基于微量量熱法的不同來源黃芩抑菌活性對比研究△

曾燕，郭蘭萍，王繼永*，黃璐琦*

(1.中國中藥公司，北京 102600；2.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

·基礎研究·

基于微量量熱法的不同來源黃芩抑菌活性對比研究△

曾燕1，郭蘭萍2，王繼永1*，黃璐琦2*

(1.中國中藥公司，北京 102600；2.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

目的構建基于生物熱技術的不同來源黃芩抑菌活性區分方法，基于生物熱技術考察不同來源黃芩的抑菌活性差異。方法采用微量量熱技術，研究不同來源黃芩對大腸桿菌生長代謝的熱動力學參數的影響，考察栽培區域、采收期、生長年限和種質等的差異對黃芩抑菌活性的影響。結果不同產地黃芩熱動力學參數特征差異較大，其抑制率在24.3%～129.5%，其中河北承德和內蒙古武川黃芩抑菌活性顯著高于山東莒縣和山西運城；隨著藥材采收月份的變化(7—11月)，黃芩的抑菌活性出現了先下降后急劇增加的現象，且在11月份抑菌活性達到最強；對比不同生長年限的黃芩(2～5年)，總體上黃芩藥材的抑菌活性隨著藥材生長年限的增加而增強；多點試驗考察不同種質黃芩藥材抑菌活性發現，不同種質黃芩抑菌活性差異較大，其表現出來的抑菌活性與緯度跨越有關。結論不同產地黃芩抑菌活性存在一定的差異，藥材的采收時間、生長年限以及種質等的差異均能對黃芩抑菌率產生影響?；谏餆峒夹g的微量量熱技術用于不同來源藥材的區分，較傳統的藥理、化學和形態學方法具有一定的便捷性和快速性，可作為進一步區分不同來源藥材藥效差異的依據之一。

黃芩；微量量熱法；生物活性；品質區分

在生命體生長、繁殖、衰亡過程中，伴隨代謝有熱量釋放，釋放的熱量隨生長期的變化關系就是熱活性譜線圖(簡稱“熱譜圖”)。生物熱動學參數可對生物體在生長代謝過程中的相關信息進行定性、定量分析，有較強的專屬性、靈敏性和重現性[1]。

隨著生物熱理論和技術的日趨完善和成熟，微量量熱法在藥物研究領域中的應用也日益廣泛，如藥物穩定性研究、藥物抗腫瘤、藥物制劑研究、藥物活性的定量構效關系、抗菌藥物活性篩選研究以及聯合用藥等方面[2]。目前，基于生物熱的微量量熱技術在中藥藥性的科學闡釋、中藥活性成分的活性評價、中藥注射劑的安全性評價等方面多有探討，這是對中醫藥傳統研究思路和研究方法的拓展。具有高靈敏度的微量量熱儀可以直接、連續地測量生物體生長過程中的熱量變化，進一步反映生物體的整個生長代謝過程能量的轉移。該技術為解決中藥質量控制和藥效評價等復雜性難題提供了一些思路，并具有一些優越性[3]。

在中藥材質量評價中，單一的化學評價方法越來越受到質疑，而傳統的藥理學評價方法又較為繁瑣?；谖⒘苛繜峒夹g的中藥材質量評價方法或可作為中藥材質量區分的依據之一，如不同產地藥材品質對比[4-6]、不同種質活性評價[7-8]、不同生長年限藥材的活性評價[9]、中藥材不同藥效部位的活性評價等方面有過一些研究[10-11]。

黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi為唇形科多年生藥用植物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功能?，F代藥理學表明，黃芩具有抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、抗炎、抗菌等作用，并對免疫系統、心腦血管系統、消化系統、神經系統等具有一定的有保護和治療作用[12-14]。不同來源黃芩，包括產地、生長年限等方面的差異將導致黃芩質量差異[15-17]。這些差異不僅體現在藥材外觀性狀上的差異和化學成分上的差異，也應體現在生物活性和臨床功效上的差異，而相關研究非常之少[18]?；诖?，我們收集不同產區、不同生長年限、不同采收期的黃芩進行生物熱對比研究；同時進行田間小區試驗，考察黃芩種質差異對黃芩藥材生物熱動力學參數和抑菌活性的影響。采用微量量熱法評價不同黃芩的“活性”，為黃芩道地藥材研究提供更豐富的信息，同時也拓展新技術、新方法在中藥材質量評價方面的應用。

