棗縮果病果實內微生物多樣性的研究

楊卉芯,宋曉斌,岳子石

(西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100)

棗縮果病果實內微生物多樣性的研究

楊卉芯,宋曉斌,岳子石

(西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100)

比較七月鮮棗縮果病果實與健康果實內微生物的多樣性，探討棗縮果病與棗果實內微生物群落之間的關系。結果表明：在棗果微生物種群中，真菌是優勢類群，株數占58.06%～60.98%，比細菌多出近20%，無放線菌。在幼果期，相對多度最高的4個屬依次是交鏈孢屬Alternaria、莖點霉屬Phoma、青霉屬Penicillium和曲霉屬Aspergillus；白熟期后，有8個屬的真菌屬于優勢類群，相對多度最高的4個屬依次為交鏈孢屬、莖點霉屬、枝孢屬Cladosporium和單格孢屬Ulocladium，鐮刀菌屬Fusarium、盾殼霉屬Coniothyrium和曲霉屬次之，而且病果中優勢菌株的相對多度大于健果。果實發病后真菌占微生物的比例下降，細菌上升，而健果中則相反。健果中真菌微生物群落的多樣性和均勻性高于病果，隨著果實的不斷成熟，該趨勢越明顯。

七月鮮棗；棗縮果??；果實微生物多樣性

七月鮮棗Ziziphusjujubevar.qiyuexian作為陜西省的品種棗，具有早熟、大果、肉質酥脆、不易裂果、樹體矮小、早果性強、豐產穩產等特點[1]。但近年來由于陜北的氣候發生變化，降雨量和陰雨天氣明顯增多，并且集中在紅棗成熟的月份[2]，導致2008年至2011年期間棗縮果病在陜北清澗紅棗試驗站連年嚴重發生[3]。棗縮果病是棗樹的毀滅性病害，嚴重影響棗果的產量和品質[4]，20世紀70年代已有報道[5]。目前在我國的新疆、山西、陜西、河南、河北等省份的棗種植區均有發生，但在國外未見報道。棗縮果病的侵染規律目前還不清楚，病原菌可能在幼果期侵入果實，到近成熟期才開始表現癥狀[6]。人們對棗縮果病的病原眾說紛紜[7]。迄今為止，已公開報道過的棗縮果病的致病菌有10種真菌：輪紋大莖點菌MacrophomahawatsuhaiHara.[8-9]，聚生小穴殼菌DothiorellagregariaSacc.、橄欖色盾殼霉菌ConiothyriumolivaceumBon.、細交鏈孢菌AlternariatenuisNees.[10-11]，交互鏈孢菌Alternariaalternata(Fr.) Keissler、毀滅莖點霉PhomadesructivaPlowr.、殼梭孢菌Fusicoccumsp.、擴展青霉菌Penicilliumexpansum、細芽枝孢菌Cladosporiumtenuissimum[12-13],頭狀莖點霉Phomaglomerata[14]以及細菌：噬棗歐文氏菌ErwiniajujubovoraWang Cai Feng et Gao、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens[15]。侵染規律的復雜性和病原的不確定性造成了防治的困難，因此探討棗縮果病的病原問題依舊是研究的重點。

本文采用傳統分離培養方法結合分子鑒定手段研究了七月鮮棗果從幼果期到成熟期健果和病果內微生物多樣性及變化規律，初步揭示棗果內微生物類群與病害之間的關系。通過對其相關性的分析，為棗縮果病的發病機理和生物防治提供理論依據。

1 1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試棗果材料 從2015年7月開始，在陜西省榆林市清澗縣牛家灣村清澗紅棗試驗站棗園(E 109.09°，N 37.13°)，采集七月鮮棗的健康果實與發病果實。采用五點取樣法，每點定1株棗樹，每株棗樹按東、南、西、北4個方位隨機采集棗果。將棗果放入無菌樣品袋，采用冰盒(冰袋保鮮)運輸，帶回實驗室置于冰箱中保存，24 h內進行分離培養。

