B細胞銜接蛋白BANK在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎中的作用①

金桂花 李紅花 李 雪 藤本·學 張慶鎬

(延邊大學醫學院免疫學與病原生物學教研室，延吉 133002)

B細胞銜接蛋白BANK在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎中的作用①

金桂花 李紅花 李 雪 藤本·學②張慶鎬③

(延邊大學醫學院免疫學與病原生物學教研室，延吉 133002)

目的探討B細胞特異性銜接蛋白BANK(B cell adoptor protein with ankyrin repeats)在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)中的作用。方法MOG35-55多肽免疫C57BL/6鼠和BANK缺陷(BANK-deficient,BANK-/-)鼠制備EAE模型，觀察實驗動物臨床癥狀及中樞神經系統的病理學變化；提取小鼠腦組織及脾臟，經流式細胞術檢測中樞神經系統及外周免疫器官中的CD4+T細胞、CD8+T細胞及調節性T細胞的變化。結果BANK-/-鼠EAE臨床癥狀評分明顯高于C57BL/6鼠，且體重減輕明顯(P<0.05)；HE染色結果顯示，BANK-/-鼠較C57BL/6鼠炎癥感染灶明顯增多。流式細胞術結果顯示，相對于C57BL/6鼠BANK-/-鼠中樞神經系統中CD8+T細胞百分比明顯增多，而脾臟中調節性T細胞百分比明顯減少，CD4/CD8比值倒置(P<0.05)。結論B細胞銜接蛋白BANK的表達抑制EAE炎癥反應。

B細胞;B細胞銜接蛋白;BANK;EAE

多發性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)是以中樞神經系統脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)被認為是研究MS的理想動物模型[1]。長期以來MS被認為是T細胞介導的自身免疫性疾病，然而近來的研究報道，B細胞在MS發病中起到潛在決定性作用，但具體機制尚不明確[2,3]。

細胞的發育、分化和激活是發揮免疫應答功能和免疫調節功能的前提。上述過程的有效實施，依賴于細胞表面的刺激信號，進而啟動核轉錄因子及相關效應分子基因活化，還需要眾多細胞內蛋白分子的聯動和協同作用。銜接蛋白就是這類參與細胞信號轉導調節中的重要分子。銜接蛋白無酶活性，通過參與信號轉導中蛋白質與蛋白質間的反應，為大分子復合物的形成提供支架，從而介導胞內信號的整合與傳遞[4,5]。研究證明，銜接蛋白分子的異常表達會引起免疫功能的異常，甚至免疫疾病的發生。已發現的B細胞銜接蛋白有3種，包括BANK(B-cell adoptor protein with ankyrin repeats)，BLNK(B-cell linker protein,BLNK)和BCAP(B-cell adaptor for PI3K)[6-9]。我們前期研究發現，BLNK缺陷導致B細胞功能缺失，導致BLNK-/-鼠EAE癥狀加重[10]。但是，BANK是否也參與EAE的發病和發展，相關報道罕見。本研究擬采用BANK缺陷鼠(BANK-/-鼠)通過建立EAE小鼠模型，明確B細胞銜接蛋白BANK和EAE發病和發展的相關性，本研究結果有助于揭示免疫調節分子與自身免疫性疾病的內在聯系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 野生型C57BL/6鼠和BANK-/-鼠(C57BL/6)鼠購自美國Jackson實驗室，采用6～8周齡雌性鼠，實驗動物飼養于無特異性病原體的清潔環境中。

1.2方法

1.2.1EAE小鼠模型的制備 將100 μg MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)加入100 μl完全弗氏佐劑(含結核桿菌終濃度為2 mg/ml)中乳化，將制成抗原配劑。實驗小鼠經皮下注射200 μl抗原配劑，第0天和第2天腹腔注射500 μl百日咳毒素(含200 ng百日咳毒素)制備動物模型[11]。

1.2.2體重變化及臨床癥狀評分 每天觀察小鼠的體重變化及臨床癥狀，連續觀察28 d。臨床癥狀評分標準如下：0分，不發??；1分，尾部張力低下；2分，步態笨拙或翻身反射消失；3分，雙側后肢部分麻痹；4分，后肢完全麻痹；5分，后肢麻痹伴前肢肌力下降；6分，前肢麻痹或瀕死狀態[11]。