1 材料與儀器

黃芩藥材：于2013年采集河北、內蒙古、山西和山東不同產地栽培黃芩。藥材來源包括不同產區商品田藥材，田間受控試驗藥材，不同采收期、不同生長年限藥材樣品共計50份，另外收集1份黃芩栓皮樣本1份，樣品信息見表1，樣品采集后55 ℃烘干，粉碎，過四號篩備用。

黃芩浸膏制備：取黃芩粉末10 g，加80 mL 70% 乙醇，超聲提取1 h，抽濾，80 ℃水浴揮發24 h，80 ℃烘箱烘40 h，研磨粉碎，80 ℃烘箱烘干8 h，即得黃芩浸膏粉末樣品。

菌株：根據生物熱力學研究特點和本研究所選中藥的主要生物活性，擬選取在分子生物學和基因工程中體外培養技術成熟、代謝功率較大的大腸桿菌作為本研究主要的生物模型。大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)由解放軍302醫院臨床醫學檢驗中心提供，自行傳代于第四代，4 ℃冰箱保存備用。

培養基：LB液體培養基，準確稱取10.0 g胰蛋白胨、5.0 g酵母浸膏、10.0 g氯化鈉混合均勻，加入1000 mL超純水溶解，調pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min，放置空氣中冷卻，4 ℃冰箱保存備用。

Thermometric 3114/3236 TAM Air Isothermal Calorimeter8通道微量量熱儀(美國TA公司)。

表1 51份黃芩樣品信息

表1(續)

注：*表示黃芩栓皮。

2 方法

2.1 微量量熱法實驗條件

根據前期技術經驗，本研究確定不同黃芩樣品生物熱動力學測定條件：37 ℃等溫條件下，培養至3～5代的大腸桿菌(菌號為44103)，接種量為1×106個·mL-1，LB培養基，安瓿法(2.5 mL)。同時本研究在以上的實驗條件下，對微量量熱法進行了方法學考察。

2.2 不同檢測通道等同性考察

本部分實驗測定在上述相同條件下，以大腸桿菌為生物模型，LB為培養基對置于TAM Air微量量熱儀8個通道中的大腸桿菌代謝同時進行監測，記錄熱譜曲線，并進行各熱譜曲線相似度(S)評價。結果表明，不同通道所測得的熱譜曲線相似度均大于0.8，說明在本實驗條件下TAM Air微量量熱儀的各個通道所測定結果具有高度的等同性。

2.3 生物熱動力學參數的抽提

功率-時間(P-t)曲線和對數lnP-t曲線的獲?。簩碴称糠湃牒銣赜?7 ℃的八通道微量量熱儀中，儀器自動跟蹤記錄大腸桿菌生長代謝過程中的熱功率變化，記錄結束提取實驗時間和熱功率數據，使用Origin 8.0軟件(OriginLab公司，美國)，以時間為橫坐標，功率為縱坐標作圖，得到P-t曲線(Ⅰ)和對數lnP-t曲線(Ⅱ)。

大腸桿菌代謝分期和生長速率常數k：正常大腸桿菌的生長代謝過程由P-t曲線形狀可以看出分為4個時期：第一指數生長期(a-b)、停滯期(b-c)、第二指數生長期(c-d)和衰亡期(d-e)。同時，從P-t曲線中得到反映細菌生長代謝的熱力學參數：細菌在指數生長期的最大產熱功率P1、P2，達峰時間t1、t2及不同時期的細菌代謝熱Q。

通過lnP-t曲線，得到關于指數生長期的lnP與t的線性方程：

lnP=lnP0+kt

(1)

式中：P為t時所對應的產熱功率，P0為t=0時所對應的產熱功率。

從方程(1)中得到細菌在指數生長期生長速率常數k1、k2。

抑菌率I計算公式為：

I=[(t2-t0)/t0]×100%

(2)

式中：t0為空白組第二指數生長期達峰時間，t2為給藥組第二指數生長期的達峰時間。

圖1 大腸桿菌生長代謝的熱譜曲線：P-t曲線(Ⅰ)和對數lnP-t曲線(Ⅱ)(T=37 ℃，n=3)

2.4 數據統計

使用SPSS 19.0對樣品熱動力學參數進行單因素方差分析，用Excel 2013進行描述統計和統計圖形的制作。

3 結果

3.1 黃芩樣品劑量的確定

以1號樣品為研究對象進行劑量考察。精密稱取1號樣品270 mg，在無菌條件下，加入18 mL的LB培養基混合均勻，使供試品母液終濃度為15 mg·mL-1。配制接種用大腸桿菌培養液25 mL。將藥液、大腸桿菌培養液、培養基按表2體積數加入安瓿瓶中，使終體積10 mL。加蓋瓶塞，密封，混合均勻，將安瓿瓶轉移至微量量熱儀通道中，跟蹤記錄大腸桿菌生長熱譜曲線，見圖 2。

