抗鈉鈣交換體特異位點抗體對大鼠單個心室肌細胞鈣瞬變的影響①

白曉潔 吳博威

(山西醫科大學生理學系，細胞生理學山西省重點實驗室,太原 030001)

抗鈉鈣交換體特異位點抗體對大鼠單個心室肌細胞鈣瞬變的影響①

白曉潔 吳博威

(山西醫科大學生理學系，細胞生理學山西省重點實驗室,太原 030001)

目的觀察抗鈉鈣交換體(Sodium calcium exchanger，NCX)特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對正常成年大鼠心室肌細胞鈣瞬變的影響。方法利用Langendorff灌流方法，分離得到單個大鼠心室肌細胞；負載熒光染料Fura-2/AM和2%牛血清白蛋白后，利用離子影像分析系統記錄激發光為340 nm和380 nm時心室肌細胞成對系列圖像，計算鈣瞬變峰值(F340/F380)、細胞鈣恢復90%時程(TR90)以及鈣敏感性(F340/F380與細胞縮短數值的比值)。結果抗NCX特異位點抗體可以增加正常成年大鼠單個心室肌細胞F340/F380，縮短TR90，對鈣敏感性無顯著影響；尼卡地平和KB-R7943分別預處理心室肌細胞可以抵消大部分抗體對F340/F380和TR90的增加或縮短效應，聯合使用二者預處理心室肌細胞后，該抗體對鈣瞬變不再有顯著影響。結論抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體可以增加心室肌細胞鈣瞬變峰值，同時縮短細胞鈣恢復時程，這種效應主要與其激動L-型Ca2+通道和NCX的作用有關。

Na+-Ca2+交換體；抗體；鈣瞬變；心室肌細胞；L-型Ca2+通道

胞漿內Ca2+是介導心室肌細胞興奮-收縮耦聯的關鍵因子，Ca2+濃度的變化也是觸發心室肌細胞收縮和舒張的離子基礎，在心肌變力性的研究中，介導Ca2+轉運的膜蛋白是研究者關注的焦點。鈉鈣交換體(Sodium calcium exchanger，NCX)是心室肌細胞膜上介導膜內外Na+和Ca2+轉運的雙向離子轉運體，對于維持細胞內Na+和Ca2+穩態具有重要的作用。在前期的研究中，我們依據NCX分子結構中重要的功能片段α-1重復序列124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145合成人工肽段，對大鼠進行免疫，獲取高濃度抗體，并對該抗體進行特異性檢測。實驗結果表明，該抗NCX特異位點抗體具有增強大鼠心室肌細胞NCX電流的作用，同時對L-型Ca2+電流和Na+-K+泵電流也有一定的激動效應。在離體灌流正常大鼠心臟實驗中該抗體表現出同時增強心臟收縮和舒張功能的作用[1,2]。為了深入研究該抗體提高心肌變力性的細胞內機制，我們進一步觀察了其對單個心室肌細胞鈣瞬變的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 實驗選用Wistar大鼠，雌雄不限，體重250～300 g(由本校實驗動物中心提供)。主要試劑包括：KB-R7943(Sigma)，尼卡地平(Nicardipine，Sigma)，純化的抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體[1]，Fura-2/AM(Sigma)，牛血清白蛋白(BSA，Sigma)，其余均為國產分析純試劑。

臺氏液成分(mmol/L)：NaCl 140、KCl 5.4、NaH2PO30.33、HEPES 5.0、葡萄糖10.0、MgCl21.0、CaCl21.8，用NaOH調pH值至7.4。

主要儀器設備：離子影像分析系統(Ion Imaging system，Tillphotonics Inc，德國)；BPS-4灌流裝置(ALA Scientific Instruments Inc，美國)；倒置熒光顯微鏡(Zeiss，德國)；刺激器(Nihon Kohden Inc，日本)。

1.2實驗方法 采用Langendorff心臟灌流方法，平衡穩定后以含有膠原酶P(0.1 g/L)、CaCl2(75 μmol/L)以及?；撬?20 mmol/L)的臺氏液繼續灌流10～20 min，用眼科剪剪下心室肌組織，置于高K+Krebs buff(KB)液中輕輕吹打，過150 μm不銹鋼篩網后，室溫保存備用[1]。

取出保存在KB液內的心室肌細胞，正常臺氏液(含鈣18 mmol/L)復鈣，負載熒光染料Fura-2/AM和2%BSA(37℃孵育40 min)，臺氏液清洗細胞后備用。

