臨床分離16株耐碳青酶烯類腸桿菌科細菌耐藥機制初步研究

伍啟康，李小燕，吳奎海

(1.佛山市第一人民醫院 檢驗科，廣東 佛山528000；2.廣州醫科大學第四附屬醫院 檢驗科，廣東 廣州510182)

臨床分離16株耐碳青酶烯類腸桿菌科細菌耐藥機制初步研究

伍啟康1，李小燕2，吳奎海1

(1.佛山市第一人民醫院 檢驗科，廣東 佛山528000；2.廣州醫科大學第四附屬醫院 檢驗科，廣東 廣州510182)

目的了解佛山市第一人民醫院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥情況和耐藥機制。方法2013年1月至2015年12月收集16株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌，其中大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌4株，產酸克雷伯菌1株。利用VITEK2-compact微生物分析系統進行細菌鑒定及藥敏試驗。采用改良Hodges和MEM(美羅培南)-EDTA(乙二胺四乙酸)-Na2雙紙片協同試驗進行耐藥表型篩選。采用PCR法檢測耐藥基因blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48。結果16株細菌對亞胺培南、美羅培南均耐藥。16株細菌Hodges均陽性，15株雙紙片協同試驗陽性。在11株大腸埃希菌，9株攜帶blaNDM-5，2株攜帶blaNDM-1。4株肺炎克雷伯菌攜帶blaNDM-5，1株產酸克雷伯菌攜帶blaKPC-2。結論我院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥機制以產blaNDM-5碳青霉烯酶為主。

耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌；碳青霉烯酶；NDM；耐藥性

(ChinJLabDiagn,2017,21:2129)

腸桿菌科細菌作為臨床常見的條件致病菌，其引起的重癥感染越來越引起重視。碳青霉烯類藥物抗菌譜廣、抗菌活性強殺菌作用快的β-內酰胺類藥物 ，其良好的細胞通透性、高度酶穩定性及較低的毒性等特點已成為目前臨床治療嚴重革蘭陰性細菌感染最主要的抗菌藥物之一 ，但隨著耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的出現及不斷的增多 ，使該類藥物的臨床應用受到了嚴峻的挑戰[1]。本研究主要對臨床分離耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的耐藥機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源我院檢驗科微生物室2013年1月至2015年12月分離的16株耐碳青霉烯類菌株，其中大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌4株，產酸克雷伯菌1株。標本來源包括痰液10例，尿液2例，血液2例，傷口1例，膽汁1例，同一患者只取第一次分離菌株。

1.2細菌鑒定和藥敏試驗利用法國生物梅里埃公司的VITEK2-compact儀器及其配套GN、AST-GN13卡進行菌種鑒定和藥敏試驗。美羅培南藥敏試驗采用K-B法，藥敏紙片購自英國OXOID公司，根據臨床實驗室標準化委員會(CLSI)2015年標準判斷結果，美羅培南的耐藥標準都為R≤19 mm、敏感標準為S≥23 mm，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌A TCC27853。

1.3碳青霉烯酶表型檢測依據CLSI M100-S23進行改良Hodges試驗。MEM(美羅培南)-EDTA(乙二胺四乙酸)-Na2協同試驗，配制0.1 mol/L EDTA-Na2，加10 μl至MEM紙片上，無菌條件下自然干燥備用。配制成0.5麥氏濁度的菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂平板，將MEM和MEM-EDTA-Na2的紙片貼于瓊脂表面。結果判定：含酶抑制劑紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑相差≥5 mm，提示該菌產生金屬 β-內酰胺酶[2]。

1.4主要儀器和試劑德國Eppendorf公司的PCR擴增儀器，Bio-Rad公司的凝膠儀,TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產品。

1.5PCR擴增細菌的DNA提取參考試劑盒說明書，-40℃保存。相關基因的PCR反應體系均為20 μl體積,其中含Mg2+的10×buffer 2 μl，dNTP 200 μmol/L，上下游引物0.2 μmol/L，DNA模板1 μl，TaqDNA聚合酶1U，加入滅菌去離子水至20 μl。blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48等碳青霉烯酶陽性菌株由廣州醫科大學第四附屬醫院微生物室李小燕提供,PCR擴增陽性并經測序驗證，具體引物序列見表1。

表1 PCR反應的引物序列

1.6PCR產物序列分析產物送華大基因科技公司進行純化并雙向測序，利用DNAstar軟件對測序結果進行序列校正，在GenBank中用blastn進行核酸同源性搜索，分析基因類型。

