一種人參連作障礙土壤改良技術的評價研究△

李志成，閆偉，宋雯，韓京龍，張輝*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林三龍環?？萍加邢薰?，吉林 琿春 133300)

一種人參連作障礙土壤改良技術的評價研究△

李志成1，閆偉1，宋雯1，韓京龍2，張輝1*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林三龍環?？萍加邢薰?，吉林 琿春 133300)

目的通過性狀和高效液相色譜指紋圖譜對連作園參和新林地園參進行人參皂苷含量的比較，從而判斷連作園參種植過程中使用的土壤改良技術是否具有抗人參連作障礙的作用。方法采用有機試劑萃取法提取連作園參和新林地園參的人參總皂苷，再通過高效液相色譜儀測定兩種人參的皂苷含量，最后使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版對連作園參和新林地園參樣品進行比對，通過分析計算得到上述樣品的相似度。結果連作園參中所含人參皂苷Rb1、Rg1、Re含量要高于新林地園參，指紋圖譜顯示2種園參與10種連作園參的高效液相色譜圖的相似度具有一定差異性，連作園參沒出現更嚴重的燒須、紅皮現象。結論連作園參的質量要優于新林地園參，證明該土壤改良技術具有一定的抗人參連作障礙的作用。

連作園參；土壤改良技術；指紋圖譜；質量

1 引言

1.1 人參

人參PanaxginsengC.A.Mey.，具有大補元氣、補脾益肺、生津止渴、安神益智的功效[1]。人參中的人參皂苷是其主要活性成分，具有調節人的中樞神經系統、增強人體免疫系統、增強心腦血管功能、延緩衰老、抗腫瘤等作用[2]。人參中含有的人參皂苷可以分為三類：(1)原人參二醇(PPD)類，主要包括人參皂苷Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3，Rh2。(2)原人參三醇(PPT)類，包括人參皂苷Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1。(3)齊墩果酸(OA)類：人參皂苷R0。據辛穎[3]、Wang[4]等人的研究發現：人參皂苷Rg3可以控制癌細胞轉錄因子，殺死黑素瘤細胞，從而達到抑制腫瘤細胞轉錄、增殖的作用。楊逸[5]等人發現人參皂苷Rg1可以降低小鼠免疫性的肝損傷，確定其具有的護肝作用。Zeng[6]等人發現人參皂苷Rh2具有一定抗腫瘤的作用。同時，人參皂苷在抗衰老[7]、延緩骨骼肌萎縮[8]方面也發揮著重要的作用。

野山參在嚴格的生態因子下，人參皂苷含量高于林下參、園參，臨床有效性強。但野生資源有限，價格高昂，已不具備批量應用價值。

1.2 連作園參和新林地園參

園參為人工毀林種植人參，除在外形上與野山參有所不同外，其有效成分也低于野山參。新林地園參在種植一茬以后，栽培地土壤理化性狀劣變、化感物質累積、農殘及重金屬增加、養分失衡、根際微生態系統失調和土傳病害增加等是導致人參連作障礙的重要因子，其中病蟲害是產生連作障礙的關鍵因素之一。人參栽培過程中所受的病蟲害種類較多，已報道的病害有40多種，種植過人參的地20年內不得重復栽參，否則會出現燒須、爛根等問題[9]。人參種植中的連作障礙是園參種植業的重要影響因素[10]。

連作園參通過微生物微生態環境、植物修復的綜合技術體系改善土壤理化性質實現了土壤物理結構調整、土壤營養增加、微生物群落優化、化感物質降解的目標。

本實驗中使用的連作園參是通過使用人參連作技術改良的園參與新林地園參中人參皂苷含量是否具有差異，來判斷該人參連作技術是否具有一定的抗人參連作障礙的作用和質量的優勢。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗儀器

表1 實驗儀器

2.1.2 實驗試劑

表2 實驗試劑

2.1.3 實驗藥材 園參，四年根，產地：吉林省汪清縣羅子溝鎮(吉林三龍環?？萍加邢薰?地塊1、地塊2。

連作園參，四年根，產地：吉林省汪清縣羅子溝鎮(吉林三龍環?？萍加邢薰?地塊3～地塊12。

2.1.4 結果分析軟件 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版功能：通過導入相關液相色譜圖，使用設參照譜、多點校正、自動匹配、生成對照等功能對需要的色譜圖進行比對分析?？梢缘玫竭@一批色譜圖的相似度等信息。

