新型帕唑帕尼衍生物的合成與活性初步研究

劉 娥， 李立威

(1.荊楚理工學院 化工與藥學院， 湖北 荊門 448000；2.荊楚理工學院 藥物合成與優化湖北省重點實驗室， 湖北 荊門 448000)

新型帕唑帕尼衍生物的合成與活性初步研究

劉 娥1，2*， 李立威1

(1.荊楚理工學院 化工與藥學院， 湖北 荊門 448000；2.荊楚理工學院 藥物合成與優化湖北省重點實驗室， 湖北 荊門 448000)

在研究帕唑帕尼構效關系的基礎上，以3-甲基-6-硝基吲唑為原料，設計合成4個帕唑帕尼衍生物.化合物結構經過1H NMR、LC-MS及元素分析確證，并進行體外抗腫瘤細胞增殖活性研究.采用四氮唑鹽(MTT)法測試了4個化合物對MGC803細胞增殖的抑制作用.結果表明，目標化合物對于MGC803細胞增殖均有一定的抑制作用.

抗腫瘤活性； 酪氨酸激酶抑制劑； 合成； 帕唑帕尼衍生物

帕唑帕尼是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，由英國葛蘭素史克(GSK)公司開發.該藥通過抑制血管內皮生長因子(VEGFR)阻斷VEGF信號在腫瘤細胞中的表達，進而抑制血管的生成，達到“餓死”腫瘤的目的.帕唑帕尼作為血管腫瘤靶向藥物，具有以下優點：不易產生耐藥性，正常組織血管不易受到損傷；口服生物利用度高，抗瘤譜廣.該藥于2009年經美國食品藥品管理局(FDA)批準上市，用于治療晚期腎癌[1-4]，2012年FDA又批準用于治療進展性軟組織肉瘤.目前，又聯合其他藥物開展其他癌癥的治療[5]，如：卵巢癌、非小細胞肺癌等.盡管帕唑帕尼在臨床上表現出較為理想的有效性和安全性，但其同時仍然存在一些不良反應[6]，如：高血壓、惡心、嘔吐、腹瀉、毛發顏色改變等.因此，為了降低其副作用，增強療效，本課題組在研究帕唑帕尼的構效關系的基礎上，參考相關文獻[7-9]，設計、合成了4個帕唑帕尼的衍生物，結構經過1H NMR和LC-MS確證，并初步對其體外抗腫瘤細胞增殖活性進行了評價[10-11].其合成路線及結構見圖1.

圖1 目標化合物的結構及合成路線Fig.1 Structure and synthesis of target compounds

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DPX-400型核磁共振儀；UltiMate3000型液相色譜儀，HPLC-MS/MS (Thermo LCQFleet )，配備電噴霧離子化源(ESI).YRT-3型熔點儀(溫度計未經校正)，天津天大天發科技有限公司；RE-5298型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；Vario EL cube型元素分析儀，德國元素公司.

帕唑帕尼為實驗室自制，其余試劑為國產分析純或化學純.

1.2 實驗方法

1.2.1 中間體2，3-二甲基-6-硝基吲唑(1)的合成 將3-甲基-6-硝基吲唑(7.08 g，40 mmol)加入到裝有50 mL DMF的燒瓶中，隨后加入碳酸二甲酯(7.2 g，80 mmol)，加完后，將反應液加熱至100℃，攪拌約12 h，通過TLC檢測反應終點.停止反應后，待反應液冷卻至室溫，將其倒入500 mL冰水中，攪拌，用飽和碳酸氫鈉溶液調pH=9，過濾，得粗品.粗品經柱層析分離得黃色固體(化合物1).收率為80.3%，m.p.183.2～184.6℃.1H NMR(400MHz， CDCl3)，δ:2.69(s，3H)， 4.22(s，3H)， 7.65(d，1H)， 7.85 (d，1H)， 8.61(s，1H);ESI-MS(m/z):192.2 [M+H]+.

