滇重樓GAox基因的克隆與生物信息學分析△

張夢幻，廖登群，孫鵬，李先恩，祁建軍

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎研究·

滇重樓GAox基因的克隆與生物信息學分析△

張夢幻，廖登群，孫鵬，李先恩，祁建軍*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的克隆編碼滇重樓赤霉素合成代謝途徑中關鍵酶GA氧化酶(Gibberellic oxidase，GAox)的全長cDNA序列，并進行生物信息學分析。方法根據滇重樓轉錄組測序序列，設計特異性PCR引物，利用RT-PCR 技術擴增目標基因編碼區的全長序列連接至pMD18-T載體上，進行序列測定及序列同源性比較分子系統進化樹構建、結構域搜索及蛋白質三維結構預測等生物信息學分析。結果成功克隆了滇重樓的的6條GAox基因，大小在1000 bp左右，分別命名為PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1 和PpGA3ox1。6條基因分別屬于GA氧化酶三個不同的亞家族。滇重樓GAox蛋白氨基酸數量均在300～400，理論等電點在4～7左右，帶正電荷。PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4為不穩定蛋白，PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1為穩定蛋白，均為沒有跨膜結構域和信號肽的親水蛋白。除了PpGA2ox1亞細胞定位在葉綠體，其他蛋白均定位在細胞質。滇重樓GAox蛋白與不同物種同源序列的序列相似性較高，保守性比較強。結論首次從滇重樓中克隆了6條GAox基因并對其進行了初步的生物信息學分析。

滇重樓；GA氧化酶；基因克??；生物信息學分析

滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis種子是重要的繁殖方式之一，其繁殖系數較高[1]，但存在形態休眠和生理休眠[2]，大量種子在漫長的休眠期失去活力[3]，出苗率極低。赤霉素(GA)又是一種促進生長的植物激素，可以調節種子發育，促進種子萌發[4-7]，與植物種子休眠具有重要關系。GA的生物合成途徑中包括GA20ox、GA3ox和GA2ox 3種重要的氧化酶[8]，這些基因在擬南芥、水稻等植物中進行了克隆和功能研究[9-16]，為研究GAs在滇重樓種子休眠與萌發中的作用提供了重要的參考。

前期對滇重樓不同器官及不同發育時期的種子進行的轉錄組測序發現了GA氧化酶的候選基因，其中4條GA2ox基因、1條GA20ox基因和1條GA3ox基因為全長基因。本文利用RT-PCR技術對這6條全長GAox基因進行物理克隆和測序，并進行了生物信息學分析，為下一步利用RT-qPCR分析GA基因的時空表達特性和功能分析奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

滇重樓種子于2015年11月采自云南臨滄道地藥材種植科技有限公司，由中國醫學科學院藥用植物研究所祁建軍研究員鑒定為滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis的種子。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 成熟的滇重樓種子去除雜物后輕輕搓去種皮，室內陰干1～2 d，蒸餾水中浸泡12 h，20 ℃蛭石層積，取不同萌發階段的種子，自來水沖洗干凈后，蒸餾水沖洗，75%乙醇沖洗，吸水紙擦干，錫箔紙包裹，置液氮中備用。

1.2.2 植物總RNA的提取及cDNA的合成 取不同發育階段的滇重樓種子按照快速通用植物RNA提取試劑盒3.0(北京華越洋生物科技有限公司)的操作步驟提取樣品的總RNA，并用NanoDrop 2000檢測總RNA的濃度與質量，用1.2%的瓊脂糖電泳檢測其完整性。按照PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(大連寶生物公司)的操作步驟反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2.3GAox基因的擴增、克隆及測序 通過分析轉錄組數據，其中14條Unigene序列注釋為GA2ox基因，8條Unigene序列注釋為GA20ox基因，1條Unigene序列注釋為GA3ox基因，經分析其中4條GA2ox基因，1條GA20ox基因，1條GA3ox基因為全長基因。通過NCBI的ORF Finder (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定序列開放閱讀框( open reading frame，ORF)，使用primer premer 5設計擴增ORF的引物(見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分部合成。

