大鼠無創性肺功能檢測指標的建立

劉俊丹，邱文才，李紫元，梁偉燊，唐陸平，何永明

(佛山科學技術學院獸醫系，廣東佛山 528000)

大鼠無創性肺功能檢測指標的建立

劉俊丹△，邱文才△，李紫元，梁偉燊，唐陸平*，何永明*

(佛山科學技術學院獸醫系，廣東佛山 528000)

用雙腔法測量大鼠肺功能的基礎數據，為呼吸系統疾病相關的大鼠動物模型的肺功能檢測提供參考。采用EMKA無創肺功能監測系統，對40只SD大鼠肺功能的17項指標(潮氣量,TV；最大呼氣量,EV；每分通氣量,MV；吸氣時間,Ti；呼氣時間,Te；吸氣流峰值,PIF；呼氣流峰值,PEF；間歇時間,RT；呼吸頻率,f；吸氣末期停頓,EIP；呼氣末期停頓,EEP；暫時停頓,Pau；支氣管收縮程度,Penh；延遲時間,dT；特殊氣道阻率,SRaw；特殊氣道導率,SGaw；呼氣中期流速,EF50)進行檢測。TV值為1.01 mL (0.41～2.23),EV為1.01 mL (0.41～2.22),MV為226.02 mL (76～517),Ti為144.17 msec (108～204),Te為172.45 msec (118～265),PIF為11.05 mL/s (4.6～27.1),PEF為10.58 mL/s (3.4～23.9),RT為107.08 msec (76～188),f為196.88 bpm(141～255),EIP為2.72 msec (2～4),EEP為19.56 msec (13～32),Pau為0.63 (0.41～0.88),Penh為0.62 (0.33～1.06),dT為39.56 ms (4.56～96.38),SRaw為38.53 cm H2O.s (2.27～83),SGaw為0.078 l/cmH2O.s (0.01～0.37),EF50為9.5 mL/s (3～20)。試驗同時發現，大鼠肺功能部分指標在不同時間段、不同性別差異具有顯著意義。首次測得SD大鼠無創肺功能多項指標，對呼吸系統疾病的研究和相關標準的制定有著重要的參考價值。

無創式動物肺功能檢測分析儀；氣流信號；雙腔法；肺功能

肺功能檢查是呼吸系統疾病的必要檢查之一，對于評估疾病的病情嚴重程度、診斷病變部位、評及對危重病人的監護等方面有重要的指導意義。隨著呼吸生理及藥理學研究的發展，在很多呼吸系統疾病的動物模型中動物肺功能的測定顯得尤為重要。雙腔法檢測具有其獨特的優勢，具有無創傷的特點，且靈敏度強。而特殊氣道阻率(SRaw)和特殊氣道導率(SGaw)都是雙腔法檢測的一個特點，也是學術界廣泛認可的無創肺功能檢測指標。雖然雙腔體積描記法在1979年已作為一種參考技術用于豚鼠肺功能的檢測，但用于大鼠肺功能基礎數據的檢測未見報道。EMKA無創式動物肺功能檢測分析儀是一種無創特殊氣道阻力與氣道高反應的檢測分析系統，具有操作簡便，數據穩定，敏感性高的特點[1]。EMKA能對多種動物進行檢測，無需麻醉及氣管插管，能夠完全自動校準，且能夠自動感應動物種類并調整軟件分析參數設定，是清醒動物有約束類檢測系統中唯一適合量篩選試驗的儀器。本試驗運用無創雙腔法對正常大鼠的肺功能進行檢測分析，為呼吸系統疾病的臨床研究提供科學、合理的基礎試驗數據[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 健康SPF級6周齡～7周齡SD大鼠80只，大鼠平均體重200 g±20 g，雌雄各半。SD大鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。將雄大鼠(♂)編號為A1至A20，雌大鼠(♀)編號為B1至B20。大鼠適應環境1周后用于試驗。試驗期間正常飲食，室內溫度保持在23℃～25℃、濕度60%左右，光照時間保持在12 h左右(9:00 am ～21:00 pm)，籠具保持清潔衛生。

1.1.2 試驗儀器 EMKA小動物無創式肺功能監測系統購于法國EMKA Technologies公司，小動物無創式肺功能監測系統包括EMKA 肺功能IOX數據采集軟件操作系統(IOX v 2.9)、EMKA 肺功能數模轉換器、前置放大器、傳感器、通氣泵等。