將細胞置于灌流槽中，臺氏液持續灌流(1～2 ml/min)。灌流槽底部兩端連接有細鉑絲，鉑絲末端與刺激器相連，用10 V電壓以0.5 Hz頻率給予場刺激觸發細胞收縮。離子影像分析系統記錄激發光為340 nm和380 nm時的成對系列圖像，并計算340 nm/380 nm的熒光比值(F340/F380)，即為鈣瞬變峰值。鈣敏感性為F340/F380與細胞縮短數值的比值[3]。

2 結果

2.1抗NCX特異位點抗體可以增強單個心室肌細胞鈣瞬變峰值，縮短細胞鈣恢復時程 實驗結果表明，抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAA-FNMF145抗體(40 nmol/L)可以增加單個心室肌細胞鈣瞬變峰值(F340/F380)，同時縮短TR90(time to 90% restore)(P<0.01，圖1、表1)。陰性IgG組與對照組相比，無顯著性差異。該抗體對鈣敏感性無顯著影響，表明其對心室肌細胞變力性作用與收縮蛋白鈣敏感性關系不大。

2.2尼卡地平或KB-R7943預處理心室肌細胞可以分別抵消抗NCX特異位點抗體對心室肌細胞鈣瞬變峰值和細胞鈣恢復時程的作用 利用特異性較高的NCX抑制劑KB-R7943和L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平分別預處理心室肌細胞后，再次觀察抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對心室肌細胞鈣瞬變峰值和細胞鈣恢復時程的作用是否發生變化。

實驗結果表明，KB-R7943(10 nmol/L)預處理心室肌細胞后，心室肌細胞F340/F380較未處理前輕微下降，同時TR90延長。再加入抗NCX特異位點抗體，心室肌細胞F340/F380明顯增加(P<0.01)，TR90無明顯變化(P>0.05，圖2、表2)。

尼卡地平(1 μmol/L)預處理心室肌細胞后，心室肌細胞F340/F380較未處理前顯著下降(P<0.05)，TR90無明顯變化(P>0.05)。再加入抗NCX特異位點抗體后，F340/F380有增加趨勢，但不顯著(P>0.05)，TR90顯著下降(P<0.05，圖3、表2)。

2.3聯合使用KB-R7943和尼卡地平預處理心室肌細胞，抗NCX特異位點抗體對心室肌細胞鈣瞬變峰值和細胞鈣恢復時程不再具有顯著影響 聯合使用KB-R7943(10 nmol/L)和尼卡地平(1 μmol/L)預處理心室肌細胞后，F340/F380下降(P<0.01)，TR90延長(P<0.05)，表明心室肌細胞的收縮和舒張活動都受到一定程度的抑制。再給予抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體，F340/F380和TR90無顯著變化(P>0.05，圖4、表2)。

圖1 抗NCX特異位點抗體對大鼠單個心室肌細胞鈣瞬變的影響Fig.1 Effect of site specific antibody of NCX on Ca2+ transient in single ventricular myocyte

表1抗NCX特異位點抗體對心室肌細胞鈣瞬變的影響

Tab.1EffectsofsitespecificantibodyofNCXonCa2+transientinsingleventricularmyocyte

GroupsnF340/F380TR90(ms)Ca2+sensitivityControl5188.30±18.88305.56±55.9152.43±9.61NegativeIgG5189.58±14.68305.49±30.5453.08±12.75Antibody5219.54±5.541)198.33±17.791)43.90±4.02

Note：TR90.Time to 90% restore；1)P<0.01 vs control.

圖2 KB-R7943預處理可以抵消抗NCX特異位點抗體對大鼠單個心室肌細胞TR90的降低作用Fig.2 KB-R7943 abolished decrement of TR90 induced by site specific antibody of NCX in single ventricu-lar myocyte

表2KB-R7943和/或尼卡地平預處理后抗NCX特異位點抗體對心室肌細胞鈣瞬變的影響(n)

Tab.2EffectsofsitespecificantibodyofNCXonCa2+transientinsingleventricularmyocytepretreatedwithKB-R7943and/orNicardipine(n)

GroupsF340/F380TR90/msControl188.18±22.63310.25±30.58KB-R7943165.21±22.37337.86±25.98Nicardipine125.33±8.702)312.58±29.15KB-R7943+Nicardipine107.59±16.902)356.73±17.85KB-R7943+antibody205.13±20.821)325.97±48.25Nicardipine+antibody134.05±10.872)247.43±45.211)KB-R7943+Nicardipine+antibody102.76±22.752)343.07±24.36

Note：1)P<0.05 vs control，2)P<0.01 vs control.