表1 RT-PCR 引物

RT-PCR反應體系為：5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板cDNA 2 μL，引物各1 μL，滅菌蒸餾水31.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸60 s，40個循環，循環結束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對擴增所得目的片段按照DNA純化回收試劑盒(天根生物公司)操作說明進行切膠回收。

將回收產物連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌(DH5α菌株)，在含有氨芐的LB培養基上進行培養，約12 h后觀察菌落情況，挑取陽性克隆放入含有氨芐的LB培養液中培養約16 h后進行菌落PCR擴增，用質粒PCR鑒定陽性重組子，電泳檢測后送上海生工生物公司測序。

1.2.4 序列分析 運用SeqMan軟件對兩頭測序的序列進行拼接，拼接結果運用DNAMAN軟件與轉錄組測序結果進行比對。利用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得滇重樓GAox基因的蛋白序列。

1.2.5 滇重樓GAox基因系統發育分析 構建利用滇重樓GAox基因進化樹選用了基因功能研究比較廣泛的4個物種(單子葉植物水稻、玉米，雙子葉植物擬南芥、番茄)的GAox基因家，這4個物種的GAox基因蛋白序列由Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數據庫中下載[13]。首先用Clustalw對滇重樓GAox蛋白序列與4個物種的蛋白質序列進行多序列比對，然后運用MEGA6.0 構建 Neighbor-joining(NJ)系統進化樹。根據系統發育分析，選取與滇重樓GAox蛋白親緣關系較近的同源序列，運用DNAMAN進行蛋白質序列比對。

1.2.6 滇重樓GAox 蛋白的物理特性預測 利用ExPASy Protparam(http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)分析相對分子質量、等電點等[17]；利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜區分析；WOLF PSORT(http：//wolfpsort.org/)進行亞細胞定位分析；利用SignalP軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽[18]。

1.2.7 滇重樓GAox基因蛋白質的結構域和同源建模分析 利用 InterProScan (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search)、NCBI Conserved Domains(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和ExPASy Prosite(http：//prosite.expasy.org/)進行蛋白質結構域和功能位點分析。采用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)同源建模方法進行3D結構預測[19]。

2 結果

2.1 總RNA提取及檢測結果

NanoDrop 2000檢測滇重樓提取的總RNA，A260/280≈2.0～2.2，A260/230>1.8，質量濃度在200 ～ 400 ng·μL-1。取5 μL RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，28 S和18 S條帶清晰(見圖1)，表明提取的總RNA完整性較好，可進行下步實驗。

2.2 cDNA第一鏈的合成結果

經NanoDrop 2000檢測，cDNA的質量濃度均大于1000 ng· μL-1，A260/280≈1.8，A260/230>2，均能擴增出參照基因，說明反轉錄成功。

2.3 GAox基因的擴增、克隆及測序

用反轉錄得到的cDNA 為模板，基于RT-PCR技術用PrimeSTAR? HS DNA Polymerase進行PCR擴增，凝膠電泳跑出6條條帶(見圖2)，大小與預期理論值一致。挑取陽性克隆進行測序，測序結果與預期序列比對，序列相似性均在99%以上，表明克隆成功。

圖1 滇重樓總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

注：1～6泳道對應的基因分別為PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1。圖2 GAox基因電泳圖

2.4 序列分析

第一次成功克隆到6條滇重樓GAox基因全長編碼區，其中，PpGA2ox1全長為1092 bp，編碼363個氨基酸，NCBI登錄號為KY921589；PpGA2ox2全長為1032 bp，編碼343個氨基酸，NCBI登錄號為KY921590；PpGA2ox3全長為978 bp，編碼325個氨基酸，NCBI登錄號為KY921591；PpGA2ox4全長為969 bp，編碼322個氨基酸，NCBI登錄號為KY921592；PpGA20ox1全長為1122 bp，編碼373個氨基酸，NCBI登錄號為KY921593；PpGA3ox1全長為1050 bp，編碼349個氨基酸，NCBI登錄號為KY921594。