采樣時間 7月11日(幼果期)、21日、31日，8月11日(發病初期)、21日和9月1日(發病盛期)，當果實開始發病后，每次采樣將健果和病果分開。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，牛肉膏蛋白胨培養基(NA)，高氏一號培養基。

1.2 棗果實微生物的分離純化 參照常規的組織分離法[16]進行改良。將采集的棗果用蒸餾水沖洗干凈，用滅菌濾紙吸干表面殘余水分。切取果實表皮下果肉部分的病健交界處組織，切成約5 mm見方的小塊，用70%乙醇浸泡2 min后置于1%次氯酸鈉中浸泡3 min，用無菌水沖洗3次。用組織印記法驗證果實表面是否消毒干凈。把處理的組織塊分別接入PDA、NA、高氏一號培養基中培養。每個培養基中放入5個組織塊，擺放均勻，分別置于25℃、37℃和28℃的恒溫箱中培養，觀察記錄菌落生長情況。待組織塊長出菌落后，對于真菌則挑取菌絲尖端組織接種到PDA培養基上；對于細菌則仔細挑取單菌落，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液，于NA培養基上劃線純化；對于放線菌則從單菌落中挑取少許細胞接種到高氏一號培養基中獲得純培養。

1.3 棗果內微生物的鑒定 棗果內微生物的鑒定主要用形態學鑒定[17]，以菌落的形狀、顏色、質地、邊緣特征以及分生孢子器、分生孢子和產孢方式等作為鑒定依據，用分子鑒定方法以輔助。分子鑒定：用CTAB法提取真菌基因組DNA。采用通用引物對真菌ITS基因進行PCR[18]擴增(ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5：5′-GGA AGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)。PCR反應體系為25 μL：Taq PCR Master Max12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應條件為：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共34個循環，后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒( 北京天根生物技術有限公司) 純化，送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對分析。

1.4 數據處理 相對多度(relative abundance,RA)，植物樣本中分離到的某種或某一類微生物的菌株數量占分離到總菌株數量的百分率，能夠反映不同種類的微生物在總菌群中所占優勢程度。如果某微生物類群相對多度Pigt;1/S，則該類群為優勢菌群，如果Pilt;1/S，則該類群為次要類群[19]，S為微生物群落中類群總數。

微生物群落各相關指數計算[20]如下。

香儂—威納(Shannon-Wiener)指數：

均勻度指數(Pielou)：E=H/Hmax,Hmax=InS

其中：H、D為群落的多樣性指數，Pi為相對多度，S為棗果微生物群落中類群總數，即物種的豐富度。N是全部屬的菌株數總和，Ni是第i個屬的菌株數：群落中生物種類越多代表群落的復雜程度增高，即H值越大,多樣性越高；D值越大，表示優勢物種越少，也表示奇異度越高。E為群落的均勻度指數，Hmax為最大多樣性指數。E值越高，說明物種分布的均勻度越好。

2 結果與分析

2.1 健、病果實內微生物株數 當果實開始發病后，每次采樣將健果和病果分開，因此罹病果實的微生物株數從8月11日開始統計。棗果在不同時期分離到的微生物種類有真菌和細菌，無放線菌，且微生物總株數、真菌、細菌的株數均不同，隨著果實的成熟，數量呈上升趨勢。幼果期到綠熟期(7月11—31日)，分離出的微生物株數相對較低，總株數最高為82株，真菌和細菌最高分別為50和32株。白熟期(8月11日)時，健康果實內微生物的總株數達到了378株，真菌205株，細菌173株。發病果實中則更多，總株數404株，真菌261株，細菌143株。9月1日采樣時，果實內微生物的總株數，真菌數，細菌數均達到最大值。健康果實中總株數、真菌和細菌株數分別達到703株、440株、263株；發病果實中總株數、真菌和細菌株數分別是662株、354株、308株(表1)。因此白熟期是微生物迅速增長的時期。

