黑曲霉xynC基因編碼一種低溫酸性木聚糖酶

焦叢蕊，楊文娟，陳曉玲，董自星，金鵬，劉曉光，王正祥, *

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津科技大學 化工與材料學院，天津，300457)

黑曲霉xynC基因編碼一種低溫酸性木聚糖酶

焦叢蕊1，楊文娟1，陳曉玲1，董自星2，金鵬2，劉曉光2，王正祥1, 2*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津科技大學 化工與材料學院，天津，300457)

木聚糖酶(xylanase, EC 3.2.1.8)可以隨機切割木聚糖主鏈的β-1,4-糖苷鍵，在飼料、食品、造紙和紡織等領域具有廣泛的應用。該研究通過分子克隆技術將黑曲霉CICIM F0510來源的木聚糖酶基因xynC在畢赤酵母中進行了克隆表達，構建獲得了重組菌GS115 (pPIC-XynC)。在搖瓶水平上，重組菌的酶活為1.14 U/mL。酶學性質的研究表明，重組酶XynC的最適反應溫度和pH分別為30 ℃和2.5，且它在25～40 ℃或pH 2.0～5.0有較好的穩定性；K+對XynC的活性有微弱的促進作用，而Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+、EDTA和SDS等對XynC的活性有不同程度的抑制作用。此外，該酶還可以水解戊聚糖產生聚合度為3～6的低聚木糖。這些良好的理化性質為重組酶XynC在飼料及食品等領域的應用奠定了基礎。

低溫酸性木聚糖酶；黑曲霉；分子克??；酶學性質；低聚木糖

內切-1,4-β-D-木聚糖酶，簡稱木聚糖酶(xylanase，EC 3.2.1.8)，是降解木聚糖的關鍵酶，它可以隨機切割主鏈的β-1,4-糖苷鍵，從而產生不同長度的低聚木糖[1]。該酶廣泛應用于飼料、食品、造紙、紡織以及能源等諸多工業領域[2-3]。當前，木聚糖酶主要通過真菌、細菌等微生物發酵生產獲得[4]。而國內主要由真菌經固態發酵生產木聚糖酶，其酶活較低，且成分復雜，限制了木聚糖酶的廣泛應用。因此，通過分子克隆技術實現木聚糖酶的異源表達成為近年來的研究熱點。目前已有多種木聚糖酶被克隆及表達，其中黑曲霉來源的XynB[5-7]和XynI[8-10]已經在畢赤酵母、黑曲霉和大腸桿菌等多種宿主中得到了克隆表達，它們的酶學性質也被系統地解析。

盡管黑曲霉CBS 513.88的基因組序列已經于2007年被解析完成并公布[11]，但黑曲霉的蛋白數據庫中還有許多蛋白的功能未確定。本課題組前期通過對其基因組序列信息進行分析，發現了一個新的編碼木聚糖酶的基因xynC，其理化性質與功能等未知。為此，本研究通過分子克隆技術將其在畢赤酵母中進行克隆表達，并對其進行了初步純化，還就其生化特征進行了全面解析，為其大規模生產及其在飼料及食品行業的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1菌種

黑曲霉(Aspergillusniger)CICIM F0510為從自然樣本中分離保藏的野生菌株，由本實驗室保藏[12]。重組畢赤酵母菌GS115 (pPIC-XynC)由本研究中構建、篩選并保存。大腸桿菌JM109由本實驗室保藏。黑曲霉采用CD培養基進行培養；大腸桿菌用LB培養基進行培養；畢赤酵母及其重組菌的培養基及其培養方法按照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊進行。

1.2主要試劑

限制性酶、質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒以及膠回收試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司；G418、無氨基酵母氮源等為Invitrogen公司產品；RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)和cDNA合成試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)由Roche公司提供；生物素、胰蛋白胨和酵母抽提物等購于英國OXOID公司；戊聚糖購自陜西帕尼爾生物科技有限公司；D-木糖和低聚木糖為江蘇銳陽生物科技有限公司產品，其他試劑均為國產分析純。