2.5 滇重樓GAox基因系統發育分析

與水稻等4個物種構建的GAox系統進化樹顯示，GAox氨基酸聚類為8個亞枝(見圖3)，分別代表了C19-GA2ox、C20-GA2ox、GA20ox、GA3ox、GAox-A、GAox-B、GAox-C和GAox-D亞家族[19]。PpGA2ox1和PpGA2ox2屬于C19-GA2ox亞家族成員，PpGA2ox3和PpGA2ox4屬于C20-GA2ox亞家族成員，PpGA20ox1屬于GA20ox亞家族成員，PpGA3ox1屬于GA3ox亞家族成員。此外由圖3還可以發現，PpGA2ox1與雙子葉植物擬南芥和番茄的GA2ox序列聚為一個亞枝，PpGA2ox2與單子葉植物水稻和玉米的GA2ox序列聚為一個亞枝，PpGA2ox3與單子葉植物水稻和玉米的GA2ox序列聚為一個亞枝，而與PpGA2ox4親緣關系較近的物種中既有單子葉植物也有雙子葉植物，PpGA20ox1與單子葉植物水稻和玉米的GA20ox序列聚為一個亞枝，PpGA3ox1與雙子葉植物擬南芥和番茄的GA3ox序列聚為一個亞枝。滇重樓不同的基因沒有被截然聚在單子葉或者雙子葉植物類群中，這可能與重樓屬植物在被子植物系統發育中的特殊地位有關，重樓屬植物子葉為一枚屬于單子葉植物，但其葉脈網狀、心皮多數、花基數在4以上等特征與雙子葉植物有共同之處，所以在被子植物系統發育的研究中具有重要的意義[20]。

注：▲標記基因為滇重樓基因。圖3 GAox基因的系統進化樹

2.6 滇重樓GAox蛋白的物理特性預測

滇重樓GAox蛋白的物理特性見表2。滇重樓GAox蛋白的氨基酸數量均在300～400，理論等電點在4～7左右，帶正電荷。PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4的不穩定系數>40%，為不穩定蛋白；PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1的不穩定系數<40%，為穩定蛋白?？偲骄H水系數均<0，為親水蛋白。均沒有跨膜結構域和信號肽。除了PpGA2ox1亞細胞定位在葉綠體，其他蛋白均定位在細胞質。

表2 滇重樓GAox蛋白的物理特性預測

2.7 滇重樓GAox蛋白結構域分析

根據系統發育分析的結果選取與PpGAox基因親緣關系較近的3個蛋白質序列進行多序列比對(見圖4～9)。PpGA2ox1與同源GA2ox蛋白的序列相似性為61.73%，PpGA2ox2與同源GA2ox蛋白的序列相似性為61.51%，PpGA2ox3與近緣物種GA2ox蛋白的序列相似性為56.42%，PpGA2ox4與同源GA2ox蛋白的序列相似性為50.75%，PpGA20ox1與同源GA20ox蛋白序列的序列相似性為67.59%，PpGA3ox1與同源GA3ox蛋白的序列相似性為65.23%。由此可見滇重樓GAox蛋白與不同物種同源序列的相似性比較高，保守性比較強。