表1 棗果微生物的菌株數量與組成 株

從不同的取樣期分離到的真菌和細菌中，均以真菌所占的比例最多(圖1)。從幼果期到綠熟期，真菌株數占58.06%～60.98%，細菌占39.02%～41.94%。真菌和細菌的比例相對穩定。

圖1 不同取樣期棗果實內真菌和細菌比例

白熟期時，部分果實開始表現縮果病癥狀，是縮果病發生的關鍵時期。在白熟期前后(7月31日—8月21日)，健康果實和發病果實中真菌和細菌所占比例有很大不同。在健康果實中，真菌所占的比例由60.98%下降至54.23%后上升至55.93%，細菌則由39.02%上升到45.77%后下降到44.07%。在發病果實中，真菌占比由60.98%上升至64.60%，后下降至55.77%；細菌則由39.02%下降至35.40%，后上升至44.23%。通過對比發現縮果病的發生與白熟期前后真菌和細菌在微生物總量中所占的比例有很大關系。病果中，真菌在發病前期占據絕對的優勢，大量繁殖。

從發病初期到盛期(8月11日—9月1日)，發病果實中真菌所占比例由64.60%下降至53.47%，細菌則隨病情加重而上升，由35.40%上升至46.53%，在此期間，健康果實中情形相反，真菌所占比例持續上升，54.23%～62.59%，而細菌則持續下降，45.77%下降至37.41%。在病果中，隨著果實的發病，細菌大量增殖。

2.2 七月鮮棗果微生物真菌區系 經鑒定，初步確定了45個屬的真菌，主要是半知菌和子囊菌類，其中交鏈孢屬、莖點霉屬的分布較為普遍，其次枝孢屬、單格孢屬、青霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、盾殼霉屬出現的幾率也很高(表2)。

不同采摘期棗果真菌區系不同。成熟度較低(7月11—31日)的棗果中分離出了17個屬，相對多度最高的4個屬依次是交鏈孢屬、莖點霉屬、青霉屬和曲霉屬。成熟度較高(8月11—9月1日)的棗果中共分離出了43個屬。有8個屬的真菌屬于優勢類群，相對多度最高的4個屬依次為交鏈孢屬、莖點霉屬、枝孢屬和單格孢屬，鐮刀菌屬、盾殼霉屬、曲霉屬和附球菌屬次之。其中8月11日采集的健果中，交鏈孢屬、莖點霉屬、枝孢屬和單格孢屬為優勢菌屬。病果中交鏈孢屬、莖點霉屬、單格孢屬、枝孢屬和附球菌屬是優勢菌屬。健果中除了交鏈孢屬的相對多度為25.37%，高于病果中21.84%以外，其余3個優勢菌屬的相對多度均小于病果。8月21日采集的健果和病果中，交鏈孢屬、莖點霉屬、單格孢屬、枝孢屬和盾殼霉屬是優勢菌屬。健果中只有枝孢屬的相對多度14.14%，高于病果中的9.83%，其余4個屬，均是病果中多。9月1日采集的健果中，交鏈孢屬、莖點霉屬、單格孢屬、鐮刀菌屬、枝孢霉屬、曲霉屬和盾殼霉屬均是優勢菌屬，病果中的優勢菌屬為交鏈孢屬、莖點霉屬、單格孢屬、鐮刀菌屬、枝孢屬和盾殼霉屬，除了枝孢屬的相對多度少于健果外，其余各屬的相對多度值均是病果中高。隨著果實的成熟，優勢菌群逐漸增多。病果中優勢菌屬的相對多度普遍大于健果。