1.2.3腦和脊髓組織的病理學改變 MOG35-55免疫后第16～18天處死小鼠，打開胸腔先經左心室灌注PBS緩沖液，然后緩慢灌注預冷4%多聚甲醛固定液后取腦和脊髓組織。組織經福爾馬林固定，石蠟包埋用于蘇木精伊紅(HE)染色，觀察病理學改變及炎癥細胞浸潤。HE染色標本在400倍光鏡下計數炎癥細胞，實質內浸潤的炎性細胞數等于或超過20個的區域作為一個炎癥感染灶。

1.2.4腦組織中淋巴細胞的分離 誘導EAE后的第18天處死小鼠，經左心室灌注50 ml PBS緩沖液后取小鼠腦組織。組織經膠原酶D(Sigma-Aldrich)和DNase Ⅰ(Sigma-Aldrich)消化45 min，采用Percoll不連續密度梯度沉淀法(70/37%)分離純化腦組織中的淋巴細胞。分離純化的淋巴細胞制備細胞懸液(1×106cell/ml)用于流式細胞術的檢測。

1.2.5淋巴細胞的流式細胞術檢測 誘導EAE后的第18天處死小鼠制備淋巴細胞懸液。染色用熒光抗體包括Thy1.2(53-2.1)、CD4(RM4-5)、CD8(53-6.7)、CD25(PC61)及Foxp3(FJK-16s)。調節性T細胞的細胞內染色采用Fixation/Permeabiliz-ation(eBioscience)進行破膜固定。應用同種型對照免疫球蛋白作為背景染色。數據分析使用FlowJo軟件。

2 結果

2.1臨床癥狀評分及體重的變化 如圖1所示，BANK-/-鼠臨床評分始終明顯高于野生鼠(P<0.01)，且臨床癥狀減輕緩慢，小鼠自出現臨床癥狀開始出現食欲下降，繼而出現體重減輕(結果未顯示)。在疾病的高峰期BANK-/-鼠臨床評分為(3.5±0.2)，與野生鼠相比具有顯著統計學意義(2.8±0.3，P<0.01)。見圖1、表1。

2.2動物發病情況 小鼠平均第9～11天開始出現臨床癥狀，第15～19天癥狀達高峰，隨著時間的推移，癥狀可自行緩解。大部分小鼠以平衡失調為首發癥狀，個別小鼠以尾部張力下降為首發癥狀，繼而小鼠出現后肢無力拖地、后肢麻痹、前肢麻痹、抽搐等癥狀。對照組和實驗組小鼠發病率均為80%以上，死亡率無統計學意義(P> 0.05)。見表1。

圖1 BANK的缺失加重EAE反應Fig.1 Enhanced EAE response in BANK-/-miceNote: EAE were induced by MOG peptide immunization in wild-type and BANK-/-mice.Clinical score(±s)from ≥ 10 mice in each group.Significant differences between means of EAE clinical scores are indicated.*.P<0.05.

表1EAE臨床癥狀評分

Tab.1EAEclinicalscoresfollowingMOGtreatmentA

GroupsIncidenceBMortalityMeandayofonsetMeanmaxiumscoreWild-type9/11(81.8%)1/11(9.1%)10.8±0.52.8±0.3BANK-/-12/12(100%)2/12(16.7%)10.5±0.33.5±0.21)

圖2 野生鼠和BANK-/-鼠中樞神經系統的組織病理學變化Fig.2 Histopathology of CNS in wild-type and BANK-/-miceNote: A.Brain;B.Spinal cord.Representative brain and spinal cord sections harvested 17 days after MOG immunization by HE staining.Top and bottom panels are low and high magnifications,respectively.Arrows point to the foci of inflammatory area.Similar results were obtained in at least 2 independent experiments.