圖4 滇重樓PpGA2ox1與同源GA2ox蛋白序列的多序列比對

圖7 滇重樓PpGA2ox4與同源GA2ox蛋白序列的多序列比對

圖8 滇重樓PpGA20ox1與同源GA20ox蛋白序列的多序列比對

InterProScan和conserved domains預測結構域表明，GAox蛋白序列均有3個保守結構域，分別是異青霉素N合成酶(IPNS)結構域、非血紅素加氧酶的N-末端(DIOX_N)結構域和依賴于2-酮戊二酸和Fe2+的雙加氧酶超家族(2OG-FeII_Oxy)結構域。PpGAox蛋白的上述結構域在氨基酸殘基之間的位置見表3。異青霉素N合成酶(IPNS)是一種非血紅素Fe2+依賴性酶。它屬于一類含有非血紅素Fe2+酶，其包括2-酮戊二酸依賴雙加氧酶、2-酮戊二酸依賴羥基酶和參與乙烯和花色素苷生物合成的酶。非血紅素加氧酶的N-末端(DIOX_N)結構域是具有2-酮戊二酸/Fe(II)-依賴性雙加氧酶活性的蛋白質的高度保守的N-末端區域。Fe(II)2OG雙加氧酶域酶催化植物激素的形成，如乙烯、赤霉素、花青素等。利用Prosite分析GAox蛋白的功能位點，顯示保守功能域均為依賴于2-酮戊二酸和Fe2+的雙加氧酶結構域，Fe2+結合于組氨酸(His)殘基、天冬氨酸(Asp)殘基、組氨酸(His)殘基、2-酮戊二酸結合于精氨酸(Arg)殘基(見圖10)。

圖9 滇重樓PpGA3ox1與同源GA3ox蛋白序列的多序列比對

蛋白名稱異青霉素N合成酶(IPNS)非血紅素加氧酶N?末端(DIOX＿N)2?酮戊二酸/鐵依賴雙加氧酶(Fe2OG＿OXY)PpGA2ox148～35151～114203～309PpGA2ox218～32119～78 169～279PpGA2ox323～31034～131181～280PpGA2ox47～30234～119177～277PpGA20ox126～36053～152213～313PpGA3ox120～32941～142191～297

2.8 滇重樓PpGA2ox1及PpGA2ox1蛋白三維結構建模

基于較高可靠性的PDB模板(4xae.2.A)利用SWISS-MODEL 進行同源建模，GAox蛋白三維結構模型見圖11。根據三維蛋白模型可以發現GAox的特征結構域位于GAox蛋白的縫隙內，特征結構域多由無規卷曲和β折疊片組成，在GA生物合成中起重要作用。

圖10 GAox蛋白的功能位點

圖11 GAox蛋白三維結構預測

3 討論

近年來，在GA生物合成與代謝的關鍵酶基因的研究在擬南芥、水稻等植物中取得了比較突出的結果。如水稻的GA2ox基因(OsGA2ox5)，大麥和小麥種GAox基因(TaGA20ox3、TaGA3ox3和TaGA2ox7)[22]等。藥用植物GAox基因的研究也取得了一定的成果，如丹參GAox基因(SmGA2ox、SmGA20ox和SmGA3ox)[23]、西洋參的GA2ox基因(PqGA2ox)[24]、GA20ox基因(PqGA20ox)[25]、鐵皮石斛的GA3ox基因(DoGA3ox)[26]等。GAox家族屬于2OGDs超家族[20]。Huang等根據GAox基因的基因結構和特征結構域，GAox基因家族被分為C19-GA2ox、C20-GA2ox、GA20ox、GA3ox、GAox-A、GAox-B、GAox-C和GAox-D8個亞家族[20]?；蚪Y構和保守結構域的研究不僅能夠深入了解GAox基因的分類，而且可以對其進化歷史和功能多樣化進行分析。

