外源茉莉素調控植物中萜類化合物生物合成的研究進展△

石宏武，羅祖良，崔晟榕，馬小軍，2*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫學科學院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

·綜述·

外源茉莉素調控植物中萜類化合物生物合成的研究進展△

石宏武1，羅祖良1，崔晟榕1，馬小軍1，2*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫學科學院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

萜類化合物是植物中的一類重要的次生代謝產物，在醫藥、工業和農業生產上扮演著重要的角色。由于一些重要的萜類具有復雜的化學結構以及在植物中的低含量，使其不能低成本地大量生產。因此，利用植物中普遍存在的茉莉素調控機制和外源介導相關轉錄因子，調控萜類生物合成途徑關鍵酶基因表達，以達到提高目標萜類化合物含量，這已成為研究熱點。本文綜述了萜類化合物的生物合成途徑、響應茉莉素信號且與次生代謝有關的轉錄因子以及應用茉莉素調控萜類化合物合成的研究進展，探討了茉莉素調控萜類合成中所面臨的問題，并對茉莉素調控萜類生物合成的潛在經濟價值進行了展望。

茉莉素；萜類化合物；轉錄因子；調控；綜述

萜類(terpenoids)化合物是植物中以異戊二烯單位構成的一類重要的次生代謝產物，主要有半萜、單萜、倍半萜、二萜、三萜等，其也是天然藥物活性成分的主要來源，具有增強植物抗病能力、幫助植物抵御天敵、維系植物與其他物種的互惠關系以及化感等作用[1]。近年來，由于萜類化合物在醫藥、工業和農業上的廣泛應用，使其具有可觀的經濟價值。然而在萜類化合物的生產中發現，一些具有重要價值的萜類化合物的化學結構復雜且在植物中含量較低，開發成本較高。植物組織細胞培養和微生物發酵生物合成雖然能夠大幅度提高萜類產量，但在植物組織細胞管理或構建合適的發酵菌株上，前期投入成本高。因此利用植物自身的代謝通路，通過植物激素調控萜類快速合成和大量積累，不失為一種經濟可行的方法。

植物激素是植物體內產生的一類調控植物生長發育、代謝、環境應答等生理過程的重要代謝產物。隨著分子生物學的不斷完善以及植物激素檢測技術體系的日趨成熟，對篩選激素受體和激素信號轉導的研究就顯得更加經濟、易操作。茉莉素(jasmonates)作為近幾十年來新發現的一類植物激素，已經在調控植物生長和次生代謝上廣泛應用，且在調控萜類次生代謝產物積累上獲得了重大進展。本文主要從萜類化合物在體內合成途徑入手，綜述了茉莉素調控植物萜類合成途徑關鍵酶表達，以提高其含量的研究狀況，以及茉莉素在調控過程中涉及的一些轉錄因子，以期獲得對茉莉素調控萜類生物合成的新認識。

1 植物萜類化合物的合成途徑

萜類化合物主要是通過兩個途徑合成：位于胞質和內質網中的甲羥戊酸(MVA)途徑以及位于質體中的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑(DOXP)或甲基赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP)。

這兩個途徑可分為3個階段：焦磷酸異戊烯酯(IPP)及其雙鍵異構體γ，γ-二甲基烯丙酯(DMAPP)的生成階段、萜類直接前體的合成階段和萜類的合成及修飾階段[2]。在第一階段，MVA途徑是起始于乙酰CoA，依次在乙酰乙酰CoA硫解酶(AACT)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGS)、羥甲基戊二酰CoA還原酶(HMGR)等酶的催化下形成甲羥戊酸(MVA)，然后再依次通過甲羥戊酸激酶(MK)、甲羥戊酸磷酸激酶(PMK)和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MVD)等作用下形成IPP。MEP途徑則是以丙酮酸和磷酸甘油醛為前體化合物，經過1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)聚合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，隨后經過1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶(DXR)、2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉移酶(MCT)等酶的催化下形成IPP和DMAPP[3]。兩種途徑產生的IPP可以越過質體膜互為利用[4]。在第二階段，由MVA和MEP途徑合成的IPP在IPP異構酶催化下形成具有活性的異構體DMAPP，在異戊烯轉移酶的作用下形成焦磷酸香葉酯(GPP)，衍生為單萜類化合物，或在繼續與IPP分子縮合衍生成焦磷酸金合歡酯(FPP)、焦磷酸香葉基香葉酯(GGPP)和焦磷酸香葉基金合歡酯(GFPP)等萜類前體化合物[5]。第三階段，在形成的萜類前體化合物的基礎上，經過環化，形成相應的萜類和甾醇類化合物，見圖1。

