗，細胞是排列在一個平面上，一般情況下細胞是平面靠近，出現疊加機會很少。假如一個靶細胞平均接觸2個效應細胞，有時可能只接觸到1個或0個效應細胞；一個靶細胞平均接觸3個效應細胞，有時可能接觸4個或2個或1個或0個效應細胞。這相當于將效應細胞分到許多個小單位里，平均每個單位里有n細胞，但不會每個單位里都是n細胞；可能會有0、1、2、…細胞的情況。隨著n增大，即效應細胞密度增大，效靶細胞接觸機會也增加，發生反應的概率也增大。效應細胞中會有一部分不具有細胞毒活性，只有細胞毒性細胞與靶細胞接觸才能發生細胞毒性。當細胞密度達到一個靶細胞平均接觸5個以上效應細胞時，情況比較復雜，理論上1個靶細胞可以接觸5個以上效應細胞，實際上只能接觸4個或5個效應細胞，幾乎沒有機會能同時接觸5個以上效應細胞。這是由于細胞密度過大時，靶細胞接觸遠處細胞的機會受到限制(圖5)。這相當于太多細胞擠在1個小單位里，靶細胞放入以后接觸不到下層的細胞。效應細胞達到一定密度以后，再提高細胞密度不增加效-靶細胞接觸機會，稱為飽和密度效應。飽和密度條件下，細胞毒性反應發生的幾率決定于表層細胞毒性細胞比率，與細胞密度沒有關系。非飽和密度條件下，細胞毒活力既與細胞密度有關，也與細胞毒性細胞頻率有關。

圖5 2個細胞相對距離模式圖

3.4.4 克隆抑制率與效應細胞密度的關系 圖6是LDCIA以96孔培養板為載體，用PBMC作效應細胞，K562細胞做靶細胞μ0=1，改變效應細胞密度(Di)，測得的克隆抑制率(CIR-)與效應細胞密度之間的關系。3條曲線都是CIR-隨效應細胞密度增大而升高，在低密度區，CIR-隨細胞密度增加升高很快，以后變慢，逐漸達到最大值，隨后效應細胞密度再增大，CIR-不再明顯升高。各實驗組每個克隆單位內加入的靶細胞數都一樣，如果效應細胞對靶細胞沒有作用，根據極限稀釋法原理各實驗組測得的陰性單位數都相同μi=μ0,CIR-與細胞密度應該是CIR-=0的一條直線。實際測得的是曲線，表明是效應細胞作用減少了靶細胞，細胞密度越大效應越強，μi值越低。細胞樣本不同，即使細胞密度相同，細胞毒活力也不一樣。細胞毒活力決定于效應細胞中的CCF，CCF高， CIR-升高快，飽和的CIR-值也高，但是飽和CIR-對應的細胞密度值基本都在同一個效應細胞密度位置。圖6是以96孔板為載體，飽和CIR-對應的細胞密度值為每孔 4×104細胞(1 415·mm-2)左右。樣本的細胞毒活性細胞頻率是一定的，在非飽和密度條件下，克隆單位內細胞毒活性細胞數隨細胞密度增大而增多，效靶細胞接觸的機會也隨之增大，所以CIR-升高。飽和密度條件下，效靶細胞接觸的機會達到飽和值，此時CIR-只與效應細胞中細胞毒活性細胞頻率有關，CCF高，CIR-也高。圖6中CIR-1>CIR-2>CIR-3，反映效應細胞中細胞毒活性細胞頻率依次降低。表明CIR是細胞密度的函數。

圖6 CIR-與細胞密度關系曲線

圖7是用實驗值表示的μi、CIRi和lnCIR與Di之間的關系。圖7中乘以5、10和100是為了圖示直觀，把不同量值的數放在一個圖上，不改變參數屬性。μi和CIRi與Di是曲線關系，可用指數函數CIR+=ae-bD表示，μi和CIRi+是降函數，CIRi-是升函數，指數曲線是s型曲線中的一部分。指數曲線方程兩邊取對數即為線性方程，圖7表示lnCIR與Di之間為線性關系，前4個點在直線上，第5個點在飽和密度區，CIR+偏高不在直線上。