1.2.2 中間體2，3-二甲基-6-氨基吲唑(2)的合成 將化合物1(5.65 g，0.03 mol)溶于50 mL無水乙醇中，緩慢加入20 mL水合肼，后加入1 g FeCl3，0.5 g活性炭，加熱回流4 h，TLC監測反應，停止反應后，趁熱過濾，濾液用飽和碳酸氫鈉調至pH=9左右，用二氯甲烷萃取(50 mL×3)，合并有機相，用無水硫酸鎂干燥，蒸干，得淺黃色固體(化合物2)，收率為91.5%，1H NMR(400MHz， DMSO-d6)，δ: 2.65 (s， 3H)， 3.85(s， 2H)， 4.06 (s， 3H)， 7.21(s， 1H)， 7.74(d， 1H)， 7.83(m， 1H); ESI-MS(m/z):162.3 [M+H]+.

1.2.3 中間體N-(2-氯嘧啶-4-基)-2，3-二甲基吲唑-6胺(3)的合成 將化合物2(4.83 g，0.03 mol)溶于40 mL無水乙醇中，加入碳酸氫鈉3.8 g(0.045 mol)，然后加入2，4-二氯嘧啶8.9 g(0.06 mol)，加熱回流4 h，反應結束后，冷卻至室溫，用無水乙醇洗，得白色固體(化合物3)，收率為92.3%， m.p.215.8～216.6℃，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)，δ:2.45(s， 3H)， 3.87(s， 3H)， 6.51(d， 1H)， 6.84(m， 1H)， 7.27(s， 1H)， 7.59(t， 2H)， 8.11(d， 1H); ESI -MS(m/z):274.1 [M+H]+.

1.2.4 中間體N-(2-氯嘧啶-4-基)-N，2，3-三甲基吲唑-6胺(4)的合成 在250 mL燒瓶中加入化合物3(5.46 g，0.02 mol)，加入DMF100 mL使之溶解，后加入碳酸銫9.8 g(0.03 mol)和碘甲烷4.2 g(0.03 mol)，室溫下攪拌1 h，后將反應液倒入冰水中，攪拌使固體充分析出，抽濾，水洗得淡黃色固體(化合物4)，收率為82.7%， m.p.175.3～177.2℃，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)，δ:2.66(s， 3H)， 3.45(s， 3H)， 4.05(s， 3H)， 7.29(d， 1H)， 7.48 (d， 1H)， 7.72(d， 1H)， 7.86(d， 1H)， 7.92(s， 1H); ESI-MS(m/z):288.2 [M+H]+.

1.2.5 化合物5a～5d的制備 在250 mL燒瓶中加入化合物4(5.75 g，0.02 mol)和50 mL無水乙醇，向其中加入相應的芳胺，攪拌下加熱回流5 h，經TLC顯示反應完全，冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙醇淋洗(20 mL×3)，得粗品，后經過柱層析純化(乙酸乙酯∶石油醚=1∶5)得目標化合物5a～5d．

5a：白色固體，收率72.8%， m.p.:181.7～182.5℃，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)，δ:2.20(s， 3H)， 2.77(s， 3H)， 3.33(s， 3H)， 3.52(s， 3H)， 5.68 (d， 1H)， 6.33(d， 1H)， 6.42(s， 1H)， 6.58(d， 1H)，6.69(s， 1H)， 7.72(d， 1H)， 7.56(d， 1H)， 8.55(s， 1H)， 9.13(s， 1H); ESI-MS(m/z):360.2 [M+H]+.元素分析(%): C 66.18， H 5.93， N 26.82， 理論值(%): C 66.82， H 5.84， N 27.30.

5b：白色固體，收率68.4%， m.p.:203.3～204.7℃，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)，δ: 2.75(s， 3H)， 3.37(s， 3H)， 3.71(s， 3H)， 5.70(d， 1H)， 6.35(d， 1H)， 6.63(s， 1H)， 7.20(s， 1H)， 7.70(d， 1H)，7.65(d， 1H)， 8.66(s， 1H)， 8.74(s， 1H)， 9.15(s， 1H);ESI-MS(m/z):380.5 [M+H]+.元素分析(%): C 60.15， H 4.96， N 25.13， 理論值(%): C 60.08， H 4.74， N 25.82.