表2 八通道加入體積數和樣品濃度

圖2 不同濃度黃芩1號樣品作用下大腸桿菌生長代謝熱譜曲線

從圖2可以看出，在0.9～6.3 mg·mL-1內，黃芩1號樣品可明顯抑制大腸桿菌生長代謝。以空白組為參照，0.9、1.8、2.7、3.6、4.5、5.4、6.3 mg·mL-17個不同質量濃度樣品對大腸桿菌的抑制率依次為11.5%、17.7%、22.3%、26.1%、30.8%、36.1%、41.5%。從抑制率可以看出，隨著藥物劑量增加，對大腸桿菌生長代謝的抑制作用不斷增強。為避免藥物濃度過大而出現假陽性現象，控制抑制率在合理范圍內(相當于1號樣品質量濃度5 mg·mL-1)，結合藥材浸膏得率，擬選取相當于原藥材110 mg進行不同產地黃芩樣品抑制大腸桿菌活性對比研究。

3.2 不同黃芩樣品抑菌活性比較

3.2.1 不同黃芩樣品抑菌活性總體比較 將處理好的黃芩樣品移到微量量熱儀通道中，儀器自動記錄熱譜曲線，如圖 3。不同樣品的抑菌率見表 3。

表3 不同產地黃芩樣品作用下的大腸桿菌生物熱動力學參數(T=37 ℃，n=3)

注：A.1～7號樣品；B.8～14號樣品；C.15～21號樣品；D.22～28號樣品；E.29～35號樣品；F.36～42號樣品；G.43～49號樣品；H.50～51號樣品。圖3 相同劑量不同黃芩樣品作用下大腸桿菌的生長代謝熱譜曲線(T=37 ℃，n=3)

結果發現，不同產地黃芩大腸桿菌抑菌率在24.3%～129.5%，各樣品抑菌活性存在較大差異。

3.2.2 不同栽培區黃芩藥材的抑菌活性對比 對來自河北承德、內蒙古武川、山東莒縣和山西運城的黃芩藥材進行抑菌活性對比發現(見圖 4)：承德樣品和武川樣品的抑菌活性均顯著高于莒縣和運城樣品，承德樣品分別比莒縣和運城樣品高出69.14%和113.69%。

注：a、b表示不同樣品彼此之間的差異，P <0.05；下同。圖4 不同來源黃芩藥材抑菌活性比較(n=3～10)

3.2.3 不同采收期黃芩藥材抑菌活性對比 本實驗中的黃芩材料來源于河北承德黃芩基地。于2012年4月份種子直播，2013年7月中旬—11月中旬，分5次分別取樣，制備提取物用于生物活性測定。結果發現，總體上7—11月份黃芩提取物抑菌活性出現了先下降后增加的趨勢，8—10月份抑菌活性逐漸降到最低，在11月份最高(見圖5)。

注：分別取1份混合樣品，每份樣品30～40株。圖5 不同采收時間黃芩藥材抑菌活性比較

3.2.4 不同生長年限黃芩藥材抑菌活性對比 本實驗的黃芩材料分別取自河北承德縣和內蒙古武川縣的黃芩藥材商品田，藥材提取物用于生物活性測定。結果發現，總體上兩個區域黃芩藥材的抑菌活性均呈現隨藥材生長年限增加而增強的趨勢；2年生藥材的抑菌活性分別增加了32.55%和36.20%(見圖 6)。

注：A.內蒙古樣品；B.河北承德樣品；每份樣品為30～40株的混合樣品。圖6 不同生長年限黃芩藥材抑菌活性比較

3.2.5 黃芩栓皮和黃芩藥材的抑菌活性對比 對比黃芩栓皮和黃芩根部的抑菌活性發現(見圖 7)，所有測試樣品抑菌活性在24.3%～129.5%，黃芩藥材平均抑菌率為62.96%，黃芩外栓皮為111.90%，高出藥材平均值的77.73%。

3.2.6 不同種質對黃芩抑菌活性的影響 對不同種質黃芩2年生藥材進行抑菌活性對比分析，結果發現：在承德實驗區中(見圖8A)，河北種質和內蒙古種質抑菌活性無差異，山東種質抑菌活性顯著高于河北和內蒙古種質；在內蒙古實驗區中(見圖8C)，承德種質和內蒙古種質黃芩抑菌活性接近。在山東實驗區中(見圖8B)，承德種質抑菌活性高出山東近2倍。