藥理學研究常用半致死劑量LD50表示藥物性能，LD50通過藥物反應量效曲線測定。細胞毒活力用全抑制率細胞密度ID100或半抑制率細胞密度ID50作為指標，能準確地體現細胞毒活力。

3.5飽和密度概念與CCF檢測方法細胞毒活力檢驗中的細胞密度一般是指效應細胞密度。飽和密度是指克隆抑制率達到最大值對應的細胞密度。飽和密度有2種：1)表觀飽和密度(modal saturated density,mSD)，LDCIA在細胞密度達到mSD以后克隆抑制率不再升高，而CIR-不一定是100%；2)實際飽和密度 (practical saturated density,pSD)，克隆抑制率CIR-=100%對應的細胞密度值，也稱為全克隆抑制率密度，用ID100表示。

圖7 CIR與mD的關系曲線

3.5.1 表觀密度與表觀飽和密度 效應細胞排列分布在載體平面上構成的細胞密度稱為表觀密度(modal density,mD)，用單位面積上的細胞數表示。以mSD為條件檢測細胞毒活力CIR-已達到最大，但CIR-不一定達到100%。效-靶細胞空間距離與細胞密度關系的論述表明，1個靶細胞平均接觸4個效應細胞一般可以達到飽和，密度再增大，效靶細胞的接觸機會不再明顯增加。這是一個理論推算值，實際情況可能是細胞有大有小，形狀也不全是圓形，免疫細胞還有趨化、聚集能力。真實的mSD以實際檢測值為準。前面一節，以96孔板為載體檢測細胞毒活力，mD在4×104/孔左右CIR-達到最大值，細胞密度再增大CIR-升高不多或不再升高。實際驗證的mSD與推算值基本一致。mSD與檢驗體系有關，同一個體系內的mSD是一個定值，不隨細胞樣本而變。

3.5.2 實際飽和密度 pSD是克隆抑制率CIR-=100%對應的效應細胞密度，pSD就是ID100。一般效應細胞中CCF都比較低，能直接測出ID100的很少。一般是以mD為變量，在低密度區設置幾個密度點檢測同一個樣本的CIR-，密度越高CIR-越大，CIR-與細胞密度在二維坐標圖上構成一條曲線，將曲線外推至CIR-=100%(CIR100)對應的細胞密度就是ID100。ID100因樣本不同而異，體現效應細胞的性能。效應細胞CIR100對應的ID100值低，表示殺傷全部靶細胞需要較少細胞數，表示CCF高，CCF與ID100呈反比例關系。

3.5.3 表觀克隆抑制率、標準克隆抑制率與細胞毒活性細胞頻率 mD和mSD是細胞毒活力檢驗實驗條件預置參數。在飽和與非飽和密度條件下檢驗的細胞毒活力意義不同。細胞毒活力檢驗，細胞以mD限定在平面上，不能自主運動，可以稀疏也可以密集，密集情況下細胞互相之間的阻礙作用會降低效靶細胞的接觸機會。平面、密集、細胞之間的阻礙現象是體外檢驗體系特有的，與體內情況不同。體內生活的細胞，特別是血液體系內的流動細胞，處于三維立體運動狀態，細胞不會過于密集，細胞之間互相接觸是隨機相遇，機會遠遠大于體外平面狀態。如果mD=977·mm-2，立體狀態時可以達到為3.05×104·mm-3。在飽和密度條件下檢測細胞毒活力，CIR-值比實際偏低，細胞毒活力越低差別越大。在mSD條件下測定的CIR稱為表觀克隆抑制率(modal cloning inhibited rate,mCIR)。mCIR一般指以mSD≥1 600·mm-2(96孔板4.5×104/孔，表示為mCIR4.5)為條件的測定值。mCIR具有效應細胞樣本特異性，體現效應細胞中CCF不同，但是反映的只是CCF相對比例高低，不能準確定量CCF,不是真實的細胞毒活力，因此不能用作細胞毒活力檢驗指標。

在低密度條件下，效靶細胞接觸是隨機相遇，與體內細胞活動狀態近似，檢測的細胞毒活力接近于體內情況。但是，由于體內細胞密度隨飲食和生活狀況變化，實驗設置的mD不可能與體內情況一致，由一個密度點獲得的檢驗結果只是細胞毒活力在該密度點的表現。因此，細胞毒活力檢驗選擇多點實驗方法，測定CIR-mD關系曲線，由曲線可以確定任意密度點對應的CIR值或CIR對應的mD值。