5c:類白色固體，收率76.7%， m.p.:194.7～195.9℃，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)，δ: 1.35 (s， 3H)， 2.54(t， 2H)， 2.77(s， 3H)， 3.35(s， 3H)， 3.62 (s， 3H)， 5.71(d， 1H)， 6.41(d， 1H)，6.70(s， 1H)， 6.91(s， 1H)， 7.31(s， 1H)， 7.74(d， 1H)， 8.35(s， 1H)， 8.68(s， 1H)， 9.36(s， 1H); ESI-MS(m/z):374.4 [M+H]+.元素分析(%): C 67.15， H 6.09， N 26.15， 理論值(%): C 67.56， H 6.17， N 26.27.

5d：白色固體，收率73.2%， m.p.:217.7～218.5℃，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)，δ: 2.56(s， 3H)， 3.21(s， 3H)， 3.54 (s， 3H)， 5.73(d， 1H)， 6.40(s， 1H)， 6.82 (s， 1H)， 7.55 (s， 1H)， 7.61 (s， 1H)， 7.69(d， 1H)， 7.77(d， 1H)， 8.12(s， 1H)， 8.37(s， 1H)， 9.89(s， 1H); ESI-MS(m/z):390.7 [M+H]+.元素分析(%): C 61.21， H 4.35， N 24.97， S 8.06;理論值(%): C 61.70， H 4.88， N 25.19， S 8.23.

1.3 目標化合物對腫瘤細胞的抑制活性評價

采用四氮唑鹽(MTT)法，以帕唑帕尼為陽性對照，將所得的4種目標化合物針對MGC803細胞進行體外抗腫瘤增殖活性評價.將處于對數生長期的細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640的培養液稀釋至所需濃度，加入到96孔板中，培養24 h.受試化合物分別溶解并稀釋成5個濃度(10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，培養4～5 d，每孔加入10 mL 5 mg·mL-1的MTT溶液，培養4 h，吸出上清，加入200 μL的二甲亞砜使甲臜溶解，用酶標儀在570 nm處檢測，并計算半數抑制濃度.結果顯示，目標化合物5a～5d對MGC803細胞的IC50分別為(9.516±0.724)、(3.921±0.617)、(10.335±0.425)、(1.238±0.766)μmol·L-1， 陽性對照品帕唑帕尼的IC50為(4.925±0.537)μmol·L-1.其中5b和5d抑制活性略高于帕唑帕尼，可作為先導化合物進一步研究.

2 結果與討論

2.1 合成部分

以3-甲基-6-硝基吲唑為起始原料，經過甲基化得到中間體2，3-二甲基-6-硝基吲唑，有文獻報道該步采用硫酸二甲酯，但是考慮到硫酸二甲酯的毒性以及對環境的污染，筆者改用碳酸二甲酯進行甲基化.

在將硝基還原為氨基的過程中，文獻一般采用Pd/C 催化加氫或Fe/NH4Cl還原，但考慮到成本以及后處理問題，本文采用了水合肼還原法，而且也獲得了較好的收率.

設計了幾個芳胺化合物，通過與中間體N-(2-氯嘧啶-4-基)-N，2，3-三甲基吲唑-6胺反應，制備得到目標化合物5a～5d，產物結構經過1H NMR、元素分析及LC-MS確證.

2.2 活性部分

采用MTT法對目標化合物進行了體外活性測試，結果表明：在嘧啶環上再引入吡啶環，均表現出一定的對MGC803細胞增殖的抑制作用，其中5b和5d抑制活性較好，從結構上來看，可能是因為在吡啶環上引入了鹵素，另外，苯并噻唑基的引入也同樣增加了化合物的抑制活性.