表2 不同采摘期棗果微生物菌屬相對多度 %

續表

根據不同采摘期的優勢菌群的菌屬水平結構圖可以看出(圖2)，盾殼霉屬、單格孢屬和鐮刀菌屬的相對多度隨著果實成熟整體上呈上升趨勢，青霉屬和曲霉屬的相對多度隨著果實的成熟整體上呈下降趨勢。交鏈孢屬、莖點霉屬和枝孢屬病原菌為棗果的弱寄生菌，在幼果期時就寄生在果實內，一旦條件成熟，便發展為致病菌。已報道的病原菌大都屬于上述幾類相對多度較高的真菌屬。

圖2 健果與病果中優勢菌群菌屬水平結構組成

2.3 七月鮮棗果微生物群落多樣性 從圖3和圖4可以看出，隨著果實的不斷成熟，健康棗果內真菌的香儂—威納指數和辛普森指數呈波動性增加的趨勢。最后一次采樣時，香儂—威納指數和辛普森指數均達到高峰，分別是2.715和0.897；從圖5可以看出均勻度指數呈現先下降后上升的趨勢。其中第2次采集的棗果中，均勻度指數最高為0.887，白熟期(8月11日)時，數值下降至最低0.713,隨后開始緩慢上升，9月1日采集的棗果中均勻度指數為0.758。從整體來看，成熟度低的棗果均勻度高于成熟度較高的棗果，白熟期棗果的均勻度最差。

病果中的香儂—威納指數隨著病情的加重，數值從2.483下降至2.275，辛普森指數則無明顯變化；從均勻度指數的數值可以看出，病果中的均勻度指數也呈下降趨勢。

果實出現病癥后(8月11日至9月1日)，香儂—威納指數和辛普森指數均顯示健康果實內的多樣性高于發病果實內真菌群落的多樣性。均勻度指數也顯示出健康果實內真菌群落的均勻性高于發病果實內真菌群落的均勻性。

圖3 不同采摘期棗果微生物群落香儂—威納指數

圖4 不同采摘期棗果微生物群落辛普森指數

圖5 不同采摘期棗果微生物群落均勻度指數

3 討論

通過對健、病果實微生物株數分析發現，幼果期分離出的棗果微生物菌株數相對較少，白熟期后健果和病果中分離得到的菌株數量均呈迅速上升趨勢，并且有部分果實開始出現癥狀。分析其原因可能是白熟期時，氣溫高，陽光充足，果實生長快，Vc、酚含量迅速下降，而可溶性糖含量增長速度加快，致使棗果系統抗性下降，為微生物的定殖、生長提供了良好條件，微生物數量在這段時期增長迅速。此時，更利于病菌的侵染，因此果實在白熟期開始發病。伴隨著果實的成熟，微生物的數量越來越多，繁殖速度也越來越快，最后一次采樣時，數量達到最多。而前3次所采集的樣品，果實成熟度不足，果實果肉中含有過多的果酸、Vc、總酚等抑制了微生物的定殖生長，致使真菌、細菌的數量較低。因此白熟前期是防治縮果病的關鍵時期。

從不同的取樣期分離到的真菌和細菌所占的比例來看，初期病果分離時，真菌占據絕對的優勢，在發病中后期的病果中，細菌大量增殖，其增殖速率大于真菌。微生物種群分布由真菌型向細菌型轉變。這也間接說明前期的發病與真菌有關，后期的發病與細菌有關。這與羅學平研究得出的觀點一致[21]。