在mSD條件下可以測定一個CIR，在mD條件下可以測定很多個CIR，任意條件下測定一個CIR是沒有意義的。細胞毒活力檢驗的目的是了解不同人群、不同個體的細胞毒活力狀態，不同樣本的細胞毒活力，有比較才有高低，比較應有統一標準，條件相同，比較才有意義。細胞毒活力檢驗用于病因分析和療效評價，應該以健康人檢驗結果為依據，以50%的樣本CIR達到最大值為條件，建立比較標準。應用LDCIA檢測26例次健康人標本，以mD=6.8×104/孔作標準，計算CIR值，有50%以上的標本達到或接近CIR100,均值(97.3%±1.7)%，下限值90%。如果以mD=5.0×104/孔作標準，計算CIR值，只有少數標本達到CIR100,下限值低于70%。顯然以mD=6.8×104/孔為條件測得的CIR做標準比較合適。標準條件下的CIR值稱為標準克隆抑制率(standard cloning inhibited rate,sCIR),為了直觀，用CIR6.8表示。CIR6.8在低密度條件下由克隆抑制率曲線確定，有CIR100和ID100=6.8×104/孔等2個限定條件，能真實反映效應細胞殺傷活力，用作比標準意義明確，有一定實用性。

CCF是一個功能概念，與以表型特征分類的細胞概念不同。CCF可以是某一種類型細胞的一部分，也可以是幾種類型細胞的一部分，是效應細胞質量效應和數量效應的綜合體現。質量是指效應細胞殺傷靶細胞的能力，通常1個效應細胞殺傷1個靶細胞，有時也可以殺傷幾個靶細胞，或幾個效應細胞殺傷1個靶細胞。我們在實驗中將同一個細胞樣本分成幾份，用紅細胞裂解液處理，時間越長對細胞的損傷越大，然后在同樣條件下測定細胞毒活力。結果裂解液處理過的樣本，細胞毒活力明顯降低(見應用舉例)。細胞密度和組成沒有變，殺傷活力降低表明細胞質量出現了問題。細胞質量問題可以轉化為數量問題,原來具有細胞毒活性的細胞因為損傷失去了殺傷能力,細胞屬性沒有變,但功能上變成了無活性細胞,有活性的細胞數量相對減少。CCF是影響細胞毒活力的主要因素，在檢測樣本內是恒定的，不隨細胞密度變化，具有樣本特異性。因為是在效靶細胞隨機相遇條件下檢測得到的，能比較真實地反映細胞毒活力情況。因此CCF是反映細胞毒活力的特異性指標。

3.5.4 細胞毒活性細胞頻率測定方法 LDCIA定量CCF值的基本原理是，選擇一種或一類效應細胞樣品，檢測CIR-mD曲線，計算CIR-達到100%的樣本概率(probability of specimen-CIR100,PS-CIR100)。如果一個靶細胞接觸一個效應細胞即被殺傷，在飽和密度條件下，CCF為100%時，檢測到的CIR-應該是100%，由于LDCIA實驗是一個統計學實驗方法，不會每次都檢測到CIR-=100%.LDCIA相當于將效應細胞分隔成許多個小單位，平均每個單位里n細胞，但不會每個單位里都是n細胞，可能會有0、1、2、3、…n細胞。靶細胞隨機放到1個單位里可能會遇到單位里有0、1、2、3、…或n細胞的情況。如果遇到0個細胞就不會被殺傷。零殺傷概率由Poisson分布函數確定。根據極限稀釋方法原理，當細胞密度達到1個靶細胞平均接觸4個效應細胞(1 953·mm-2)時，如果效應細胞全是細胞毒活性細胞，檢測到的CIR100的概率是98.2%；如果細胞毒活性細胞是1/4(Ac=1)，檢測到的CIR100的概率是63.2%；如果活性細胞是1/8(Ac=0.5)，檢測到的CIR100的概率低于 40%；1個靶細胞平均接觸1個、2個、3個或5個效應細胞的情況類似。表5列出不同的效靶細胞接觸類型與不同細胞毒活性細胞比率檢測到CIR100的概率(PS-CIR100)。在mD一定條件下，PS-CIR100決定于效應細胞中的活性細胞比率，比率越高PS-CIR100越大。PS-CIR100是一個測定值，用PS-CIR100可以計算活性細胞比率。例如mD=1 953·mm-2，1個靶細胞平均接觸4個效應細胞，如果PS-CIR100為63.2%，表示4個效應細胞中有1個是活性細胞，CCF=1/4=25%。