2.2 實驗步驟

2.2.1 連作園參和新林地園參的總皂苷提取 選取園參2種(樣方地1、樣方地2)，連作園參10種(樣方地3～樣方地12)去蘆頭，洗凈曬干，將12種樣品分別打成細粉，編號園參1號、園參2號、連作園參1號～連作園參10號。

信小娟等[11]將人參細粉用甲醇溶解后采用超聲提取、索氏提取法和微波提取法進行收率的比較，最后計算得出超聲提取法的收率是9.36%為最高；王中立等[12]提出用正丁醇反復萃取對分離人參中的脂類和多糖類成分結果較好；殷紅梅等人[13]用氨試液萃取人參醇提取液對分離人參中的大部分多糖和鞣質效果較好。故制定方案如下：

精密稱取園參1號樣品粉末3 g，選擇加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，棄去乙酸乙酯液；水液用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用氨試液洗滌2次，每次20 mL；再用正丁醇飽和水洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解，即可得園參1號供試品。

園參2號、連作園參1號～連作園參10號樣品的處理方法同上。

最終得到園參1號、2號樣品，連作園參1號～連作園參10號供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定1 mg的人參皂苷Rb1標準品，加1 mL甲醇溶解，得到Rb1的標準品溶液。人參皂苷標準品Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、S-PPD、S-Rg3、S-Rh2的配制方法同上。將上述11個標準品溶液均精密移取100 μL混勻后制成混合標準品溶液。

2.2.3 高效液相色譜法測定 根據占曉波等人[14]的色譜條件：Inertsil ODS-SP-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%的磷酸溶液為流動相B，柱溫30 ℃，檢測波長為203 nm。

結合實驗室條件，最終確定色譜條件為：Agilent extend C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.5%的磷酸溶液為流動相B，按表3中的指示進行梯度洗脫；柱溫30 ℃，檢測波長為203 nm，流速為0.5 mL·min-1。

表3 流動相洗脫表

將2.2.1下的12個供試品溶液和混標溶液過0.45 μm濾膜后轉移至液相進樣瓶中，進樣量為5 μL。即可得到園參1號、園參2號、連作園參1號～連作園參10號樣品溶液和混標溶液的高效液相色譜圖。(見圖1～圖3)

圖1 園參的高效液相色譜圖

圖2 連作園參的高效液相色譜圖

圖3 人參皂苷混標高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、2、4、8、16、30 μL分 別 注 入 HPLC中，按 照“2.2.3”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。結果以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到Rg1、Rb1、Re回歸方程和線性范圍，結果見表 2，各成分在各自濃度范圍內線性關系良好。

成分回歸方程r線性范圍/μg人參皂苷Rg1y=291327x-4882 60 99990 534～35 35人參皂苷Rb1y=209401x+146910 99980 562～30 54人參皂苷Rey=208695x+509430 99990 725～43 50

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取混合對照品溶液 10 μL，在“2.2.3”項色譜條件下重復進樣 6 次，計算人參皂苷Rg1、Rb1、Re的峰面積 RSD均小于 2.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取同一人參供試品溶液，分別于 0、2、6、12、18、24 h進樣，各色譜峰的峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性實驗 精密吸取同一人參供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下重復進樣6次，各色譜峰的峰面積 RSD 均小于2.0%，表明方法的重復性良好。

2.2.8 加樣回收率實驗 取已知含量的人參樣品約1 g，平行6份，精密稱定分別加入對照品適量，按“2.2.1”下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項色譜條件下進行分析，計算人參皂苷Rg1、Rb1、Re的平均加樣回收率分別為97.24%、98.95%、99.67%。

2.2.9 樣品的含量測定 按照“2.2.1”下方法制備12批供試品溶液，按“2.2.3”項色譜條件下分別測定人參皂苷Rg1、Rb1、Re的含量，含量測定結果見表4。

表4 12批人參樣品3種皂苷類成分的含量(%)

由表4可知，連作園參中人參皂苷Rg1、Rb1、Re的含量要高于新林地園參。

2.3 指紋圖譜的建立

本試驗利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版對2種園參和10種連作園參共計12個樣品的高效液相色譜圖進行分析比較，以探究其呈現的具有“指紋”意義的共有峰的相對保留時間、相對保留峰面積、相似度等數據。指紋圖譜的建立是為了明確連作園參和新林地園參的含量差異、為連作園參的質量控制提供科學依據。在2種園參樣品和10種連作園參樣品的高效液相色譜圖的基礎上，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版的軟件就可以建立上述12個樣品的高效液相色譜指紋圖譜，見圖4。