2 茉莉素及與其響應的轉錄因子

茉莉素是新納入到植物內源激素的一類具有環戊酮結構的化合物，由亞麻酸經脂肪氧合酶途徑合成，主要包括茉莉酸異亮氨酸(jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和茉莉酸甲酯(methyl-jasmonic acid，MeJA)等。其中，雖然在植物體內具有生物活性的為JA-Ile，但是由于MeJA具有揮發性、不易被離子化、易透過細胞等特點而被選為外源使用[6]。茉莉素在植物生長發育過程中發揮著廣泛的生物學功能，如調控植物組織器官生長發育[7]、介導植物對病蟲害和病原菌的抗性反應[8]、誘導衰老和調節次生代謝[9]等。

茉莉素的信號轉導途徑研究表明，26S泛素蛋白酶體介導了茉莉素反應。茉莉素受體COI1(coronatime insensitive 1)通過與ASK(Arabidopsis SKP)、Cullin、F-box和Rbx1(ring box-1，Rbx1)相互作用形成多亞基泛素連接酶復合體SCFCOI1[10]。當植物體內活性的茉莉素信號分子處于低水平時，抑制因子JAZ蛋白(jasmonate ZIM-domain protein)通過與各轉錄因子(transcription factor，TF)相互作用，抑制茉莉素信號傳導。當植物受到外源刺激，或自身生長發育促使茉莉素信號分子大量積累時，多亞基泛素連接酶復合體SCFCOI1中的COI1受體結合茉莉素信號分子，進而引導SCFCOI1與JAZ蛋白相結合，使得JAZ蛋白泛素化，泛素化的JAZ蛋白經過26S蛋白酶體被降解，被JAZ抑制的TF釋放，從而結合相應基因上游的順勢作用元件，促進/抑制其表達而產生茉莉素樣效應[11]。

從茉莉素信號轉導途徑可以看出，茉莉素產生的生物學功能主要是通過介導釋放TF來調控基因表達而實現的，如調控植物雄蕊晚發育的MYB21和MYB24[11]，調控根發育的MYC2[12]以及調控植物抗蟲反應的MYC2、MYC3和MYC4[13]等。表1總結了茉莉素誘導產生次生代謝產物對應介導的幾類TF，主要屬于AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-Response Factors)、bHLH(basic Helix-Loop-Helix)、MYB和WRKY四個家族，涉及長春花、擬南芥、煙草、黃花蒿、紅豆杉、人參、西洋參、三七、日本黃連等植物。這些TF上調或下調關鍵合酶的基因表達，調控生物合成途徑的代謝走向。因此，通過外源施加激素介導轉錄因子，調控基因的表達，從而生產大量的目標次生代謝產物，這可為醫藥、化工生產上的原料來源提供重要的補充。

圖1 萜類化合物的生物合成途徑

表1 文獻中一些與調控次生代謝有關的應答JA的轉錄因子

表1(續)

注：*表示直接提交至NCBI。

3 茉莉素調節萜類化合物合成的研究

萜類化合物在植物中直接提取的產率低，化學合成途徑復雜，特別是手性化合物的合成等問題大大限制了其生產應用，通過外源植物激素茉莉素調控關鍵合成酶基因的表達來提高萜類產量，在很大程度上有望改善這一不利局面。通過對植物不同時期的轉錄組數據分析和生物學驗證，進而對萜類化合物代謝途徑關鍵酶基因序列進行分析，獲得轉錄調控關鍵基因的順式作用元件，分析可能存在的TF作用的順式作用元件，再通過酵母單雜交試驗篩選介導調控的TF，從而達到促進/抑制基因表達的作用。另外，植物激素的調控不僅可以增加萜類產量，還可提高植物組織器官的利用率。其中，茉莉酸甲酯已經廣泛地用于調控植物萜類化合物的合成，與之響應的轉錄因子在陽春砂、青蒿素、紅豆杉、羅漢果、三七和苦玄參等大多數植物中皆存在。