2 結果

2.1藥敏試驗16株腸桿菌對碳青霉烯類、頭孢三代、頭孢四代均耐藥，對氨曲南、阿米卡星、左旋氧氟沙星耐藥率分別為56.25%、25%、37.5%。

2.2碳青霉烯酶表型檢測16株腸桿菌科細菌改良Hodges試驗均陽性，證明均產碳青霉烯酶。15株MEM-EDTA-Na2協同試驗陽性，僅1株產酸克雷伯菌陰性。

2.3PCR擴增在11株大腸埃希菌中，9株NDM-5基因陽性，2株NDM-1陽性。4株肺炎克雷伯菌均檢測出NDM-5，1株產酸克雷伯菌KPC-2陽性。具體分布見表2。

3 討論

本研究顯示CRE對氨基糖苷類、氨曲南耐藥率相對較低，但對多黏菌素和替加環素具有較高體外敏感性[1]。在臨床上治療此類感染可采取聯合用藥，如替加環素聯合多粘菌素或磷霉素或氨基糖苷類、加酶抑制劑復合制劑聯合氨基糖苷類或多黏菌素或氟喹諾酮類。

表2 16株腸桿菌科細菌耐藥基因和主要抗生素MIC(μg /ml)分布

備注：CTX：頭孢曲松；CAZ：頭孢他啶；FEP：頭孢吡肟；ATM：氨曲南；IMP：亞胺培南；AK：阿米卡星；LVX：左旋氧氟沙星

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥主要機制有四種[5]：①外膜蛋白變異合并AmpC、ESBLs等酶高產；②藥物作用靶位的改變；③產生碳青霉烯酶；④外排泵作用。其中最主要的就是碳青霉烯酶，以A類和B類最常見，其中A類以KPC常見。B類為金屬β-內酰胺酶，如IM P、NDM-1、VIM。在我國報道大腸埃希菌的耐碳青酶烯類耐藥機制以產KPC-2和IMP-4碳青霉烯類酶為主。在本研究中，81.2%(9/11)大腸埃希菌中NDM-5陽性，僅2株NMD-1陽性。NDM基因至今有12個亞型，產NDM-5大腸埃希菌最早在英國發現。 NDM-5與NDM-1有兩個位點氨基酸序列差異(Val88Leu 和Met154Leu)[6]。我國分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，以產KPC-2酶為主，同時伴有外膜蛋白(Ompk35、Ompk36)缺失[7,8]。5株肺炎克雷伯菌均攜帶NDM-5，與我國大部分地區攜帶KPC-2不同。1株產酸克雷伯菌KPC-2酶，KPC酶已有11個亞型，KPC酶可通過克隆菌株播散，也可通過質粒、轉座子等移動性遺傳元件播散。產NDM-5腸桿菌科細菌最近幾年在我國和歐洲等地區逐漸有報道，LIU等[9]報道南昌一例患者分離于尿液標本，屬于ST14型別。Bathoorn等[10]報道荷蘭分離與產NDM-5，屬于ST16型別。Zhang等[11]在上海發現2株大腸埃希菌、1株肺炎克雷伯菌、1株奇異變形桿均檢測NMD-5基因，而且四株菌DNM-5基因周圍的遺傳環境相同，可能與IncX3型質粒水平傳播有關。

總之，我院CRE菌株存在NDM-5流行趨勢，今后要規范化使用碳青霉烯類抗生素，加強本院該類菌株的流行病學調查，制定切實有效的感控措施，減少產碳青霉烯酶菌株的發生及播散，預防醫院感染的發生。

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Resistancemechanismof16carbapenem-resistantEnterobacteriaceaeisolatesfromclinicalspecimen

WUQi-kang1，LIXiao-yan2，WUKui-hai1.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan528000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFourthAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

ObjectiveTo investigate the resistance mechanism of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in the First People’s Hospital of Foshan.Methods16 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates were collected from January 2013 to December 2015,including 11Escherichiacolistrains,4Klebsiellapneumoniaestrains and 1Klebsiellaoxytocastrain.The identification and antimicrobial susceptibility of the isolates were analyzed by Vitek2-compact microorganism analysis system.The modified Hodge test and MEM-EDTA-Na2double-disk synergy test were screen out the carbapenem-resistant photypes.The genes of the carbapenemase,blaIMP,blaKPC,blaNDM,blaVIMandblaOXA-48were performed by PCR.Results16 isolates were all resistant to imipenem and meropenem.16 isolates and 15 isolates were positve for the modified Hodge test and MEM-EDTA-Na2 double-disk synergy test,respectively.Of 11Escherichiacolistrains,9 strains carriedblaNDM-5and 2 strains carriedblaNDM-1.4Klebsiellapneumoniaestrains all habouredblaNDM-5and 1Klebsiellaoxytocastrain habouredblaKPC-2.ConclusionThe resistance mechanism of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in the hospital is mainly production ofblaNDM-5carbapenemase.

Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae;Carbapenemase;NDM;Resistance

廣東省佛山市醫學類科技攻關項目(201308103)

1007-4287(2017)12-2129-03

R372

A

2017-05-13)