表5 不同效-靶細胞接觸類型、活性細胞比率與檢測到CIR100的樣本概率

我們應用LDCIA方法，以96孔細胞培養板為載體檢測了34例效應細胞樣品的克隆抑制率CIR。26例健康人外周血細胞，在密度mD=6.8×104/孔(相當于2 402/孔)條件下檢測細胞毒活力，其中14例為CIR100,PS-CIR100為54%，表示1個靶細胞平均接觸4.5個效應細胞，其中有0.807 5個活性細胞，CCF=0.807 5/4.5=18.0%。8例CIK細胞，有7例在4×104/孔條件下CIR-達到100%，PS-CIR100為87.5%。mD=4×104/孔相當于1個靶細胞平均接觸3.08個效應細胞，表示其中有2.11個活性細胞，CCF=2.11/3.08=68.5%。

以CIR6.8為參照標準，RPSD的正常值范圍為0.56～1.50。實際上CCF值就是用RPSD與標準CCF值相乘計算出來的。不過RPSD只是一個比值，沒有CCF意義不明確。CCF的重要意義不僅僅是提供一個細胞毒活性細胞頻率及其正常值范圍，另一個用處是計算外周血中細胞毒活性細胞的數量，為評價免疫功能狀態提供重要信息。例如，患者體檢，1例白細胞是9×109·L-1，另1例是3×109·L-1，兩者CCF相同，都是15%，他們外周血中的細胞毒活性細胞數量是不一樣的，前者為1.35×109·L-1,后者為0.45×109·L-1。反過來，白細胞相同，CCF不同，外周血中細胞毒活性細胞數量還是不一樣。

細胞毒活力高低是相對于參照標準的比較值。參照標準是根據檢驗對象和檢驗目的，應用標準樣本通過實際檢驗確定。靶細胞，效應細胞不同，標準不相同。如上述細胞毒活力檢驗是用LDCIA實驗方法，以K562細胞作靶細胞，以CIK細胞和外周血細胞為檢測對象建立的檢驗體系。檢驗結果只適用于該體系，如果換了靶細胞或效應細胞，就不適用。上述檢驗得到的CCF值，因為標本數少，可信度可能不夠高，希望有條件的實驗室能檢測更多的標本建立更實用的參照標準。

3.6細胞毒活力檢驗方法與實驗條件標準化

3.6.1 細胞毒活力檢驗方法的標準化 細胞毒活力檢驗方法標準化，是選取4個mD實驗點，前幾個在非飽和密度區，最后一個在飽和密度區(mD≥4.5×104/孔)用于測定mCIR4.5。靶細胞做極限稀釋，各實驗點相同。每個實驗點測得1個μi，細胞毒活力越大，μi越小。μi=0或CIR-=100%，對應的細胞密度即ID100值。靶細胞極限稀釋值μ0是一個預置值，由于操作誤差或克隆培養過程中的細胞自然死亡，預置的μ0值和實測值不一定相等，數據處理以對照組實測值為準。測定mCIR4.5的目的是建立一個參照標準， mCIR4.5直接測定值，一般低于曲線計算值，如果曲線計算值低于測定值，說明實驗結果有問題。見圖6。

LDCIA實驗以96孔板做克隆載體需要效應細胞5.5×106。如果檢測樣本細胞數不夠可以減少實驗點，首先減掉一個非飽和密度點；如果細胞數還不夠，應該去掉mSD密度點；如果不足1.0×106細胞，可以按實際細胞數作1個實驗點，與對照組構成2個數據點，用兩點形成的一條直線代替多點曲線計算相關參數。單點法需要注意：1)效應細胞計數和取樣分配要非常準確；2)數據處理必須按曲線條件轉換，不能直接用μi計算CIR。正常情況下不用單劑量點方法。