注：S1為園參1號樣品；S2為園參2號樣品；S3至S12為連作園參1號樣品至連作園參10號樣品；R為對照譜圖。圖4 2種園參和10種連作園參的高效液相色譜圖(檢測波長：203 nm)

2.3.1 精密度實驗 任意選取一個樣品按照2.2.1下方法制備供試品溶液，按2.2.3下條件連續進樣5次。計算各共有峰相對于內參比峰的相對保留時間和相對峰面積值的相對標準偏差(RSD)。結果見表5、表6。

表5 方法精密度的測試(相對保留時間)

由表5可知，相對保留時間的RSD值為0.099%～0.743%。

表6 方法精密度的測試(相對峰面積)

由表6可知，相對峰面積的RSD值為0.410%～1.600%，綜合二者，表明方法的精密度良好。

2.3.2 重現性實驗 按照2.2.1制備同一供試品溶液5份，按2.2.3下的液相條件進樣。計算各共有峰相對于內參比峰的相對保留時間和相對保留峰面積值的相對標準偏差。結果見表7、表8。

表7 方法重現性的測試結果(相對保留時間)

由表7可知，相對保留時間的RSD值為0.070%～0.140%。

表8 方法重現性的測試結果(相對峰面積)

由表8可知，相對峰面積的RSD值為1.400%～2.100%。綜合二者，說明方法重現性良好。

2.3.3 穩定性實驗 取一樣品按2.2.1下方法制成供試品溶液，按2.2.3下色譜條件分別于第0、4、12、24、48h進樣，計算各共有峰相對于內參比峰的相對保留時間和相對峰面積值的相對標準偏差。結果見表9、表10。

表9 樣品穩定性的測試(相對保留時間)

由9表可知，相對保留時間的RSD值為0.080%～0.220%。

表10 樣品穩定性的測試(相對峰面積)

由表10可知，相對峰面積的RSD值為0.500%～2.800%。綜合二者，說明樣品至少在48 h內穩定。

3 小結與討論

3.1 連作園參和新林地園參的高效液相色譜圖分析

連作園參和新林地園參的高效液相色譜可分離出40余個成分。經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版軟件的對比，從中選取7個具有“指紋”意義和穩定的共有峰，其中包括人參皂苷Rg1、Re、Rb1，見表11。

因人參皂苷Rb1峰面積較大且穩定，故將人參皂苷Rb1色譜峰定為參照峰。計算各共有峰的相對保留時間及相對保留峰面積，見表12、表13。

表11 連作園參和新林地園參的7個共有峰

表12 園參和連作園參的7個共有峰的相對峰面積

由表12可知，7個共有峰的相對保留時間的RSD值為0.110%～0.274%。

表13 人參和連作園參的7個共有峰的相對保留時間

表13可知，7個共有峰相對保留峰面積的RSD值在0.148%～0.591%。綜合二者，說明這7個共有峰均為有效峰。

3.2 指紋圖譜相似度計算

指紋圖譜通過比較導入到軟件中的所有色譜峰的面積大小是否相似，來表述各個樣品間的相似程度。相似度是一個通過研究指紋圖譜來分析中藥質量的穩定性的重要參考數據。指紋圖譜的相似度計算是以一張指紋圖譜為基礎，通過高效液相色譜峰積分信息之間的比對[15]得出結果。結果表明，以共有峰的面積作為一個比較的方向，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版軟件計算得到12種樣品的高效液相色譜指紋圖譜的相似度[16]，見表14。

表14 連作園參和新林地園參的指紋圖譜相似度比較

從表14可以看出，2批新林地園參的相似度在0.6以上，而10批連作園參的相似度在0.9以上。

4 結論與討論

本文將2種園參樣品和10種連作園參樣品的生曬參通過有機試劑萃取的方法分別提取人參總皂苷，再通過高效液相色譜儀對12批人參樣品中的人參皂苷Rg1、Rb1、Re進行含量測定，結果表明連作園參中的人參皂苷含量要高于新林地園參。將得到的12個樣品的色譜圖導入中藥指紋圖譜相似度評價系統A版軟件，就可以得到上述樣品的指紋圖譜。以人參皂苷Rb1為參照峰，對具有“指紋”意義的7個共有峰進行相對保留時間、相對保留峰面積和相似度的計算。結果表明，2批新林地園參的相似度在0.6以上，而10批連作園參的相似度在0.9以上，說明兩者之間的成分具有一定的差異性，結合含量測定結果，連作園參的質量要優于新林地園參，連作園參沒出現更嚴重的燒須、紅皮現象。

實驗證明，通過使用土壤改良技術對土地的土壤進行改良，不僅可以有效抵抗連作障礙，還可以提高人參藥材質量，為人參種植產業的大規模發展起到了巨大的推動作用。

[1] 李鳳林.人參莖葉皂苷藥理作用的研究進展[J].貴州農業科學2013，41(2)：54-57.