1.2 方法

1.2.1 試驗環境模擬 正式試驗前1周，每天對大鼠進行模擬試驗訓練，試驗時保持安靜，直至數據比較穩定和有規律后進行試驗。

1.2.2 正式試驗 試驗開始第1天早晨6:00，按照標號順序從A1到A20，將每只雄性大鼠放入雙腔室內進行實際測量，系統自動生成數據并保存，每次測定時間約5 min。正式試驗開始第1天中午12點，按照標號順序從B1到B20，將每只雌性大鼠放入雙腔室內進行實際測量，同上。第1天剩余的兩個時間段，按照前兩個步驟要求重復操作。第2天開始，調換A、B組的試驗順序，重復上面三個步驟操作。按照以上步驟重復以上操作2次，結束試驗(表1)。

圖1 EMKA肺功能分析系統連接示意圖

時間Time6：0012：0018：0024：00-4d(simulation)♂♀-3d(simulation)♂♀-2d(simulation)♀♂-1d(simulation)♀♂0d(Rest)+1d(Start)♂♀♂♀+2d(Start)♀♂♀♂+3d(Start)♂♀♂♀+4d(Start)♀♂♀♂

連接好設備后，將大鼠引入雙腔室，固定住大鼠并盡量減少應激，使其在雙腔室內保持平靜后開始進行數據采集。使用EMKA 肺功能IOX數據采集軟件操作系統按規范程序進行測量。

2 結果

2.1 不同時間段大鼠肺功能指標檢測結果

40只健康大鼠進行4天的肺功能測試，其數據采集采用EMKA肺功能分析系統(圖2)，將大鼠在四個時間段各項肺功能指標的變化情況進行整理(表2)。試驗結果表明大鼠肺功能的各項指標都有不同程度的變化：TV與EV的18:00分別與6:00和12:00差異顯著(P<0.05)；MV和EF50的6:00與18:00差異顯著(P<0.05)；Ti的12:00與其他3個時間段差異顯著(P<0.05)；Te、PIF、PEF、RT、Penh、f、EIP的6:00與其他3個時間段的值差異具有顯著性(P<0.05)；EEP的6:00與12：00、24:00差異顯著(P<0.05)；SRaW的6:00與12:00、18:00差異顯著(P<0.05)；SGaW的12:00與24:00差異顯著(P<0.05)，而6:00與其他3個時間段具有顯著性(P<0.05)差異；同時Pau與dT的4個時間段的值均無差異(P>0.05)。

2.2 不同性別大鼠肺功能指標檢測結果

分別對雌、雄大鼠肺功能各項指標統計分析，發現除了TI、Pau、penh和EEP外，所有檢測結果差異顯著(P<0.05)。結果如表3所示。

2.3 大鼠肺功能正常參數值范圍

通過上述指標測定結果，本試驗計算了正常生理情況下，SD大鼠肺功能正常參考范圍，如表4所示。

3 討論

目前對大鼠肺功能檢測的方法與指標不多，對動物存在較大損傷，且尚未有完整的SD大鼠肺功能正常參考值范圍報道。比如安志遠等在麻醉動物手術中切開氣管后用AniRes2005動物肺功能分析系統檢測了Wistar大鼠部分肺功能指標[3]，如吸氣阻力(Ri)、呼氣阻力(Re)、最大通氣量(MVV)等，試驗設計簡單，檢測指標比較少，而且對動物造成傷害較大。本研究采用無創方法檢測SD大鼠肺功能基礎數據，對動物無傷害、且測量的數據比較全面，高達17項，能夠為臨床呼吸系統肺功能檢測提供科學、合理的試驗依據。