3.6.2 細胞毒活力實驗條件的標準化 效應細胞的標準化。關于表觀飽和密度的論述，驗證在mSD條件下檢測到的CIR不反映真實的細胞毒活力。為了真實反映細胞毒活力，應該在低密度區選擇多個密度點，通過克隆抑制率曲線測定細胞毒活力指標。效應細胞密度不同，殺傷率不同。不同樣本，用相同的效應細胞密度為標準進行比較才有意義。選擇什么樣的細胞密度做標準由樣本屬性決定。健康人PBMC以mD=6.8×104為標準檢測CIR，用CIR6.8做標準。

靶細胞的標準化。靶細胞對殺傷率有影響，為了消除靶細胞的影響，LDCIA設定用同樣的靶細胞密度，但操作總會有失誤，要做到每次實驗條件(μ0和mDi)都完全相同不太可能。表6是同一個細胞樣本，用不同的靶細胞預置值μ0，相對于同樣的mD，檢測到的μi.。預置μ0項是加在克隆單位內的靶細胞數，0.0項下的μi是實際檢測值，兩者會有差異，數據處理以檢測值為準。圖3是根據表6中的數據，通過ln100μi對mD作圖。取前4個點作圖呈直線(第5個點屬于飽和密度值，不在直線上)。3個預置的μ0，3條線平行，其與橫坐標的交點不同。因此，pSD值不同。表明同一個檢測樣本，靶細胞預置μ0值不同，檢驗結果不同。

靶細胞μ0標準化是以μ0=1做標準，將μ0不等于1的實驗值μi按比例放大或縮小，即對實驗值μ0和μi都除以μ0，表6中μ0=1.0一行是上面3組數據作標準化處理后的結果。同一個檢測樣本，3個預置μ0獲得3組實驗數據，標準化處理后都與μ0=1.0相同。線性擬合前后的斜率b都一樣，不受預置條件影響，由樣本性質決定；常數項a受預置條件影響；3組數據CIR4.5、CIR6.8相同是因為CIR計算時已經除以μ0，等于做了標準化處理。

標準化處理將條件不同的實驗結果轉化為條件相同的實驗結果，消除了條件差異，使檢驗結果有了可比性。

3.6.3 細胞毒活力檢驗成功的基本條件 標準化處理將條件不同的實驗結果轉化為條件相同的實驗結果，是以實驗條件真實、準確為基礎。如果實驗條件不真實或不準確，標準化處理也沒有意義。圖8中3條曲線是同一個實驗因條件不同得到的結果。曲線a是效應細胞計數準確，稀釋無誤獲得的實驗結果，預置細胞密度值mD=0.6、2.4、3.6、5.0(×104)。曲線b是第1個密度點稀釋操作有誤，0.6×104誤計為1.2×104，其他計數值準確。曲線c是計數不準，稀釋操作無誤，各點數值偏高，造成曲線平移。由3條曲線計算出來的參數列在表7中。計數不準和曲線平移對實驗結果影響最大；單點計數錯誤影響較小，是其他各點計數準確給予了糾正。

表6 細胞毒活力實驗數據標準化舉例

圖8 計數誤差對實驗結果的影響

LDCIA實驗參數的計算值都與效應細胞計數值有關，效應細胞計數值是回歸計算自變量，回歸計算以自變量無誤差為條件。因此，效應細胞計數值是影響LDCIA實驗結果精密度和準確度的主要因素，準確計數效應細胞是細胞毒活力檢驗成功的基本條件。

表7 效應細胞計數準確性對檢驗結果的影響

注：1)取4個點數值計算；2)取前3個點數值計算。

3.7細胞毒活力檢驗指標的選擇與應用LDCIA檢測細胞毒活力，既計量靶細胞變化，又計量效應細胞變化，導出多個細胞毒活力指標，為不同檢驗目的提供選擇參考。CIR是靶細胞變化參數，與實驗條件有關，不具有樣本屬性。但是以靶細胞單位均數μ0=1，效應細胞密度mD=6.8×104/孔為條件，檢測健康人PBMC的CIR6.8.，是一個限定條件殺傷率。限定條件不是隨意選定，由樣本屬性確定，可以用作細胞毒活力指標；ID100和CCF是效應細胞變化參數，具有樣本屬性。兩者可以獨立作為細胞毒活力指標；3)CIR-mD回歸系數b，是殺傷率隨效應細胞密度變化率，具有樣本屬性，是一個隱形參數，意義不太明顯。

