青藤堿對膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護作用

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(中南大學湘雅二醫院急診科，湖南 長沙 410000)

·基礎醫學·

青藤堿對膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護作用

李雄輝1，張東山*

(中南大學湘雅二醫院急診科，湖南 長沙 410000)

目的探討青藤堿(SIN)對膿毒血癥大鼠急性腎損傷的保護作用。方法將SD大鼠75只隨機均分為假手術組、膿毒血癥模型組和SIN小、中、大劑量組，建模，術后24 h采用ELISA法測定血清、尿液中性粒細胞明膠相關脂質轉運蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)水平及血降鈣素原(PCT)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)濃度，并對結果進行統計分析。結果和膿毒血癥模型組相比，SIN大、中劑量組NGAL和KIM-1均顯著降低；SIN大、中、小劑量組PCT均較膿毒血癥組顯著降低，而BUN及Scr均顯著低于模型組；SIN大劑量組腎臟病理明顯改善。結論SIN有效降低血清和尿液NGAL和KIM-1，降低血清PCT、BUN和Scr濃度，對膿毒血癥所致的急性腎損傷起到一定保護作用。

SIN； 膿毒血癥； 急性腎損傷； NGAL； KIM-1

膿毒血癥是臨床上常見的嚴重的感染性疾病，如果得不到及時治療，病死率較高。近年來，盡管抗感染治療和器官功能支持療法取得了長足進步，但膿毒血癥的病死率仍高達30%～70%[1]，急性腎損傷 (acute kidney injury，AKI) 是膿毒血癥患者常見且嚴重的并發癥[2]。有研究表明，從傳統中藥青風藤中提取的生物堿單體青藤堿(Sinomenine，SIN)具有免疫抑制、抗炎鎮痛等多種藥理作用[3]，且臨床上已經被應用于類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的治療，療效獲得肯定。本文擬建立一個大鼠膿毒血癥模型，探討SIN對膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物75只雄性SD大鼠，體重250～300 g，購自斯萊克景達實驗動物公司，許可證號：SCXK(湘)2011-0003。大鼠術前3天單獨放入代謝籠，給予等級飼料喂養并自由飲水。

1.2主要藥物、試劑及儀器SIN購自湖南正清制藥有限公司，純度大于95%。血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)試劑盒(德國BRAHMS Diagnostica 公司)；大鼠中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil related lipid transport protein，NGAL) 試劑盒(上海藍基生物有限公司)；大鼠腎損傷分子-1( kidney injury molecule 1，KIM-1)試劑盒(上海藍基生物有限公司)；Vitros 250型全自動生化分析儀(美國強生公司) ；ELX800 型酶標儀(美國BIO-TEK儀器公司)。

1.3試驗方法按照隨機數字表法，75只大鼠隨機分成假手術組、膿毒血癥模型組、SIN小劑量組、SIN中劑量組和SIN大劑量組，每組15只。術前禁食12 h，麻醉采用10%水合氯醛溶液腹腔注射，劑量為3.5 mL/kg，麻醉滿意后，固定、消毒及備皮，沿腹中線切開皮膚約1.5 cm，探查到盲腸將其結扎，注射器針頭刺穿被結扎盲腸頭尾端，擠壓出盲腸內容物，無需清洗將盲腸和內容物送回腹腔，關腹。假手術組大鼠僅探查盲腸，不結扎盲腸和造成穿孔。SIN小劑量組、中劑量組和大劑量組在手術結束時分別在尾靜脈注射劑量為25、50、100 mg/kg SIN。假手術組及膿毒血癥組均注射生理鹽水0.5 mL。術中如出現大鼠提前復蘇，酌情給予0.1～0.2 mL水合氯醛溶液，以助手術順利進行。術后大鼠即送入代謝籠，各種原因導致24 h內死亡的大鼠均被剔除出組，重新補充大鼠繼續觀察。

1.4資料收集術后24 h觀察大鼠毛色、寒顫和腹腔情況并記錄，收集尿液并處死大鼠，收集大鼠下腔靜脈血液并取下大鼠腎臟。靜脈血和尿液均常溫下放置1 h，離心(3 000 r/min，10 min)，留取上清液，備用。

1.4.1 血清NGAL和KIM-1水平測定 均采用ELISA法，分別按照試劑盒說明書進行操作，反應中止后，各孔于波長450 nm的酶標儀上讀取光密度(D) 值。根據標準品的濃度及D值畫出曲線圖，分別確定對應的濃度范圍。