圖2 EMKA肺功能分析系統數據采集圖

項目Item時間Time6：0012：0018：0024：00TV1．16±0．23a1．04±0．20a0．85±0．24b1．00±0．33abEV1．16±0．29a1．04±0．20a0．85±0．23b1．00±0．03abMV254．90±66．64a208．32±49．88ab187．40±54．99b213．38±62．45abTi141．23±15．80b152．13±17．99a139．67±16．60b143．65±17．67bTe156．30±22．67b182．84±32．72a173．82±34．27a176．81±33．66aPIF13．11±3．15a10．58±2．45b9．56±2．65b10．95±30bPEF12．69±2．54a10．11±2．79b9．19±2．92b10．33±3．02bRT96．46±13．73b114．62±25．11a110．80±28．23a109．31±19．58af218．30±19．56a191．52±20．65b192．66±17．64b184．90±16．92bEIP2．40±0．62b2．87±0．53a2．85±0．49a2．75±0．55aEEP17．90±2．46b20．58±3．58a19．40±3．62ab20．36±4．07aPau0．65±0．05a0．62±0．09a0．62±0．10a0．64±0．08aPenh0．67±0．12a0．60±0．13b0．60±0．14b0．61±0．10bdT43．95±15．32a37．83±9．70a39．63±14．91a40．59±14．54aSRaw47．62±10．79a34．49±9．26b34．33±13．08b37．68±13．24abSGaw0．02±0．005c0．11±0．042a0．10±0．053b0．07±0．024bEF5010．82±2．00a9．02±2．40ab8．05±2．64b9．33±2．81ab

注：同一行小寫字母不同，表示差異顯著，P<0.05。

Note：Data with different small letters mean significant difference (P< 0.05).

大鼠肺功能TV表示平靜呼吸時每次吸入或呼出的氣體，EV是指一定時間內所能呼出的氣體量，兩者的生理學意義完全不同，但是本試驗結果發現TV與EV的平均值相等都為1.01 mL，我們推測造成這種結果的原因是動物不能有意識的盡最大的力呼吸，因而儀器檢測到的最大呼氣量并不準確，導致兩個數值的平均值一樣，更深的其他原因還有待進一步研究。PEF是深吸氣后用力快速呼氣時的最高呼氣流速。PIF指用力呼氣和吸氣的最大流速。f是指每分鐘呼吸的次數。有報道指出[4-5]，使用BUXCO@HOP系統檢測雄性大鼠的f在100 bpm～250 bpm，MV在200 mL～300 mL，而本研究結果發現這幾個指標分別為200.44 bpm±17.04 bpm、1.31 mL±0.40 mL、279.45 mL±73.36 mL，與報道相符合。同時，本研究結果發現用全身體積描計(WBP)測量的f、TV、MV、PIF與PEF的值(本文未列出)跟用雙腔法測量的有很大差異。除此之外，我們的試驗結果表明雙腔法還可以測定SRaw、SGaw和EF50，而WBP則不能檢測。這是由于WBP是整個動物的呼吸氣流都一起檢測，動物不受約束，而雙腔法是動物的鼻部與胸部分開測量，因此對具體部位肺功能指標檢測更精確。Penh是標準通氣指標，該值用于小動物整個肺功能的總體篩選，可反映氣道反應性[6]。 哮喘是一種氣道梗阻常伴有不同程度的氣道高反應性，Penh值越大，說明哮喘模型越成功，因此，在哮喘模型以及治療時經常把Penh作為一個重要檢測指標[7]。同時，哮喘模型還關注PEF、PIF、f和TV等指標的變化[8-9]。SRaw表示氣道的反應性，適用于各種阻塞式通氣功能障礙性疾病，阻力增大可表現為咳嗽、氣短，在慢性支氣管炎、肺氣腫情況下阻力明顯增加；EF50直接與氣道阻力相關[10]，有研究報道雙腔體積描記法檢測EF50是首次用于測量清醒小鼠氣道反應性的有效方法，并常用于試驗性哮喘的動物模型、肺切除后的動物模型、高氧動物模等[11]。以上結果提示我們采用雙腔法檢測肺功能指標在哮喘、咳嗽、支氣管炎等呼吸道疾病的檢測中更為準確、可靠。

表3 大鼠肺功能不同性別檢測結果

注：同行小寫字母不同，表示差異顯著，P<0.05。

Note：Data with different small letters mean significant difference (P< 0.05).