圖3 尼卡地平預處理可以抵消抗NCX特異位點抗體對大鼠單個心室肌細胞F340/F380的增加作用Fig.3 Nicardipine abolished increment of F340/F380 induced by site specific antibody of NCX in single ventricular myocyte

圖4 KB-R7943和尼卡地平聯合預處理心室肌細胞后抗NCX特異位點抗體對鈣瞬變不再有顯著影響Fig.4 Site specific antibody of NCX had no significant effect on Ca2+ transient in presence of KB-R7943 and Nicardipine in single ventricular myocyte

3 討論

NCX是心室肌細胞膜上調節細胞內外Na+、Ca2+穩態的重要轉運體，為了能更好地對其功能進行研究，在前期實驗中，我們依據NCX分子結構中重要的功能片段α-1重復序列124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145合成人工肽段，免疫大鼠后經純化得到相應的多克隆抗體。經全細胞膜片鉗檢測發現，該抗體對NCX正向及反向電流均具有激動作用，同時對L-型Ca2+通道和Na+-K+泵也表現出一定程度的激動效應，對其他細胞膜上的主要離子通道電流無顯著影響[1]。在離體灌流大鼠心臟實驗中，該抗體表現出同時增強心臟收縮和舒張功能的作用[2]。為了深入研究其作用的細胞機制，我們在單個心室肌細胞水平，利用離子成像系統觀察該抗體對鈣瞬變峰值F340/F380和細胞鈣恢復時程TR90的影響，同時利用特異性較高的NCX抑制劑KB-R7943和L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平分別或聯合預處理心室肌細胞，探討激動NCX、L-型Ca2+通道以及Na+-K+泵在該抗體增強心臟功能中的作用貢獻。實驗結果表明，該抗NCX特異位點抗體主要是通過激動L-型Ca2+通道和NCX影響心室肌細胞內鈣瞬變峰值以及細胞鈣衰減速率實現其對心室肌細胞收縮和舒張活動的增強作用，激動Na+-K+泵的效應對于心室肌細胞收縮舒張活動沒有直接的影響。

NCX在心室肌細胞膜上存在正向和反向兩種轉運模式，分別介導3Na+入胞/1Ca2+出胞和3Na+出胞/1Ca2+入胞。生理狀態下，NCX主要以正向模式為主，介導心室肌細胞舒張期Ca2+外排，但是也有報道認為在動作電位早期，NCX以反向模式介導Ca2+內流，參與細胞內“鈣觸發鈣釋放(Calcium induced calcium release，CICR)”的過程。L-型Ca2+電流是心室肌細胞平臺期的主要內向電流，由其介導的Ca2+流入是CICR的主要機制，因此也是心室肌細胞收縮幅度的決定性因素[4]。Na+-K+泵雖然不直接介導Ca2+的跨膜轉運，但是Na+-K+泵活動增強形成的細胞膜電位超極化以及細胞外Na+濃度增加，可以間接促進NCX的正向模式，抑制其反向模式轉運[5]。在本實驗中，抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體可以增加單個心室肌細胞F340/F380，同時減小TR90，這些結果與前期離體心臟灌流實驗中該抗體同時增強心臟收縮和舒張的功能相一致[2]。NCX抑制劑KB-R7943預處理心室肌細胞可以消除該抗體減小TR90的大部分效應，L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平預處理心室肌細胞可以消除該抗體增強F340/F380的大部分效應，聯合使用二者預處理細胞后該抗體對心室肌細胞鈣瞬變的作用幾乎完全消失。這些實驗結果表明：抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對心臟收縮舒張的增強作用主要是通過其激動L-型Ca2+通道和NCX的作用實現的，其中增強NCX可以加速其正向模式，促進心室肌細胞舒張時Ca2+的外排，而激動L-型鈣通道主要表現在增強心室肌細胞收縮時細胞內Ca2+濃度升高的程度，這些實驗結果與我們的預期一致。聯合使用NCX抑制劑KB-R7943和L-型Ca2+通道抑制劑尼卡地平預處理心室肌細胞后，抗體對心室肌細胞鈣瞬變的作用幾乎完全消失，我們推測該抗體對Na+-K+泵的激動作用不直接參與其通過改變Ca2+濃度變化的幅度和速度而增強心室肌細胞收縮舒張功能的效應，但是不排除Na+-K+泵活動增強可以間接地促進NCX的正向模式，進而增強心室肌細胞舒張功能。