1.4.2 尿液NGAL和KIM-1蛋白測定 采用ELISA法檢測，方法同上。

1.4.3 血清降鈣素原(PCT)測定 采用ELISA法嚴格按照試劑盒要求進行操作。

1.4.4 血清Scr、BUN測定 采用全自動多功能生化分析儀，按照步驟進行檢測。

1.4.5 大鼠腎臟病理形態學 采用HE染色進行觀察，經過石蠟切片、脫蠟、脫二甲苯、核染、分化與漂洗、染色、脫水、透明和封片等步驟獲得病理切片標本。

1.5統計學方法采用SPSS 19.0分析軟件對數據進行處理，計量資料采用均數±標準差表示，運用t值檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠術后一般情況除假手術組，其他各組均有不同程度呼吸急促，毛色欠光滑；假手術組及SIN大劑量組無寒戰現象，其他各組均不同程度出現寒戰，以膿毒血癥組和SIN小劑量組為甚；除假手術組，其余各組均出現腹腔膿腫，SIN大劑量組僅出現3例，而膿毒血癥組及SIN小劑量組所有大鼠均出現腹腔膿腫。

2.2大鼠血清各項指標比較血清NGAL和KIM-1比較，假手術組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組；SIN大、中劑量組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組(P<0.05)，SIN小劑量組NGAL和KIM-1和膿毒血癥模型組相比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表1。大鼠血清PCT比較，SIN大、中、小劑量組PCT進行兩兩對比，差異均有顯著性(P<0.05)，且均顯著低于膿毒血癥模型組(P<0.05)；和假手術組比較，SIN中、小劑量組PCT顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清NGAL、KIM-1、PCT比較(ng/L，n=15)

與假手術組比較，a：P<0.05；與膿毒血癥模型組比較，b：P<0.05

2.3尿液NGAL和KIM-1濃度比較假手術組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組；SIN大、中劑量組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組(P<0.05)，SIN小劑量組NGAL和KIM-1和膿毒血癥模型相比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠尿液NGAL、KIM-1比較(ng/mL，n=15)

與假手術組比較，a：P<0.05；與膿毒血癥模型組比較，b：P<0.05

2.4大鼠血清Scr、BUN比較SIN大、中、小劑量組BUN及Scr均顯著高于假手術組(P<0.05)，低于膿毒血癥組(P<0.05)，假手術組和膿毒血癥模型組進行比較，差異有顯著性(P<0.05)。見表3。

2.5大鼠腎臟病理形態學觀察假手術組光鏡下腎臟形態學改變差異不明顯。膿毒血癥模型組和SIN小劑量組腎小球體增大，較多腎曲小管上皮呈輕中度濁腫變性，胞漿內紅染的顆粒數目明顯增多、增粗，可見數個小灶狀小管壞死，部分管腔內可見管型。SIN中劑量組腎小球體增大，腎小球毛細血管輪廓稍顯模糊，小部分腎曲小管上皮呈輕中度濁腫變性，胞漿內紅染的顆粒數目增多，顆?？梢娫龃?，可見小部分小灶狀小管壞死及管型。SIN大劑量組腎小球體稍大，腎小球毛細血管輪廓較清晰，小部分腎曲小管上皮呈輕度濁腫變性，胞漿內紅染的顆粒數目有所增多，但顆粒未見增粗，無小管壞死及管型形成。見圖1。

表3 各組大鼠血清BUN、Scr比較(n=15)

與假手術組比較，a：P<0.05；與膿毒血癥模型組比較，b：P<0.05

圖1 大鼠腎臟病理形態學觀察

3 討 論

膿毒血癥其實質是全身性炎癥呈惡性發展的狀態，常合并AKI，部分患者如不采取及時有效的阻斷措施，容易發展為多器官功能衰竭。最新文獻表明，炎癥介質在膿毒血癥的發生發展中起關鍵作用，其血漿濃度與疾病的嚴重程度和預后明顯相關[4]。在膿毒血癥急性腎損傷發生過程中，免疫介導的腎小管功能紊亂比腎缺血更重要，提示AKI的發病機制是復雜的[5]，抑制機體免疫反應而達到有效治療膿毒血癥急性腎損傷可能是一個方向。

SIN主要用于治療類風濕性關節炎及自身免疫性疾病，療效肯定。文獻報道[6]SIN可以降低IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-1β水平，升高IL-10水平，減輕全身炎癥反應。王竹等[7]發現SIN可抑制DC細胞的生物學活性，減少DC的炎癥因子分泌。文娟[8]發現SIN能改善臨床癥狀和減少炎性病灶，SIN上調中樞神經系統內TGF-β1的表達，并指出這可能是SIN發揮其保護作用的機制之一?？梢?，SIN的抗炎作用也是多通道的。