1.3黑曲霉木聚糖酶基因XynC的克隆與表達

1.3.1 畢赤酵母工程菌的構建

質粒、PCR產物的純化、酶切、連接、電轉化以及轉化子篩選等均采用實驗室常規方法[13]。其中，基因克隆過程中所采用寡核苷酸引物(An-XynC1：GTACTCCCCAATGGCAAGGCCC；An-XynC2：TGCTC￣T￣A￣G￣A￣TTAGCAGCTCTCCTCGGTGCTGTC；下劃線部分為人工引入的限制性酶切位點)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。黑曲霉總RNA的提取與cDNA的制備按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 重組酶的誘導分泌表達與初步純化

將畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-XynC)在YPD平板上進行純化，挑取單菌落接種于25 mL YPD液體培養基中，30 ℃、220 r/min振蕩培養至對數生長期(OD600為2～6，約18～20 h)。按1%(v/v)接種量接入50 mL BMGY培養基中，于30 ℃、220 r/min振蕩培養至對數生長期(OD600為2～6，約16～18 h)。室溫下5 000 r/min離心5 min回收酵母細胞，棄上清，將細胞重懸于適當體積的BMMY培養基中，至OD600值為1.0，30 ℃繼續培養并開始誘導。每隔24 h補加100%甲醇至終濃度為0.5%以維持誘導，并同時取樣測定酶活，直至酶活不再提高。

發酵結束后，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)收集粗酶液。采用鹽析、透析和Sephadex G-75凝膠層析柱對其進行初步純化，并通過酶活測定和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電脈(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析蛋白的純化情況。[14]采用5%的濃縮膠，12%的分離膠。

1.4重組木聚糖酶的酶學特征分析

1.4.1 酶活測定方法

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]測定木聚糖酶的酶活。反應體系為200 μL 50 g/L戊聚糖溶液、300 μL相應pH的緩沖液和100 μL經適當稀釋的酶液，在50 ℃反應30 min后，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應。離心后，取400 μL反應上清液，加入400 μL去離子水和1 mL DNS試劑，沸水浴5 min后，迅速冷卻。再用去離子水定容到5 mL，測540 nm下的吸光值；對照組中預先加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液滅酶活，然后于上述條件下反應，測定吸光度。酶活力定義：1 mL酶液在50 ℃、pH 5.5條件下，每分鐘水解戊聚糖生成1 mg還原糖為1個酶活力單位(U)，用U/mL表示。

1.4.2 最適反應溫度的測定

在不同溫度條件下(25～70 ℃)測定重組木聚糖酶的酶活，以酶活最高者為100%表示所處溫度下的相對酶活。

1.4.3 熱穩定性的測定

分別將木聚糖酶的酶液在不同溫度下(25～70 ℃)進行孵育，于不同時間(15、30、60和120 min)取樣，測定重組木聚糖酶的酶活。以未進行熱處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活，確定重組木聚糖酶的熱穩定性。

1.4.4 最適反應pH的測定

在不同反應pH下(pH 2.0～8.0)測定重組木聚糖酶的酶活，以酶活最高者為100%表示所處pH下的相對酶活。所用緩沖液為：pH 2.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。

1.4.5 pH穩定性的測定

室溫下，分別將經過適當稀釋的木聚糖酶酶液在pH 2.0～7.0的緩沖液中孵育1 h后，按照1.4.1的方法測定酶活。以酶活最高者為100%計算殘余酶活力，確定重組酶的pH穩定性。

1.4.6 金屬離子和相關化學試劑對酶活的影響

在木聚糖酶與其底物進行反應的體系中，加入終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子或化合物，分別測定各反應體系中重組木聚糖酶的相對酶活，以不加金屬離子或化學試劑的反應體系的酶活為100%。

1.5重組酶水解戊聚糖的產物分析

1.5.1 水解實驗

將200 μL 50 g/L戊聚糖溶液與100 μL酶液混勻，在最適反應溫度和pH條件下反應10 h后，煮沸滅酶活。然后在12 000 r/min離心5 min，取上清液。