3.1 調控陽春砂揮發性萜類生物合成的研究

陽春砂(AomomumvillosumLour.)屬于姜科豆蔻屬植物，味辛，性溫，歸脾、胃經，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功能。其中主要含有乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦、蒎烯、檸檬烯和芳樟醇等揮發性單萜類化合物。陽春砂主產于廣東、廣西、福建、云南等地，由于生長地理環境要求高，導致其產量低，質量參差不齊[42]，而茉莉素能有效地改善陽春砂的質量。

利用不同濃度的茉莉酸甲酯處理陽春砂的果實和葉片，檢測發現，在600 μmol·L-1MeJA處理果實24 h后，果皮和種子團中大部分揮發性萜類化合物的積累明顯增加，處理果或葉對果皮和種子團中不同揮發性萜類化合物含量的影響存在差異。此外，通過轉錄組測序和KEGG代謝通路分析發現，與揮發性萜類化合物密切相關的Unigene有208個，響應JA信號重要的MYC類(bHLH家族)TF的Unigene有22個[43]。該研究通過轉錄組數據分析獲得的多個與揮發性萜類化合物的候選基因以及JA處理陽春砂的試驗數據，為深入開展挖掘JA調控揮發性萜類生物合成奠定了重要基礎。

3.2 調控青蒿素生物合成的研究

青蒿素屬于過氧化物倍半萜，是從黃花蒿ArtemisiaannuaL.中分離到的一種抗瘧疾的有效成分。由于其在一定時期內具有的重大戰略意義，基于前期大量的生物或化學合成的研究基礎，通過外源茉莉素來調控黃花蒿中青蒿素的合成，從而提高原材料質量的研究也已經取得了很大的進展。

Wang等[44]利用300 μmol·L-1MeJA處理黃花蒿植株8 d后，黃花蒿中青蒿素含量提高了49%，青蒿素前體化合物青蒿酸和雙氫青蒿酸分別提高了80%和28%，并通過偏最小二乘近紅外光譜分析(OSC-PLS)方法檢測到其他6種倍半萜和3種三萜含量均增高。Maes等[45]篩選到茉莉素介導青蒿素生物合成的174個基因，其中包括形成焦磷酸金合歡酯過程的DXS和FDS基因以及后期修飾成青蒿素的CYP71AV1基因。在茉莉素介導青蒿素合成的過程中，編碼AP2/ERF家族的TF的主要兩種基因分別為AaERF1和AaERF2，并且EMSAs和酵母單雜交試驗證明，AaERF1和AaERF2能夠結合到編碼紫穗槐-4，11-二烯合酶基因(ADS)和CYP71AV1基因的啟動子序列，穩定過表達這兩個基因都能使青蒿素含量提高[18]。此外，AaWRKY1通過結合ADS基因上的W-box，促進其表達[37]，而bHLH家族中的AaMYC2主要是結合啟動子中的G-box或G-box-like motifs作用元件來調控基因表達[46]。因此，茉莉素可以通過介導轉錄因子AaMYC2、AaWRKY1、AaERF1和AaERF2來調控青蒿素的生物合成，這些探索為以后黃花蒿的高質量種植、采收提供了理論依據。

3.3 調控紫杉醇生物合成的研究

紫杉醇屬于二萜類化合物，臨床上用于治療卵巢癌、乳腺癌及非小細胞肺癌等。紫杉醇最早從太平洋紅豆杉(Taxusbrevifolia)的樹皮中分離到，但含量極低。由于紫杉醇原料藥長期處于供不應求狀態，因此開展快速生物合成紫杉醇的研究尤為重要。通過最具有誘導活力的一類茉莉素MeJA調控紅豆杉中紫杉烷型化合物的合成關鍵酶基因的表達，使代謝支路有利于紫杉醇的合成。