注：每份樣品為30～50株的混合樣品。圖7 不同生長年限黃芩藥材抑菌活性比較

注：A.承德試驗區(n=4)；B.山東試驗區；C.內蒙古試驗區；每個試驗區均取1份樣品，每份樣品為30～40株的混合樣品。圖8 不同種質黃芩抑菌活性比較

4 結論與討論

本研究采用微量量熱法考察了不同來源黃芩抑菌活性的差異，對不同黃芩的抑菌活性進行對比，得出如下結論：1)不同來源黃芩藥材的抑菌活性存在較大差異；2)河北和內蒙古樣品的抑菌活性顯著高于山東和山西樣品；3)不同采收期黃芩抑菌活性出現了先下降后增加的趨勢，11月份抑菌活性最強；4)黃芩藥材的抑菌活性隨著藥材生長年限的增加而出現增強；5)不同試驗區中不同種質黃芩抑菌活性差異較大，黃芩移栽到不同栽培區后，其抑菌活性出現了顯著的增加，其抑菌活性可能與緯度跨越有關。

基于微量量熱法的中藥生物熱活性檢測技術具有實時在線、靈敏、準確、高效、經濟、普適性好的特點，符合中藥藥效評價的客觀現實和發展方向，在理論上比現行的中藥指標性成分定性定量分析具一定優勢[2，19-26]。如采用微量量熱法研究粉防己中防己堿金屬配合物的生物活性[27]，對甘草中的多糖組分進行了抑菌活性研究[28]，另外在茵陳、麻黃、草烏、麥冬、板藍根、人工牛黃等中藥材研究上也有應用，研究人員認為微量量熱法是一種有效的體外篩選藥物的方法，可以指導藥物設計、揭示藥物與微生物間的相互作用機制，并且在指導臨床上合理使用抗菌藥等方面具有重要的應用和理論價值[29-34]。

本研究試圖探索一種基于化學成分與臨床藥效評價之間的技術方法，解決一些中藥材研究過程的共性問題。包括如何更科學地指導中藥材的適時采收，對不同產地和種質的藥材進行身份鑒定，對不同生長年限的藥材進行區分，也包括用于建立道地藥材評價體系等。

總之，從某種意義上來講，生物活性測定與化學成分測定相比，在某種程度上體現了中藥的整體效應，符合中醫藥的整體觀[9]，可作為中藥藥效評價的“預評價”方法，對于構建中藥材道地性研究評價體系具有一定的借鑒作用。

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ComparativeStudyonBacteriostaticActivityofdifferentScutellariabaicalensisBasedonMicrocalorimetricTechnique

ZENG Yan1，GUO Lanping2，WANG Jiyong1*，HUANG Luqi2*

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation,Beijing100195，China； 2.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700，China)

Objective： To study the bacteriostatic activity of differentScutellariabaicalensisbased on the microcalorimetric technique.MethodsThe effects of differentS.baicalensison the thermokinetics parameters ofEscherichiacolimetabolism were studied by using the technology of microcalorimetric, and the differences of bacteriostatic activity ofS.baicalensison different cultivation area, harvesting time, growing year and germplasm were compered.ResultsThe results showed the differences about thermokinetics parameters among the differences cultivation area. The bacteriostatic activity changed between 24.3% and 129.5%, and the samples root from Hebei and Neimeng showed stronger bacteriostatic activity than those from Shangdong and Shangxi. It exhibited the first declining later increasing of bacteriostatic activity with the harvesting time changing (from the July to the November), and the strongest bacteriostatic activity occurred in November. There were also the trends of gradually increase on the bacteriostatic activity with the increasing years of planting (from two years to five years). The experimental result of multi-site testes showed a big difference among the different plant germplasm, it should be a relevance between bacteriostatic activity and the spanning of latitude across.ConclusionThere exist some differences among these samples from difference cultivated area and the harvesting time, growing years and germplasm should also affect the bacteriostatic activity. It is concluded that the method based on the microcalorimetric technique could be used to distinguish the differentS.baicalensis, and is more convenient and faster, also provide more information for distinguish pharmacological activity of different drug sources.

ScutellariabaicalensisGeorgi; microcalorimetric; biological activity; quality distinguish

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.010

中醫藥行業科研專項(201407005-5，201507002)；中國中藥公司博士后專項(2012)；江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心項目(2013)；

*

王繼永，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：wangjiyong75@163.com；黃璐琦，中國工程院院士，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：huangluqi01@126.com

2015-03-02)