3組細胞毒活力檢驗參數，是由同一組實驗數據計算出來的，有內在聯系，可以互相替代，實際應用選擇一個即可。一般選擇CIR6.8和CCF,如果沒有CCF標準值，可以直接用ID100。用ID50也可以。

4 LDCIA實驗方法的實際應用

應用LDCIA方法，以限定條件的CIR6.8為指標，檢驗不同樣本的細胞毒活力?？疾長DCIA方法的靈敏性、穩定性與檢驗結果的準確性和真實性。

4.1LDCIA實驗方法簡單易行，經濟實用LDCIA實驗方法，實施條件簡便，一般細胞實驗室即可滿足要求。實驗程序只需分離細胞、計數、稀釋和分樣處理。因為只計數陰性克隆單位而不計數細胞，計數簡便而準確。因為不用標記和染色細胞，不用多次轉移和洗滌細胞，減少了操作程序，降低了操作誤差。因此該方法安全，經濟，實用。

4.2用LDCIA檢測不同類型效應細胞的殺傷活力表8是用LDCIA方法對4種效應細胞做的檢驗結果。實驗以96孔細胞培養板為載體，用K562細胞作靶細胞。細胞因子誘導的殺傷細胞 (cytokine inducing killer，CIK)是一類用細胞因子在體外誘導生成的免疫細胞。CIK細胞毒活力很高，一般在mD =3.5×104/孔，CIR-可達到100%，故檢測 CIK 細胞毒活力選擇mD=4.0×104/孔。PBMC是用外周血分離的單核細胞，健康人PBMC以mD =5.0×104條件，檢測到的CIR5.0只有1例接近70%，其余都在90%以上；以mD =6.8×104為條件檢測CIR6.8有14/26達到或接近100%。健康人外周血分離的紅細胞是無核細胞，沒有細胞毒作用，以空白實驗組作對照，檢測結果CIR-為負值，表明紅細胞不僅無細胞毒作用，而且還能滋養靶細胞生長。這也是本方法用紅細胞做滋養細胞的依據。這表明LDCIA實驗結果能夠反映不同類型效應細胞的細胞毒活力。

4.3LDCIA的靈敏性我們用幾個有代表性的CIK誘導條件制備CIK細胞，然后進行細胞毒活力檢驗。檢驗結果(表9)表明，FBS和IL-2是影響細胞毒活力主要因素。血清活力因子是支持細胞生長增殖的基本條件。IL-2能促進細胞增殖和獲得免疫殺傷活性，但以細胞能正常生長為條件。CD3+抗體和IFN-γ對細胞毒活力作用不明顯。植物凝集素PHA也有誘導細胞毒活力的作用，在該實驗條件下，沒有IL-2作用力強。

表8 LDCIA檢測不同人群PBMC的細胞毒活力

注：1)是回歸方法計算的CIR-誤差

表9 LDCIA檢測不同條件下制備的CIK殺傷活力

注：CIR4.0是以效應細胞4.0×104/孔為條件檢測的CIR-；Sreg是用回歸計算的CIR誤差

表10是兩類受損傷效應細胞的細胞毒活力檢驗。一類效應細胞是健康人PBMC，用紅細胞裂解液(0.16 mol·L-1，NH4CL×0.17 mol·L-1Tris-HCL,pH7.2)處理，然后用PBS(0.05 mol·L-1pH7.3)洗滌1次，再用培養液稀釋做效應細胞。紅細胞裂解液能裂解紅細胞，也能損傷有核細胞。細胞毒活力檢驗表明，裂解液作用效應細胞后殺傷活力明顯降低，處理時間越長細胞毒活力越低。另一類效應細胞是用IL-和CD3+抗體聯合誘導的CIK細胞，體外培養的CIK能強力殺傷K562細胞，大部分CIK的ID100為3.5×104/孔，CIR4.0全部達到100%。但是改變環境條件，如放回自體血漿內繼續培養，失去了血清和細胞因子的支持，CIK的殺傷活力很快喪失殆盡CIR4.0=0。LDCIA對不同條件下生成的免疫細胞與細胞損傷前后細胞毒活力檢驗結果表明，LDCIA方法對效應細胞性能變化有靈敏的反應性。