2.3腦和脊髓組織的病理學改變 HE染色結果顯示，BANK-/-鼠中樞神經系統中炎癥感染灶明顯多于C57BL/6鼠，浸潤的細胞以淋巴細胞為主。在炎性細胞浸潤明顯的區域可見脊髓有不同程度的丟失，見圖2。

2.4腦組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞與調節性T細胞的變化 流式細胞儀檢測結果顯示，相對于野生鼠BANK-/-鼠腦組織中CD8+T細胞百分比明顯增多，兩組小鼠之間具有統計學意義(P<0.05)，而調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)數量無明顯改變(P> 0.05)，見圖3。

圖3 野生鼠和BLNK-/-鼠腦組織中淋巴細胞的浸潤Fig.3 Lymphocyte infiltration from spleen in wild-type and BANK-/-miceNote: CD4+ T cells and CD8+ T cells(A)and CD4+CD25+ FoxP3+ regulatory T(Treg)cells(B)from brain were analyzed by flow cytometry.

圖4 野生鼠和BLNK-/-鼠脾臟中淋巴細胞的浸潤Fig.4 Lymphocyte infiltration from spleen in wild-type and BANK-/-miceNote: CD8+ T cells,CD4/CD8 ratio and CD4+CD25+ FoxP3+ regulatory T(Treg)cells from spleen were analyzed by flow cytometry.Data were obtained from five mice in each group.

2.5脾臟中CD4+T細胞、CD8+T細胞與Treg的變化 流式細胞儀檢測結果顯示，較C57BL/6鼠BANK-/-鼠CD8+T細胞百分比明顯增多(P<0.05)CD4/CD8比值倒置，而Treg百分比顯著下降(P<0.05)。見圖4。

3 討論

MS好發于中青年，致殘率高、易復發，病因及發病機制尚不明確。免疫學因素被認為是MS發病的關鍵因素，長期以來占主流地位的是T細胞介導的致病理論，這主要基于MS患者中樞神經系統脫髓鞘病灶周圍有大量T細胞浸潤的病理學證據[1]。然而近來研究顯示，B細胞在MS發病中同樣發揮著重要作用。B淋巴細胞去除藥物利妥昔單抗治療MS患者可以取得良好臨床效果[12]，是支持B細胞免疫參與MS發病的客觀證據。對繼發進展型MS患者腦組織的尸檢研究發現，其腦膜上有異位的淋巴濾泡樣結構形成，并與次級淋巴組織的生發中心(Germinal center,GC)有著相似的組織結構和B細胞克隆擴增，異位濾泡樣結構與患者皮層病變的嚴重程度和臨床病程的進展呈正相關[2,3]。

BANK(B-cell adoptor protein with ankyrin repeats)是蛋白酪氨酸激酶的底物，特異性表達于B細胞。BANK通過調節Akt的活化，從而抑制過剩的B細胞反應[13]。Durand等[14]證實，抗CD40的刺激信號促使B細胞高表達BANK1分子，同時上調Granzyme B和Irf4對免疫應答起到負向免疫調節作用。越來越多的研究證實，BANK與自身免疫性疾病易感性密切相關。對系統性紅斑狼瘡患者的研究中發現，BANK1基因(sr3733197、sr3733197和sr17266594位點)多態性與疾病易感性密切相關，提出BANK1可以作為疾病易感性的遺傳標記[15,16]。Orozco等[17]證實類風濕性關節炎患者BANK1基因位點也與關節炎易感性相關。Rueda等[18]和Dieudé等[19]證實BANK1基因多態性與系統性硬化癥的疾病易感性相關，并與患者血清中抗拓撲異構酶-Ⅰ抗體的增加成正相關。近來，Zouidi等[20]究提出BANK1和IL-15可以作為Ⅰ型糖尿病的新型易感基因。但是，目前為止，對于BANK在自身免疫性疾病中的作用多限于基因多態性的研究，在蛋白質水平上研究BANK通過何種機制參與自身免疫性疾病病程的相關報道非常罕見。因此，研究BANK在MS中的作用及機制，對于闡明MS的發病機理、尋求治療MS的治療靶點具有重要的指導意義。