此研究基于滇重樓轉錄組測序數據，應用Primer Premier 5.0軟件設計了特異性PCR引物，基于RT-PCR技術第一次成功地克隆了滇重樓的6條GAox基因的全長編碼框區，大小在1000 bp左右，分別命名為PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1。其中PpGA2ox1和PpGA2ox2屬于C19-GA2ox亞家族成員，PpGA2ox3和PpGA2ox4屬于C20-GA2ox亞家族成員，PpGA20ox1屬于GA20ox亞家族成員，PpGA3ox1屬于GA3ox亞家族成員。此外通過系統發育學分析，從分子角度驗證了滇重樓在植物系統發育學上的特殊地位：子葉一個屬于單子葉植物，但也有屬于雙子葉植物的一些特征，在研究植物系統發育上具有重要意義。滇重樓GAox蛋白氨基酸數量均在300～400，理論等電點在4～7左右，帶正電荷。PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4的不穩定系數>40%，為不穩定蛋白；PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1的不穩定系數<40%，為穩定蛋白?？偲骄H水系數均<0，為親水蛋白。均沒有跨膜結構域和信號肽。除了PpGA2ox1亞細胞定位在葉綠體，其他蛋白均定位在細胞質。滇重樓GAox蛋白與不同物種同源基因的序列相似性在50%～70%，序列相似性高，保守性比較強。結構域預測表明，PpGAox蛋白序列均含有3個保守結構域：異青霉素N合成酶(IPNS)結構域、非血紅素加氧酶的N-末端(DIOX_N)結構域和依賴于2-酮戊二酸和Fe2+的雙加氧酶超家族(2OG-FeII_Oxy)結構域。利用Prosite分析GAox蛋白的功能位點，顯示保守功能域均為為依賴于2-酮戊二酸和Fe2+的雙加氧酶結構域，Fe2+結合于組氨酸(His)殘基、天冬氨酸(Asp)殘基和組氨酸(His)殘基，2-酮戊二酸結合于精氨酸(Arg)殘基?；谳^高可靠性的PDB模板(4xae.2.A)利用SWISS-MODEL 進行同源建立了蛋白的三維模型，根據三維蛋白模型可以發現GAox的特征結構域位于GAox蛋白的縫隙內，特征結構域多由無規卷曲和β折疊片組成，在GA生物合成中起重要作用。研究結果為下一步基于實時定量PCR技術分析滇重樓GAox基因時空表達特性及其調控赤霉素生物合成代謝機制奠定了一定基礎。

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CloningandBioinformaticAnalysisofGAoxGenesfromParispolyphyllavar.yunnanensis

ZHANG Menghuan，LIAO Dengqun，SUN Peng，LI Xian’en，QI Jianjun*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：To clone the full-length cDNA sequences of gibberellic oxidase genes inParispolyphyllavar.yunnanensiswhich encode the key enzymes involved in GA biosynthetic pathway and analyze their bioinformatic properties.MethodsThe sequences of candidate genes in our previous transcriptomic database ofParispolyphyllavar.yunnanensis were used to design the gene-specific PCR primers for RT-PCR cloning of their full-length coding regions.The amplified cDNA fragments were transformed into pMD18-T vector andE.coliDH5α competent cells for sequencing.A series of bioinformatic analysis were carried out，including sequence comparison of homologies，reconstruction of GAox phylogenetic tree，domain search，and 3D structure prediction.ResultsSequencing results showed that the full-length CDS of sixPpGAoxgenes were about 1000 bp.Six genes，named asPpGA2ox1，PpGA2ox2，PpGA2ox3，PpGA2ox4，PpGA20ox1 andPpGA3ox1，belonged to three GAox subfamilies，encoding 300-400 amino acids.Their theoretical pI values were about 4-7 and in a positive charge.The proteins ofPpGA2ox1，PpGA2ox2 andPpGA2ox4 were unstable andPpGA2ox3，PpGA20ox1 andPpGA3ox1 were stable.However，all of them were hydrophilic，signal peptide and had no transmembrane domain.PpGA2ox1 was predicted to be located in the chloroplast，and the rest d in the cytoplasm.PpaGAox proteins had higher homologous sequences with those of other species w and strong domain conservatism.ConclusionThe full-length cDNA sequences of sixGAoxwere cloned for the first time fromP.polyphyllavar.yunnanensis and the bioinformatic analysis were carried out.

Parispolyphyllavar.yunnanensis；GA oxidase；gene cloning；bioinformatic analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.002

國家自然科學基金(31471575)

*

祁建軍，博士，研究員，碩士生導師，研究方向：藥用植物生物技術；E-mail：jjqi@implad.ac.cn

2016-04-11)