目前已有多個有預測膿毒血癥相關AKI有價值的生物標志物被發現，如NGAL和KIM-1。NGAL是一種損傷誘導的轉鐵蛋白，一般情況下組織中表達很少，在缺血和腎毒性小鼠模型中可檢測到NGAL迅速升高，檢測能夠早期發現腎損傷，NGAL評價腎功能方面可能優于傳統的檢測指標[9]。Kim-1腎臟近曲小管上皮細胞表達的一種跨膜蛋白，在正常腎臟內表達水平極低，當腎急性損傷后，近端小管細胞內Kim-l基因轉錄水平急劇上調，Kim-l蛋白也隨之大量表達，隨著結構與功能的恢復，Kim-1這種高表達的現象也會消失[10]。類似現象在另外一篇文獻也被報道[11]。本研究結果發現，大、中劑量SIN組的NGAL和KIM-1無論是采用血清標本還是尿液，均明顯低于膿毒血癥組，提示大、中劑量SIN能明顯降低大鼠AKI時NGAL和KIM-1，而在膿毒血癥導致AKI中，小劑量SIN并無明顯保護作用。大、中劑量SIN組組間比較差異無顯著性，可能提示本研究中采取50 mg/kg的劑量已使相關作用受體飽和，具體機制如何尚需進一步研究。假手術組的NGAL和KIM-1顯著低于膿毒血癥組，提示大鼠膿毒血癥造模是成功的。

研究發現，發生AKI時PCT升高早于血肌酐的升高[12]，被認為是識別膿毒血癥的一個早期敏感指標,可作為膿毒血癥誘導急性腎損傷患者的預測指標[13]。本研究將SIN各組進行兩兩對比，PCT值差異顯著，SIN劑量越大，PCT值越低；將SIN各組分別與膿毒血癥模型組進行對比，發現膿毒血癥組PCT值較SIN組明顯增高，兩組數據均提示了SIN能有效降低PCT值，有效減輕了膿毒血癥導致AKI對機體的破壞性作用。AKI嚴重程度最直接的反映就是機體的腎功能。臨床和科研上評價腎功能一般常用Scr和BUN兩個觀察指標。本研究中，膿毒血癥組Scr和BUN最高，低劑量SIN組次之，余下依次為中劑量SIN、高劑量SIN組和假手術組。本研究中，膿毒血癥組和低劑量SIN組組間比較差異有顯著性，提示低劑量SIN在保護腎功能方面同樣有益。而前文述及，小劑量SIN并不能明顯降低大鼠AKI時NGAL和KIM-1濃度。NGAL和KIM-1是研究腎功能變化觀察指標之一，SIN對腎功能的保護作用是否還有其他機制參與有待進一步研究。大、中劑量SIN組的Scr和BUN較膿毒血癥模型組顯著降低，但顯著高于假手術組，說明合適劑量的SIN具有一定的減輕膿毒血癥導致的AKI。而評價腎功能最直接的辦法就是進行病理切片檢查。本研究中，膿毒血癥組大鼠腎臟胞漿內紅染的顆粒數目明顯增多、增粗，腎小管壞死，甚至管型形成，上述現象提示大鼠腎臟出現了較為嚴重的感染，小劑量的青藤堿的病理呈現高度相似的結果，提示小劑量的青藤堿不能改善腎膿毒血癥的結局。隨著青藤堿劑量增大，中劑量青藤堿組的病理較小劑量組有了一定改善，直到大劑量青藤堿組可以發現，胞漿內紅染的顆粒未見增粗，無小管壞死及管型形成，提示在該劑量青藤堿參與下，膿毒血癥大鼠腎臟病理結果有了較大的改善，證實了合適劑量的青藤堿對膿毒血癥大鼠腎臟具有一定的保護作用。本研究設計上也有不足之處，因觀察時間短，保護作用是否持久，能否替代其他治療措施緩解甚至逆轉膿毒血癥導致的AKI，本實驗尚需進一步研究。

綜上，SIN對膿毒血癥導致急性腎損傷具有一定保護作用，具體作用機制可能是多方面的，本研究為SIN應用于膿毒血癥致急性腎損傷的保護作用研究提供了實驗依據。

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Protectiveeffectsofsinomenineonacuterenalinjuryinsepticrats

LI Xionghui,ZHANG Dongshan

(EmergencyDepartment,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410000,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of sinomenine on acute kidney injury in rats with sepsis.Methods75 SD rats were randomly divided into sham operation group,sepsis group and sinomenine,in modeling large,middle and small dose group,and after 24 h ELISA was used to test serum,urine neutrophil related lipid transport protein gelatin (NGAL),kidney injury molecule 1 (KIM-1) and the level of serum procalcitonin (PCT),blood urea nitrogen (BUN),serum creatinine (Scr) concentration,and the results were statistically analyzed.ResultsCompared with the sepsis group,the NGAL and KIM-1 in the large and middle dose group of sinomenine were significantly lower than those in the sepsis group,and the PCT of the large,middle and small dose group were significantly lower than those of the sepsis group,while BUN and Scr were significantly lower than those in the model group.SIN large dose group significantly improved renal pathology.ConclusionsSinomenine can effectively reduce serum and urine NGAL and KIM-1,decrease serum PCT,BUN and Scr,and play a protective role on acute kidney injury induced by sepsis.

sinomenine; sepsis; acute kidney injury; NGAL; KIM-1

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.008

2017-01-03；

2017-04-14

*通訊作者，E-mail：zhkidney@qq.com.

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蔣湘蓮)