通過上述研究，我們發現該抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對于心室肌細胞膜離子通道和轉運體的多靶點激動構成了一種新的強心模式組合，激動L-型Ca2+通道可以增強心肌細胞收縮功能，激動NCX和Na+-K+泵則促進心肌細胞的舒張功能。在臨床實踐中，盡管強心藥物在目前心力衰竭的治療地位有所下降，但在某些特定情況下仍然是必不可少的手段，我們會進一步研究這種抗NCX特異位點124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗體對于急性、慢性心力衰竭模型的強心效應。另外，由于激動Na+-K+泵可能會加重心臟耗能，我們會聯合使用改善心肌細胞能量代謝的藥物[6]，以求達到更理想的實驗效果，為臨床心力衰竭治療提供新的思路。

[1] 白曉潔，吳博威.抗鈉鈣交換體特異位點抗體對心肌鈉鈣交換電流的激活作用及其與鈣通道、鈉泵的交叉反應[J].中國病理生理雜志，2008，24(6)：1078-1083.

[2] 白曉潔，封啟龍，吳博威.抗鈉鈣交換體特異位點抗體對離體大鼠心臟和血管活動的效應及其與哇巴因、(±)Bay K8644作用的比較[J].中國病理生理雜志，2013，29(10)：1793-1797.

[3] 崔香麗，周尚忠，吳博威.離子影像系統測定分離的單個心肌細胞鈣瞬變和收縮[J].山西醫科大學學報，2002，33(5)：461-463.

[4] Viatchenko-Karpinski S,Terentyev D,Jenkins LA,etal.Synergistic interactions between Ca2+entries through L-type Ca2+channels and Na+-Ca2+exchanger in normal and failing rat heart[J].J Physiol，2005，567(Pt 2):493-504.

[5] Moon Young Kim,Geun Hee Seol,Guo Hua Liang,etal.Na+-K+pump activation inhibits endothelium-dependent relaxation by activating the forward mode of Na+/Ca2+exchanger in mouse aorta[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005,289(5):H2020-H2029.

[6] 田 穎，祝善俊，王 江，等.衰竭心肌能量代謝重構及相關受體的表達[J].中華內科雜志，2007,46(9)：740-742.

EffectsofsitespecificantibodyofNa+-Ca2+exchangeroncalciumtransientinsingleventricularmyocytesofrats

BAIXiao-Jie,WUBo-Wei.

DepartmentofPhysiology,ShanxiKeyLaboratoryofCellularPhysiology，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001,China

Objective:To investigate the effects of site specific(124HNFTAGDLGP STIVGSAAFNMF145)antibody of Sodium calcium exchanger(NCX) on calcium transient in single ventricular myocytes of normal adult rats.MethodsIsolated adult rat hearts were perfused using Langendorff method and single ventricular myocytes were then obtained.The ventricular myocytes were incubated with Fuar-2/AM and 2% bovine serum albumin for about 40 min and then,the fluorescence images were recorded when excitation wavelengths were 340 nm and 380 nm using ion imaging system.Fluorescence value F340/F380,length of cell shortening,time to 90% restore(TR90)and calcium sensitivity(ratio of F340/F380 and cell shortening) were calculated.ResultsThe site specific antibody of NCX increased F340/F380 and decreased TR90in single ventricular myocytes,but had no more significant effect on calcium sensitivity.Pretreatment with KB-R7943 or Nicardipine could significantly inhibit the TR90decrease or F340/F380 increase induced by the antibody.Pretreating ventricular myocytes with combination of KB-R7943 and Nicardipine,the antibody had no more significant effects on calcium transient.ConclusionSite specific (124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145)antibody of NCX could increase calcium transient and accelerate the decrease of intracellular calcium during diastole,which mainly related to its effects of activating L-type Ca2+channel and NCX.

Na+-Ca2+exchanger;Antibody;Calcium transient;Ventricular myocyte;L-type Ca2+channel

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.008

R331.3

A

1000-484X(2017)12-1795-04

白曉潔(1973年-)，女，博士，副教授，主要從事循環生理學方面研究，E-mail：baixiaojie_1973@163.com。

[收稿2017-07-04]

(編輯 倪 鵬)