4.4LDCIA的穩定性表11是對4個自愿者PBMC進行的重復細胞毒檢驗。1號受試者在7個月期間進行了9次檢驗；2號受試者在1個月期間進行了2次檢驗；3號受試者是1例年輕人，不相信較低的結果，要求重復檢驗，2次檢驗結果差別不大。4例外周血PBMC殺傷活力檢驗結果變異都不大于5%，表明穩定性比較好。

表10 LDCIA檢測效應細胞損傷前后的殺傷活力

注：CIR5.8和CIR4.0是以效應細胞5.81×104/孔和4.0×104/孔為條件檢測的CIR-

表11 LDCIA實驗方法的穩定性

5 LDCIA方法討論

細胞毒活力檢驗是評價免疫功能的重要方法。51Cr釋放法是建立較早、被視為經典的檢驗方法，實際上是一個錯誤方法，輻射防護、污物處理和檢測儀器昂貴，只是使用難易問題；以效靶細胞比為條件檢測殺傷率，用殺傷率做細胞毒活力指標是原則性錯誤，違背毒理學原理[16,19-21]，是檢驗結果不穩定，無法建立檢驗標準，不反映細胞毒活力的主要原因。為解決實用問題，先后建立了10多種替代方法，都沒有觸及基本原理和方法條件。51Cr釋放法的錯誤理念影響細胞免疫學半個多世紀，要想建立實用的細胞毒活力檢驗方法，必須正確認識和消除51Cr釋放法的影響。

LDCIA用于細胞毒活力檢驗遵循藥理學原理：1)用CCF或ID100做細胞毒活力指標，以效應細胞密度為變量測定殺傷率，體現了細胞毒性反應規律，反映真實的殺傷活力；2)通過量-效曲線測定CCF或ID100，避免了單劑量點實驗結果的不確定性；3)不對靶細胞作標記或修飾，用紅細胞做滋養細胞，細胞毒性反應條件接近于體內環境。靶細胞能增殖才能形成克隆，死傷細胞不會形成克隆，沒有假性殺傷，應用特殊培養基消除細胞衰亡，避免了假陰性，實驗結果更具真實性；4)LDCIA將靶細胞計數轉換成克隆單位計數，計數方便、快捷、準確；可以預置實驗可信度。我們對LDCIA方法的可行性和實用性進行了驗證，由于能力和條件所限，檢測樣本例數不夠多，像健康人PBMC的CIR6.8正常值檢測樣本只有36例，CCF正常值只有26例，可信度不是很高，僅供參考。希望同行們進一步檢驗認證。

LDCIA用于細胞毒活力檢驗，需要解決好3個問題：1)做好細胞計數。細胞計數準確性是LDCIA成功的決定性因素。效應細胞密度準確，獲得的量效曲線才能規則、平滑、誤差小、可信度高；2)解決好細胞衰亡問題。消除細胞衰亡的辦法是選擇適宜的培養基；3)正確認識LDCIA中的靶細胞變化規律。靶細胞作極限稀釋，分布在檢測單位內的靶細胞均數與克隆陰性單位概率呈指數關系；由于細胞毒性作用，單位內靶細胞因被殺傷而減少，殺傷率與單位內效應細胞密度為非線性關系。實驗數據處理，需要先按Piosson分布函數計算靶細胞均數，然后將靶細胞計數與效應細胞密度再做一次非線性轉換。從克隆單位計數到克隆抑制率曲線，經過兩次非線性轉換。有人用LDA檢測細胞毒活力沒有成功[22-23]，原因是：1)當時的LDA體系還不成熟，不完善；2)受51Cr釋放法的錯誤理念影響，仍以效靶細胞比為條件檢測殺傷率，只是用克隆陰性單位概率計算靶細胞均數；3)沒有處理細胞衰亡的問題。

總之，LDCIA方法遵循藥理學原理，改變細胞毒檢驗方法理念，是細胞毒活力檢驗方法的一次革命。

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趙承彥(1938-)，男，碩士，研究員，主要從事細胞免疫與腫瘤免疫治療相關研究。E-mail:cyzhao.01@163.com

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Q2-33;R73-36

A

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2016-10-26)