1.5.2 水解產物薄層層析

將上述上清液采用薄層層析進行分析。所用的展開劑為:V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)∶V(異丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=25∶10∶5∶1∶15[16]，顯色劑為：V(硫酸)∶V(無水乙醇)=5∶95。從左到右依次點樣：木糖標品(1 mg/mL)、低聚木糖標品(1 mg/mL)、XynC與戊聚糖反應的上清液、滅活的XynC與戊聚糖反應的上清液。將已經點好樣的硅膠板放入盛有適量展開劑的層析缸中，待展開劑擴散至距硅膠板上沿1 cm處，取出硅膠板，在通風廚里晾干。向此干燥的硅膠板上快速均勻的噴灑顯色劑，在通風櫥里晾干，然后烘烤至樣品顯示出來，并拍照記錄。

1.6木聚糖酶基因XynC的生物信息學分析

從美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取不同來源的木聚糖酶的氨基酸序列。利用MEGA 4.0等軟件將XynC與這些木聚糖酶的氨基酸序列以鄰近法(Neighbour-joining)構建進化樹，分析它們親緣關系的遠近[17]。通過軟件Clustal X2和BioEdit對不同來源木聚糖酶的氨基酸序列進行比對和分析。

2 實驗結果

2.1木聚糖酶基因XynC的克隆與分析

采用BLAST等分析方法對A.nigerCBS 513.88的基因組序列(EMBL AM270980-AM270998)進行分析，發現1個新的木聚糖基因(命名為xynC)。以此為基礎，設計出相應的核苷酸引物。然后以A.nigerCICIM F0510的cDNA為模板對其進行PCR擴增。PCR產物經純化后，用XbaI進行完全酶切，并與經過SnaB I和AvrII酶切的pPIC9K進行連接。再通過PstI酶切，驗證了重組質粒的正確性，獲得了重組表達質粒pPIC-XynC。進一步通過核苷酸序列測定，確認了所克隆的xynC基因具有完整的開放閱讀框(ORF)，且其核苷酸序列和氨基酸序列與A.nigerCBS 513.88基因組公布的序列一致。其完整ORF大小為696 bp，編碼231個氨基酸。

利用MEGA 4.0將XynC與不同來源木聚糖酶的氨基酸序列進行進化樹的構建，結果匯總于圖1。此進化樹反映了不同來源的木聚糖酶之間的遺傳距離。其中，黑曲霉來源的3個木聚糖酶均屬于糖苷水解酶第11家族(GH11, EC 3.2.1.8)，但它們分屬3個不同組合。

圖1 進化樹描述不同來源的木聚糖酶的遺傳距離Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among xylanases from different microorganisms線段的長度表示的是用MEGA 4.0計算的距離；分支節點上的數字代表的是bootstrap百分比。黑曲霉來源的木聚糖酶用粗體標出，木聚糖酶AuXyn11D、AoXynG1、AkXynB、AtXlnA和AuXynA分別來源于A. usamii E001、A. oryzae KBN616、A. kawachii IFO 4308、A. tubingensis和A. usamii。)

進一步利用Clustal X2等軟件將上述不同來源木聚糖酶的氨基酸序列進行比對與分析，結果如圖2所示。XynC與這些木聚糖酶的氨基酸序列的相似度為42.44%～99.13%。與其他木聚糖酶相比，XynC具有木聚糖酶家族典型的二級結構，且具有其典型的活性中心(Glu117和Glu208)，屬于木聚糖酶家族。

(*)保守的氨基酸序列；(:)保守的替換；(.)半保守的替換；虛線表示的是空格；二級結構標在序列的上方；灰色部分標注的是信號肽；活性位點用方框標出；五角星標出的是對酶的最適反應pH有影響的氨基酸殘基圖2 不同來源的木聚糖酶的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple amino aeid sequence alignment of xylanases from different microorganisms

2.2黑曲霉木聚糖酶的分泌表達與初步純化

將構建獲得的重組質粒pPIC-XynC用NcoI線性化后，電轉化入畢赤酵母GS115中，并通過G418平板篩選高拷貝轉化子，獲得重組菌GS115(pPIC-XynC)。在250 mL搖瓶培養120 h后，重組菌的胞外木聚糖酶酶活達到最高，為1.14 U/mL，表達量約為530 mg/L。進一步通過鹽析、透析和凝膠過濾層析法，將XynC的粗酶液進行初步純化，其得率、純化倍數和比酶活分別為57.9%、9.2倍和19.8 U/mg。蛋白電泳的結果(圖3)表明，XynC的純度已經達到酶學特征分析的要求；其分子質量約為26.0 kDa，略高于其理論分子質量(23.0 kDa)，這可能是因為表達的蛋白經過了糖基化修飾[8]。