本實驗中我們探討了B細胞特異性銜接蛋白BANK在EAE發生和發展中的作用。實驗結果顯示，隨著疾病的進展BANK-/-鼠EAE臨床評分急劇增高，臨床評分始終明顯高于野生鼠，且病程延長(圖1、表1)。小鼠腦組織及脊髓組織病理變化也顯示，BANK-/-鼠中樞神經系統中炎癥細胞浸潤及脫髓鞘等改變比野生鼠更為明顯(圖2)。以上結果提示BANK參與EAE的發病和發展。

在MS發病過程中，CD4+CD25+調節性T細胞數量及抑制T細胞的效應功能均有所下降[21]。我們的實驗結果顯示，相對于C57BL/6鼠，BANK-/-鼠腦組織中CD8+T細胞百分比顯著增多(圖3)。中樞神經炎癥灶中并未發現B細胞及中性粒細胞的浸潤(數據未顯示)，而在誘導EAE之前，兩組小鼠的T細胞數量及百分比差異是無統計學意義(P> 0.05，數據未顯示)。該研究結果表明，CD8+T細胞在EAE炎癥灶中選擇性的增多，提示BANK的表達參與效應性T細胞的功能。流式細胞術進一步顯示，BANK-/-鼠表現為CD4/CD8 T細胞比值倒置，Treg百分比相對于野生鼠明顯減少(圖4)。因此，我們設想在EAE中B細胞可能通過促進Treg的增殖維持其數量，使得Treg更好地緩解EAE炎癥反應。但是，BANK通過何種機制參與B細胞的功能以及BANK是否通過抑制T細胞的分化及增殖，并通過抑制促炎癥因子的分泌參與EAE的病程，相關機制有待進一步闡明。

綜上所述，我們采用BANK-/-鼠通過建立復發-緩解型EAE小鼠模型，明確了BANK的表達抑制EAE炎癥反應。本研究結果為進一步闡明BANK在EAE中的作用機制奠定了理論基礎，并為MS治療提供了新的治療靶點。

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InhibitoryroleofBANKinprogressionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis

JINGui-Hua,LIHong-Hua,LIXue,FUJIMOTOManabu,ZHANGQing-Gao.

DepartmentofImmunologyandPathogenicBiology,CollegeofBasicMedicine,YanbianUniversity,Yanji133002,China

Objective:To investigate the role of B cell adoptor protein with ankyrin repeats(BANK)in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).MethodsC57BL/6 mice and BANK-deficient(BANK-/-)mice were immunized with MOG peptide in CFA,and then observed the clinical symptoms and pathological severity.ResultsThe percentages of CD4+T cells,CD8+T cells and regulatory T cells in brain and spleen were analyzed by flow cytometry.BANK-/-mice showed significantly higher score at the peak and the plateau phase compared with wild-type mice(P<0.05).HE staining showed more widespread areas of inflammation and demyelination in BANK-/-mice when compared to wild-type mice on day 16.In addition,the frequency of CNS-infiltrating CD8+T cells was markedly higher in BANK-/-mice than in wild-type mice.In addition,the percentage of CD8+T cells from spleen in BANK-/-mice was also increased compared with wild-type mice(P<0.05).By contrast,the percentage of regulatory T cells and the ratio of CD4/CD8 T cells from spleen in BANK-/-mice were significantly lower than in wild-type mice(P<0.05).ConclusionThus,BANK expression in B cells can inhibit the development of EAE.

B cell；B cell adoptor protein;BANK;EAE

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.020

R392.12

A

1000-484X(2017)12-1854-05

①本文為國家自然科學基金項目(81460255，61671098)。

②日本筑波大學醫學醫療系皮膚科，筑波県 つくば市 3058575。

③大連大學醫學院，大連 116622。

金桂花(1975年-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事蛋白表達調控與自身免疫性疾病、B細胞方面的研究，E-mail：ghjin@ybu.edu.cn。

及指導教師：張慶鎬(1964年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事蛋白表達調控與自身免疫性疾病、B細胞方面的研究，E-mail：zqg0621@ybu.edu.cn。

[收稿2017-09-27]

(編輯 許四平 劉格格)