Nims等[47]用MeJA處理紅豆杉，7 d后與未檢測到目標化合物的對照組相比，實驗組的紫杉醇和三尖杉寧堿含量達到了3.3 mg·L-1和2.2 mg·L-1，10-脫乙酰巴卡丁III和漿果赤霉素III含量達到3.3 mg·L-1和1.2 mg·L-1，并且在MJ誘導6 h后，合成起始途徑的酶基因GGPPS、TASY和T5αH均上調并持續至24 h。該實驗通過反轉錄PCR(RT-PCR)分析了紫杉烷化合物合成路徑中各基因的表達情況，為紫杉醇的靶向代謝工程奠定了基礎。研究發現，MeJA能夠誘導大幅度提高紫杉醇合成途徑關健酶紫杉二烯合成酶和GGPPS酶的活力[48]，從而間接提高紫杉醇產量。此外，通過對MeJA誘導后的產物比較發現，JA對C-13位紫杉烷衍生物的誘導作用強于C-14位[49]。在JA誘導紫杉醇積累過程中，從紅豆杉(Taxuswallichianavar.chinensis)中篩選到WRKY家族TcWRKY1。體外研究發現，TcWRKY1蛋白特定地作用于編碼10-脫乙酰巴卡丁III-10β-O-乙酰轉移酶(DBAT)基因上的啟動子中兩個W-box元件，調控該關鍵酶基因的表達[50]。這些篩選到的TF或調控通路研究為今后靶向生物合成紫杉醇或提高紅豆杉采收時有效成分含量等工作提供了有利的依據。

3.4 調控羅漢果中葫蘆二烯醇生物合成的研究

葫蘆二烯醇是從羅漢果、栝樓、西葫蘆等中分離到的葫蘆烷型四環三萜類化合物，研究發現，其具有抗炎、抗腫瘤活性，也是葫蘆素類化合物生物合成的關鍵中間體[51]。在羅漢果(Siraitiagrosvenorii)中，以葫蘆二烯醇為母核結構的羅漢果甜苷基于其驚人的甜度和低熱量等優點，在甜味劑開發上具有很大的市場潛力。利用茉莉素刺激羅漢果以增高葫蘆二烯醇和甜苷含量的研究取得了不錯效果。

利用Solexa高通量測序技術對羅漢果果實的轉錄組及不同時期的表達譜進行分析，已經得到了大量的羅漢果基因信息，并驗證了以葫蘆二烯醇為中間產物，合成羅漢果甜苷途徑的相關基因的表達[52]。Zhang等[53]對羅漢果果實轉錄組數據中注釋為轉錄因子的所有非重復Unigene進行分析，發現其中數目最多的3類轉錄因子家族為bHLH、WRKY和MYB，數量分別為79、57和50。此外，通過MeJA噴施羅漢果幼果，發現葫蘆二烯醇含量較對照組增加了22%，RT-PCR檢測基因表達，發現葫蘆二烯醇合成途徑中11個基因的表達受MeJA影響。同時，在對葫蘆二烯醇合酶基因SgCS啟動子進行克隆，獲得了1459 bp的基因序列，順式作用元件分析發現，這段序列中具有核心啟動子元件TATA-box和CAAT-box，其中有3個響應JA的順式作用調控元件。這些研究證明，通過JA調控羅漢果中葫蘆二烯醇生物的合成是可行的。這些轉錄因子作用的順式作用元件數據為篩選具體的轉錄因子蛋白奠定了基礎，也為研究羅漢果中葫蘆烷型三萜化合物合成途徑的激素分子調控機制開辟了新途徑。

3.5 調控其他萜類化合物生物合成的研究

茉莉素除了調控上述萜類化合物的生物合成外，還能對其他萜類的合成產生誘導作用。甲基茉莉酸處理人參發現，人參皂苷合成途徑中的關鍵酶基因SS和SE的表達量明顯提升[54]。在苦玄參(PicriafeltearraeLour.)上噴施MeJA能提高苦玄參苷IA和IB含量[55]。埃及黑種草(NigellasativaL.)在MeJA作用后，常春藤皂苷和刺楸皂苷含量相對于對照組提高了12倍[56]。此外，JA還能調控西洋參、三七、柴胡等藥材中合成萜類皂苷的相關基因的表達[57-58]。在三萜化合物生物合成途徑中，角鯊烯在2，3-氧化鯊烯合酶(SQE)作用下形成2，3-氧化鯊烯，2，3-氧化鯊烯的環化處于萜類和甾醇合成途徑的分支點。研究發現，JA能有效地增強萜類環化酶的活性，抑制甾醇支路環化酶基因的表達[59]。