M-蛋白分子量標準；1-XynC粗酶液；2-純化后的XynC圖3 SDS-PAGE分析XynC的純化情況Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of XynC

2.3重組木聚糖酶的酶學特征

2.3.1 重組木聚糖酶的最適反應溫度和熱穩定性

在不同溫度下(25、30、35、40、45、50、60和70 ℃)測定木聚糖酶的酶活，結果如圖4-a所示。重組酶XynC的最適反應溫度為30 ℃，且在30～45 ℃范圍內其相對酶活在80%以上。進一步在上述不同溫度下研究XynC的熱穩定性，結果表明(圖4-b)：(1)在25～40 ℃的水浴中孵育2 h，XynC殘留的酶活仍維持在70%以上，具有較好的穩定性；(2)在50 ℃孵育15 min，殘留酶活僅有40%左右；(3)在60 ℃和70 ℃孵育15 min，XynC幾乎完全失活。

圖4 XynC的最適反應溫度(a)和熱穩定性(b)Fig.4 Optimum temperature (a) and thermostability (b) of XynC

2.3.2 重組木聚糖酶的最適作用pH和pH穩定性

在不同pH反應條件下(pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和5.0)測定XynC的酶活，結果如圖5-a所示。由圖可知，XynC的最適反應pH為2.5，且在pH 2.0～2.5范圍內其相對酶活在80%以上。pH穩定性的研究結果(圖5-b)表明，在pH 2.5～4.0的緩沖液中孵育1 h后，XynC仍能保持80%以上的相對酶活；在pH 2.0～7.0孵育1 h后，其殘留酶活仍在60%以上，具有較寬泛的pH穩定范圍。

圖5 XynC的最適反應pH(a)和pH穩定性(b)Fig.5 Optimum pH (a) and pH stability (b) of XynC

2.3.3 金屬離子和相關化學試劑對重組木聚糖酶活性的影響

在XynC與其底物進行反應的體系中加入不同的金屬離子或化學試劑(終濃度為5 mmol/L)，研究其對XynC酶活的影響，結果匯總于表1。除了K+對XynC的活性有微弱的促進作用外，Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+和EDTA、SDS等都對XynC的活性有不同程度的抑制作用。其中，5 mmol/L SDS可以使XynC幾乎完全失活。

表1 金屬離子和化學試劑對重組木聚糖酶酶活的影響

2.4重組酶XynC水解戊聚糖的產物分析

將重組木聚糖酶XynC與50 g/L戊聚糖在pH 2.5和30 ℃反應10 h后，采用薄層層析對其水解產物進行分析，結果如圖6所示。戊聚糖經XynC水解后會產生聚合度為3～6左右的低聚木糖。

1-1 mg/mL木糖;2-1 mg/mL低聚木糖;3-XynC與戊聚糖反應上清液;4-滅活XynC與戊聚糖反應上清液；5-戊聚糖；X1～X5-木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖圖6 薄層色譜分析XynC水解戊聚糖的產物Fig.6 TLC analysis of the hydrolytic products of pentosan catalyzed by XynC

3 討論

本研究成功將黑曲霉CICIM F0510的木聚糖酶基因xynC在畢赤酵母中進行了克隆與表達。進化樹的構建和氨基酸序列比對的結果(圖1和圖2)表明，重組酶XynC具有木聚糖酶家族典型的二級結構和活性中心，屬于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶(GH11，EC 3.2.1.8)。其最適反應pH和溫度分別為2.5和30 ℃(圖4-a和圖5-a)，與許多嗜中溫真菌來源木聚糖酶的最適反應pH和溫度相似[4, 10, 18]，但低于其他GH11家族木聚糖酶的最適反應pH和溫度(比如XynB，其最適反應pH和溫度分別為5.0、55 ℃)[19]。此外，室溫下將XynC在pH 2.0～7.0的緩沖液中孵育1 h，殘留酶活仍在60%以上(圖5-b)，如此寬泛的pH穩定范圍在其它GH11家族的木聚糖酶中并不常見[6, 20]。在低溫和酸性條件下具有良好的穩定性使得XynC可以作為飼料添加劑，在動物酸性的胃腸道中發揮作用。