本研究從1440塊棗果實組織塊中共分離到了2079株真菌，其中2059株真菌經鑒定屬于45個屬。無論從數量上，還是種類上都表明七月鮮棗果具有豐富的真菌多樣性。交鏈孢屬、莖點霉屬、枝孢屬在果實不同時期均能分離到，具有生態穩定性。還有個別屬真菌僅在某個時期分離到，如曲霉屬、青霉孢屬、鐮刀菌屬、附球菌屬等，說明這些屬的真菌屬于機會菌，無穩定性。不同成熟度的棗果中分離出的優勢菌屬不同，可能是果實在不同發育時期外部和內部的環境不同，造成了不同的真菌類群的侵入和定殖。李冬霞[22]從六月鮮、灰棗、雞心棗與九月青4個品種的果實中分離得到的優勢菌屬為交鏈孢屬和莖點霉屬，與本研究分離七月鮮品種一致，但總體上分離得到的真菌屬的種類較少。楊憶[23]針對白熟期灰棗健康棗果可培養內生真菌菌群進行了分析和鑒定，其中分離到的交鏈孢屬、莖點霉屬以及鐮刀菌屬與本研究一致，而蠕孢屬真菌、假尾孢屬和間座殼屬真菌，本研究未分離到。分析原因可能是地理環境和氣候條件的不同影響植物內生菌的定殖[24]。這種差異也正反映了微生物對環境的適應性。

目前關于棗果實真菌多樣性的研究還很少。本研究表明，果實發育中各個時期，真菌的多樣性和均勻度有所不同，并且健果的多樣性和均勻度均大于同時期的病果。據此可以推測健康果實內的真菌可能對潛在的病原菌存在競爭和拮抗作用，不利于病原菌發展成為優勢菌屬。群落的多樣性與均勻度高說明群落內部組成成分與關系復雜，此時各種真菌的生長會受到其他真菌的限制與約束，同樣，潛在的病原菌也不能在植物體內肆意擴張，其數量水平處于發病條件以下。當果實開始出現病害癥狀，真菌群落的多樣性和均勻度隨著果實的發病呈下降趨勢，病原菌便有機會發展成了相對分離頻率較高的真菌種類，本研究中果實發病后分離出的優勢菌屬的相對多度普遍大于健康果實內優勢菌屬的，而且分離出的優勢菌屬大部分是已報道過的病原菌。由于它們在群落中占據絕對優勢，若進一步擴展，病害就會不斷加重。

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(責任編輯 楊靜莉)

DiversityanalysisofmicrobialcommunityinZiziphusjujubesufferedfromjujubeshrinkdisease/

YANG Huixin,et al,

(College of Forestry,Northwest Aamp; F University,Yangling,Shanxi 712100,China)

The aim of the study is to learn the microbial community diversity in both healthy fruit ofZiziphusjujubevar.qiyuexianand infected fruit of jujube shrink disease and preliminarily reveal the correlation between the microbial community and the disease.The result showed that 58.06%-60.98% of the microbes isolated in the jujube fruit was fungi,about 20% more than bacteria,and actinomycetes were not isolated.At the stage of young fruit,there were four genera with the highest relative abundance which were orderlyAlternaria,Phoma,PenicilliumandAspergillus.When the fruit entered the white-ripening stage,the dominant genera had risen to eight.The four genera with the highest relative abundance wmzh were orderlyAlternaria,Phoma,CladosporiumandUlocladium,Fusarium,ConiothyriumandAspergilluswere common at the stage.The relative abundance of the most dominant genera in diseased fruit was larger than that of healthy fruit.Fungi rate of microorganism on diseased fruit showed a declined tendency while the bacteria showed a decrease tendency.In the healthy fruit,the reverse happened.Both richness index and evenness index of fungi community in healthy fruit were larger than those in diseased fruit.With the fruit ripening,this trend was becoming more obvious.

Ziziphusjujubevar.qiyuexian;jujube fruit shrink disease;microbial diversity of fruite

2016-04-06

林業公益性行業科研專項“棗樹重大病蟲害防治及優質商品棗安全生產技術研究”(201104017)；陜西省國際統籌項目(2013KTZB02-03-01)

楊卉芯( 1989—)，女，河南省許昌市人，碩士研究生，研究方向：植物病理學，E-mail:598053148@qq.com

宋曉斌，副研究員，研究方向：森林病害及其防治，E-mail:sxb88@nwsuaf.edu.cn。

S763.1

A

1671-0886(2017)01-0029-07