3 結論

本課題組在研究帕唑帕尼構效關系的基礎上，以3-甲基-6-硝基吲唑為原料，設計合成了4個帕唑帕尼衍生物，目標化合物結構經過1H NMR、元素分析和LC-MS確證，對中間體的合成工藝也進行了改進.同時，以帕唑帕尼為陽性對照品，采用MTT法對目標化合物進行了體外抗腫瘤細胞增殖活性評價，發現目標化合物均有一定的抑制腫瘤細胞增殖的活性，其中化合物5b和5d有較好的抑制活性，可作為先導化合物進一步研究.

[1] JIA Y， ZHANG J， FENG J， et al. Design， synthesis and biological evaluation of pazopanib derivatives as antitumor agents[J]. Chem Biol Drug Des， 2014，83: 306-316．

[2] 吳智鴻， 趙硯瑾， 王永珍， 等. 帕唑帕尼衍生物的合成與初步的活性評價[J].化學工程師，2015，4:12-15．

[3] 呂水利， 王 鵬， 張艷利. 帕唑帕尼治療晚期腎細胞癌的臨床研究進展[J].中國醫藥指南，2013，12(11):340-341．

[4] PHILIP A H， AMOGH B， MUI C， et al. Discovery of 5-[[4-[(2，3-Dimethyl-2H-indazol-6-yl) methylamino]-2-pyrimidinyl]amino]-2-methylbenzenesulfonamide(Pazopanib)， a novel and potent vascular endothelial growth factor receptor inhibitor[J]. J Med Chem， 2008，51: 4632-4640．

[5] GIROLAMO R， MARIA M， EUGENIO D D P，et al. Pazopanib a tyrosine kinase inhibitor with strong anti-angiogenetic activity: a new treatment for metastatic soft tissue sarcoma[J]. Critical Reviews in Oncology/Hematology，2014，89: 322-329．

[6] 鄭宇靜， 姜文亮， 王志宏， 等. 酪氨酸激酶抑制劑帕唑帕尼的藥理與臨床研究[J].中國新藥雜志，2011，20(12):1057-1060．

[7] QI H， CHEN L， LIU B， et al. Synthesis and biological evaluation of novel pazopanib derivatives as antitumor agents[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2014，24: 1108-1110．

[8] 舒 婷， 李光興. 碳酸二甲酯作甲基化試劑的研究進展[J].化工中間體， 2008(1) : 20-23．

[9] 劉夢露， 方 麗， 李振華. 鹽酸帕唑帕尼的合成工藝改進[J].合成化學， 2014，22(1)：121-123．

[10] 張曉凱， 劉登科， 劉冰妮， 等. 新型含嘧啶環吲唑衍生物的合成及初步生物活性研究[J].中國藥物化學雜志， 2013，23(1):15-20．

[11] 李 偉， 雷春花， 王立強， 等. 多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑喹啉衍生物的合成及活性初步研究[J].中國新藥雜志， 2016，25(13):1522-1530.

Synthesisandpreliminaryanticanceractivityofnovelpazopanibderivatives

LIU E1，2， LI Liwei1

(1.College of Chemical Engineering and Pharmacy， Jingchu University of Technology， Jingmen， Hubei 448000，China; 2.Hubei Key Laboratory of Drug Synthesis and Optimization， Jingchu University of Technology， Jingmen， Hubei 448000， China)

Based on the structure-activity relationship of pazopanib， four novel pazopanib derivatives were synthesized with 3-methyl-6-nitroindazole as raw materials. The structures of the compounds were identified by1H NMR， LC-MS and elemental analyses， and the anti-proliferation activity of tumor cells were studied in vitro. MTT method was used to test the inhibition effect of proliferation activity of the target compounds on MGC803 cell. The results showed that the target compounds were able to inhibit the proliferation of MGC803 cells.

antitumor activity; tyrosine kinase inhibitor; synthesis; pazopanib derivatives

2017-04-17.

湖北省自然科學基金項目(2013CFA015)；藥物合成與優化湖北省重點實驗室開放基金項目(OPP2015YB04)；湖北省教育廳科研項目(Q20164303).

*通訊聯系人. E-mail: liue2011@126.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.06.010

1000-1190(2017)06-0782-04

O625.63

A