一些真菌木聚糖酶，比如A.kawachii木聚糖酶XynC[21]和A.niger木聚糖酶XynI[10]都具有較低的最適反應pH和pH穩定性。在這些木聚糖酶中，它們N端的天冬氨酸殘基都是保守的。相反地，耐酸性較弱的或中性木聚糖酶中相應位置的氨基酸則是天冬酰胺。在此保守區，XynC中有3個天冬氨酸殘基(Asp44、Asp54和Asp57，圖2)，因此它具有較低的最適反應pH和良好的耐酸性。其中，Asp57對應于XynI中的Asp37，它會嚴重影響木聚糖酶的最適反應pH[10]。

Ca2+、Mn2+、Co2+和Cu2+對XynC的酶活有不同程度的抑制作用(表1)，這與它們對XynI酶活的影響類似[8]。據報道，Zn2+可以增強木聚糖酶XynI[8]和XynB[19]的酶活，但它卻對XynC具有一定的抑制作用。EDTA是一些木聚糖酶的抑制劑[22]，它可以明顯抑制XynC的酶活，這表明XynC是金屬酶。但EDTA會促進木聚糖酶XYN186[20]、XYNZG[22]和XynI[8]等的酶活，它們可能不是金屬酶，其催化機制也可能與XynC不同。5 mmol/L SDS會強烈抑制XynC的酶活，使它幾乎完全失活，該研究結果也得到了MAO等[20]的證實。而5 mmol/L K+對XynC的酶活有微弱的促進作用，與ZHANG等[22]的研究結果一致。

此外，重組酶XynC可以將戊聚糖降解成聚合度為3～6的低聚木糖(圖6)。由于低聚木糖不能被哺乳動物的胃腸道吸收，而且可以作為益生元促進腸道益生菌的生長，因此作為飼料添加劑使用可以間接抑制有害菌的生長、改善腸道環境等。此外，低聚木糖還具有防治齲齒、促進微量元素的吸收、降低膽固醇、調節冰點、抗氧化、保水性、改善血清以及調節血壓等功能[23]，在食品或飼料行業具有較高的應用潛力。

綜上所述，本文成功將黑曲霉CICIM F0510的木聚糖酶基因xynC在畢赤酵母中進行了克隆表達，并對其進行了初步純化。酶學性質的研究表明，重組酶XynC是一種低溫酸性木聚糖酶，且可以將戊聚糖水解成低聚木糖，這為該酶在飼料和食品等行業的應用奠定了良好的基礎。

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GenexynCfromAspergillusnigerencodingacold-activeandacidophilicxylanase

JIAO Cong-rui1, YANG Wen-juan1, CHEN Xiao-ling1, DONG Zi-xing2*, JIN Peng2, LIU Xiao-guang2, WANG Zheng-xiang1, 2*

1 (College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China) 2 (College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China)

Xylanase, an enzyme that randomly cleaves internal β-1,4-xylosidic linkages of xylan backbone, has wide applications in feed, food, pulp and paper, and textile industries. In the present study, genexynCencoding xylananse fromAspergillusnigerCICIM F0510 was cloned and expressed inPichiapastoris, and the recombinant strain GS115 (pPIC-xynC) was subsequently constructed. At the shake flask level, the activity of the recombinant enzyme XynC was 1.14 U/mL. The optimum temperature and pH of XynC was determined to be 30 ℃ and 2.5, respectively. This enzyme was also stable at 25-40 ℃ or pH 2.0-5.0. K+slightly enhanced the activity of XynC, whereas Ca2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe3+, Sn2+EDTA and SDS had different inhibitory effects on its activity. Besides, XynC can hydrolyze pentosan to yield short chain xylooligosaccharides with degree of polymerization of 3-6. Such good biochemical properties lay a solid foundation for the applications of XynC in feed and food fields.

cold-active and acidophilic xylanase；Aspergillusniger；molecular cloning；enzymatic properties；xylooligosaccharides

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014869

碩士研究生(董自星博士、王正祥教授為通訊作者,E-mail: dzx@tust.edu.cn; zxwang0519@tust.edu.cn)。

2017-06-02，改回日期：2017-07-25