4 總結與展望

茉莉素調控植物中萜類化合物的積累，能夠有效地提高經濟作物的質量，此外，在激素處理后的植物中，以往廢棄的植物組織也會得到很好的利用。相比萜類化合物的全合成或是異源生物合成的高成本投入問題，茉莉素信號調控途徑在植物界廣泛存在且經濟有效，這使其調控萜類合成成為一個研究的熱點。加上我國是一個種植大國，高產量的萜類植物將保證了其生產中的原材料供給。以往研究中，是將代謝途徑中某個基因過表達以獲得相應產物，與此方法相比，茉莉素以經濟易操作的方式在植物整個次生代謝系統上調節多個酶基因的表達水平，是一種更全面的調控目標次生代謝產物合成的有效可行的方法。

茉莉素作為調控萜類化合物的植物激素之一，深入研究闡明其調控植物次生代謝的傳導通路以及相關的轉錄因子，無論是在實際生產種植還是基礎研究上，都具有重大意義。盡管茉莉素信號轉導機制的研究已有初步成果，仍有很多茉莉素調控植物生長和抗性的分子機制還不清楚，不同物種中對茉莉素響應的轉錄因子也可能受到其他激素的影響，其他植物激素與茉莉素產生的拮抗或協同作用的分子機制的研究還不是很透徹，相關的具有重要價值的轉錄因子還需要不斷篩選補充。由于在調控萜類化合物合成中，茉莉素是外源施加的植物激素，對植物生長或是作物質量上的負面影響還不得而知。因此，還需要大量的科學實驗研究來更詳細地闡明茉莉素作用的分子機制，對茉莉素單一響應或產生同類效應的轉錄因子仍需要不斷篩選研究。

近些年來對萜類化合物的深入研究，使其在醫藥、農業、化工生產上占有越來越重要的地位。茉莉素調控植物萜類化合物的生物合成將會解決萜類生產的原料供給問題，這也大大提高了植物的有效利用率。雖然目前茉莉素的分子作用機制尚未成熟，但是從調控的實質性結果上我們已經看到希望，加上如今各個學科迅猛發展以及其交叉互補的優勢，相信更為全面的分子作用機理很快將會被闡明，茉莉素在調控萜類生物合成上的潛在經濟價值也會被充分挖掘。

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ResearchProgressofExogenousJasmonatesRegulatingTerpenoidsBiosynthesisinPlants

SHIHongwu1，LUOZuliang1，CUIShengrong1，MAXiaojun1，2*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.YunnanBranchofInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Jinghong666100，China)

Terpenoid is one of the important plant secondary metabolites in the plants，which exerts a significant part in the production of medicine，industry and agriculture.Mass production is steadily growing while the enhancement of production of target products is still a tough matter as the complexity of some important terpenoids chemical construction and low content in plants.Therefore，it has been a research focus that improving the target terpenoid content by jasmonates found in the majority of pants mediate correlative transcription factors to regulate the key enzyme genes expression in terpenoid biosynthetic pathway.In this paper，research progress on terpenoid biosynthetic pathway，some secondary metabolism transcription factors that response of jasmonates signal and application of jasmonates regulation on terpenoid biosynthetic is reviewed，the dilemmas faced by the jasmonates regulation on terpenoid biosynthetic are discussed and the great potential economic value of jasmonates regulate terpenoid biosynthetic is predicted.

Jasmonates；terpenoid；transcription factors；regulation；Review

國家自然科學基金(81373914，81573521)；北京市自然科學基金(5172028)

*

馬小軍，研究員，研究方向：分子生物學；E-mail：mayixuan10@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.030

2017-03-22)