[2] 路放，楊世梅.人參藥理作用研究新進展[J].人參研究，2013，25(1)：46-52.

[3] 辛穎，倪勁松，姜新，等.20(S)-人參皂苷Rg3抑制腫瘤生長的作用[J].吉林大學報(醫學版)，2006，32(1)：61-64.

[4] Wang Q，Wu M Q，Zhao L H，Effect of ginsenoside Rh2on transplanted-tumor and expression of JAM in mice[J].China journal of Chinese materiamedica，2008，33(18)：2116-2119.

[5] 楊逸，覃筱燕，郭哲，等.人參皂苷Rg1對小鼠免疫性肝損傷保護作用[J].中國公共衛生，2015，31(3)：309-311.

[6] Zhen X L，Tu Z G，Induction of differentiation by ginsenoside Rh2in hepatocarcinoma cell SMMC-7721[J].Chinese journal of cancer，2004，23(8)：879-884.

[7] 劉曉暉.人參皂苷Rb1的研究進展[J].武警醫學院學報，2006，15(1)：82-84.

[8] 張巨.不同劑量二醇組人參皂苷對失神經骨骼肌萎縮的保護作用[J].吉林中醫藥，2009，29(12)：1095-1097.

[9] 李自博.人參連作對土壤真菌種類的影響[C].中國植物病理學會2014年學術年會論文集，2014：612-613.

[10] 吳連舉.人參連作障礙原因及其防治途徑研究進展[J].特產研究，2008，30(2)：68-72.

[11] 信小娟.不同提取方法對人參皂苷收率的影響[J].中國林副特產，2015(1)：34-35.

[12] 王中立.人參皂苷的提取及總皂苷純化工藝的研究進展[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2016，18(9)：1596-1601.

[13] 殷洪梅.HPLC-ELSD方法研究不同樣品處理方式對益心舒片中人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量測定的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2015，17(11)：2280-2284.

[14] 占曉波，朱峰.HPLC測定保健食品中西洋參總皂苷含量樣品處理研究[J].2013，25(7)：87-89.

[15] 陳珊珊.高山紅景天質量標準的建立及指紋圖譜研究[D].長春：吉林大學，2007，10(3)：22-23.

[16] 付娟，張海弢，王偉.芪白平肺顆粒HPLC指紋圖譜研究及其多指標成分定量分析[J].中草藥，2017，48(5)：918-992.

AKindofGinsengContinuousCroppingObstacleofSoilImprovementTechnologyEvaluationResearch

LIZhichen1，YANWei1，SONGWen1，HANJinglong2，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun，Changchun130117，China；2.JilinSanlongEnvironmentalProtectionTechnologyDevelopmentCo.LTD，Hunchun130117，China)

Objective：To evaluate a soil improving technology for ginseng continuous cropping obstacle through comparison of the character and HPLC fingerprint of continuous cropping garden and new woodland garden ginseng.MethodsThe total saponins were extracted，and the contents of saponins in ginseng were determined by HPLC.Finally，the similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprints was used to evaluate the total saponins of ginseng，and the parameters of the samples were compared with each other，and the similarity of the samples was calculated and analyzed.ResultsThe contents of ginsenoside Rb1，Rg1and Re in continuous cropping garden ginseng were higher than that in new woodland garden ginseng deforestation，and the fingerprints showed that the similarity of high performance liquid chromatograms of 10 kinds of plants was different.There is no more serious burning beard，red skin phenomenon on continuous cropping garden ginseng.ConclusionThe quality of continuous cropping ginseng is better than that of new forestland ginseng，which proves that the soil improvement technology has certain anti continuous cropping effect.

Continuous cropping garden ginseng；soil improving technology；fingerprints；quality

吉林省特色藥材炮制規范項目(PZ-2016-12)

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張輝，教授;研究方向：中藥化學；Tel：(0431)80812267，E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.022

2017-06-26)