表4 大鼠肺功能參考值范圍

晝夜節律對大鼠的能量代謝有一定的影響，在夜間休息狀態下，其生理的能量代謝也會降低，早上生理代謝比較旺盛[12]。本研究發現大鼠TV、MV、PIF、PEF、f、Pau、Penh、SRaW和EF50的6:00的測量值均比其他三個時間段高，其中PIF、PEF、f、Penh、SRaw、SGaW和EF50明顯高于24點，說明機體夜間代謝相對較低。同時，潮氣量、最大呼吸量等都與呼吸習慣、肌體的新陳代謝有一定的關系[13]。本研究表明大鼠肺功能其他各個指標在不同的時間段都有顯著性差異，說明在一天不同的時間段大鼠肺的生理功能是變化的，但試驗發現其變化都在正常生理范圍內。因此，可以選擇在任一時段進行藥理學、毒理學等方面的研究，但為了試驗的齊性更好，應盡量避免夜間睡眠時間進行試驗。

不同性別對肺病的敏感性是不同的，男女在正常生理狀態下的呼吸功能也有小部分不同[21]。本研究分別對雌、雄大鼠肺功能各項指標檢測后進行統計分析，試驗結果表明大鼠肺功能主要指標Ti、Penh和EEP這4項指標在不同性別中無顯著差異外，其他指標檢測結果都有顯著差異，這與已有報道相符合[14]。由于性別不同引起部分參數有差異，這提示我們在藥物研發中，如果用藥目標不是單一性別，那么必須選擇兩種性別的大鼠進行試驗，而且需分別統計分析。

以上試驗結果表明，采用無創雙腔法檢測SD大鼠肺功能基礎數據，可以制定一份準確全面的肺功能檢測參考值范圍，為后期進行各種藥理學試驗以及呼吸系統、免疫系統疾病的診斷、治療和評估[15]提供試驗依據，對呼吸系統疾病動物醫學研究和臨床治療具有重要的指導意義。

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DevelopmentofDetectionIndicesofNoninvasiveLungFunctioninRats

LIU Jun-dan,QIU Wen-cai,LI Zi-yuan,LIANG Wei-shen,TANG Lu-ping,HE Yong-ming

(DepartmentofVeterinaryMedicine,FoshanUniversity,Foshan,Guangdong,528000，China)

The basic data of the rat lung functions were measured by double cavity method,which would provide a reference for the detection of pulmonary function in the rat animal models related to respiratory system diseases.17 items of lung functions in 40 (Sprague-Dawley) SD rats were determined by EMKA noninvasive pulmonary function monitoring system,which were tidal volume,TV; expired volume,EV; minute volume,MV; inspiratory time,Ti; expiratory time,Te; peak inspiratory flow,PIF; peak expiratory flow,PEF; relaxtion time,RT; breathing frequency,f; end-inspiratory pause,EIP; end-expiratory pause,EEP; pause,Pau; enhanced pause,Penh; time delay,dT; specific airway resistance,SRaw; specific airway conductance,SGaw and mid-expiratory flow,EF50.The measured values were as follows : TV was 1.01 mL (0.41-2.23),EV 1.01 mL (0.41-2.22),MV 226.02 mL (76-517),Ti 144.17 msec (108-204),Te 172.45 msec (118-265),PIF 11.05 mL/s (4.6-27.1),PEF 10.58 mL/s (3.4-23.9),RT 107.08 msec (76-188),f 196.88 bpm (141-255),EIP 2.72 msec (2-4),EEP 19.956 msec (13-32),Pau 0.63 (0.41-0.88),Penh 0.62 (0.33-1.06),dT 39.56 msec (4.56-96.38),SRaw 38.53 cmH2O.s (2.27-83 ),SGaw 0.078 l/cmH2O.s (0.01-0.37) and EF 50 9.5 mL/s(3-20).Meanwhile,the results showed that partial indicators of pulmonary functions in rats had significant differences between different periods and gender.Multi-indices of noninvasive lung function in SD rats were measured for the first time,which had irreplacable value for the study of respiratory diseases and the establishment of relevant standards.

noninvasive lung function testing analyzer; air flow signal; double body cavity; lung function

2017-03-04

十二五農村領域國家科技計劃課題(2011BAD34B00);農業部行業科技專項(201003060-09);廣東省省級科技計劃項目(2015A040404048);佛山市科技計劃項目(佛財工〔2015〕143 )

劉俊丹(1991-)，女，廣西人，碩士研究生，主要從事中獸藥研制和開發工作?！魍蓉暙I作者。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0049-05