一株海洋細菌YCSC6的鑒定及其體外殺盾纖毛蟲的能力

杜光迅, 曲凌云, 2, 尚 琨, 3, 王 琛, 高 萍

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一株海洋細菌YCSC6的鑒定及其體外殺盾纖毛蟲的能力

杜光迅1, 曲凌云1, 2, 尚 琨1, 3, 王 琛1, 高 萍1

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 2. 海洋科學與技術國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266235; 3. 大連海洋大學, 遼寧 大連116023)

為開發安全、高效的防治大菱鲆()盾纖毛蟲(scuticociliate)病新型藥物, 本研究從近海微生物菌種資源庫中篩選獲得了一株有殺盾纖毛蟲效果的細菌, 利用形態學和分子生物學方法鑒定該菌為肋生鹽弧菌(), 通過共培養實驗進行YCSC6殺滅大菱鲆病原性盾纖毛蟲的藥效活性實驗, 同時利用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察記錄YCSC6的殺蟲特征。結果發現海洋細菌YCSC6發酵上清液可導致盾纖毛蟲膜出現穿孔, 膜完整性喪失從而裂解, 在一定時間內, 發酵液發酵時間越長, 裂解能力越強。本研究從安全、高效的角度出發, 篩得一株可裂解盾纖毛蟲的海洋細菌YCSC6, 并初步探究了其殺蟲特征及能力, 為養殖漁業微生物殺蟲劑的開發提供了安全有效的來源。

大菱鲆(); 盾纖毛蟲(scuticociliate); YCSC6; 裂解; 微生物殺蟲劑

大菱鲆()養殖是中國一項特色產業, 然而病害的困擾使該產業每年都面臨巨大經濟損失[1-4]。在各種養殖疾病中, 寄生蟲疾病是一種常見病, 而其中危害最大的是盾纖毛蟲(scuticociliate)病[5]。盾纖毛蟲屬兼性寄生蟲, 寄生在魚類的組織中, 通過吞噬魚細胞及組織進行生長、繁殖[6]。感染初期, 魚體出現白斑且黏液增多, 隨后病灶處出現紅腫, 甚至潰爛出血。該病在育苗期、養成期均可發生, 且傳染快、發病率高, 往往引起養殖魚的大規模死亡, 造成無法挽回的損失[5-7]。近年來, 在各種海水經濟動物的養殖中(魚類、甲殼類和海參等), 由纖毛蟲所導致的病害發生范圍及危害程度均呈遞增趨勢[8-10]。針對纖毛蟲病危害的頻發, 國內主要采用甲醛、硫酸銅等來防治該病的發生[11]。但長期使用農藥及化學藥物, 會帶來環境污染、藥物殘留等問題, 也成為當前食品安全和水產品出口的綠色貿易壁壘問題, 因此尋找新型的殺蟲藥物成為當務之急, 國內許多研究組開展了中草藥制劑的研制工作, 但鮮有通過微生物進行生物防治盾纖毛蟲的報道及研究[12-13]。

微生物殺蟲劑是21世紀農藥工業的新產業, 指應用微生物本身及其代謝產物防治害蟲的一種制劑, 具有藥效穩定、施用方便、環保等優勢[14]。海洋微生物數量龐大且生境特殊, 其可產生不同于陸地來源的代謝產物, 這些代謝產物往往具有結構新穎獨特、生物活性多樣顯著的特點[15], 研究者不斷獲得來自于海洋微生物的抗菌殺蟲活性物質。例如Marques等[16]研究的海洋細菌sp.胞外分泌物具有抗菌及清除DPPH自由基的能力; 譚洪升等[17]從兩株海洋放線菌(sp.)的次級代謝物中發現13種對HeLa細胞系有極強毒性的抗霉素類化合物; 李子等[18]研究的真菌H-21可產生一種fusarentin類殺蟲藥物; 徐樹蘭[19]發現海洋真菌(代號為1893)發酵液的乙酸乙酯萃取物對白蚊伊蚊()和桃蚜()具有一定的毒殺作用; 吳珊等[20]發現芽孢桿菌()UST050418-715的代謝產物中存有大量可防御硅藻附著海綿的二肽類化合物; 方衛東等[21]發現蠟狀芽孢桿菌()K2-1發酵上清液對大菱鲆常見致病菌有較強拮抗作用。

本研究針對大菱鲆病原性盾纖毛蟲, 從近海微生物菌種資源庫中篩選獲得了一株有殺盾纖毛蟲效果的細菌, 對該菌株開展了細菌鑒定和殺蟲機制的初步研究, 旨在為防治大菱鲆盾纖毛蟲病開發安全、高效的新型藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株及盾纖毛蟲

海洋菌株YCSC6來自黃海海域, 保藏于國家海洋局第一海洋研究所菌種庫(–80℃); 盾纖毛蟲分離自大菱鲆病變腦組織, 并由中國海洋大學原生動物學研究室鑒定(另文報道)。

1.1.2 纖毛蟲培養液

20 mL海水高壓滅菌, 待冷卻至室溫加入10粒大米, 接種1 mL纖毛蟲原液, 放置于17℃培養室培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株形態特征觀察及生長特性

平板法觀察YCSC6的菌落特征, 用透射電鏡來觀察細菌形態特征。生長曲線的測定: 將YCSC6菌株按照1%()接種于2216E液體培養基中, 30℃、120 r/min振蕩培養, 每隔1 h取樣1次, 測其OD600值。鹽度耐受實驗中鹽度梯度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30, 溫度耐受實驗中溫度梯度為4、10、15、20、25、30、35、37、40、42、45、55及65℃, pH耐受實驗中pH值梯度為4、5、6、7、8、9、10、11, 12 h后測定各菌液的OD600值。

1.2.2 細菌生理生化特性實驗

采用API 20NE、API ZYM、API 50CH試紙條及 Biolog GN2微孔板對菌株的生理特性進行測定。選用紙片擴散法進行YCSC6抗生素藥敏試驗, 根據抑菌圈直徑的大小, 判定該菌株對抗生素的敏感性。

1.2.3 16S rRNA基因的擴增與序列分析

采用水煮法獲得YCSC6基因組DNA作為模板, 以27F和1492R[22]為引物, 配制PCR反應體系60 μL, 按PCR反應條件擴增16SrRNA基因。將PCR產物送至青島擎科生物醫藥科技有限公司測序。

1.2.4 系統發育分析

將所得的16S rRNA基因序列提交到NCBI, 同時將測定的16S rRNA序列在Ez-Taxon數據庫中進行同源性比對[23], 選取與該菌株相似性最高的模式菌16S rRNA基因序列, 構建系統發育樹。

1.2.5 細菌發酵液的獲取及處理方法

按1%接種量接種細菌母液于20 mL滅菌液體培養基中, 并在30℃、120 r/min條件下振蕩培養24 h; 培養結束后, 將發酵液以5 000 r/min的速度離心20 min, 收集上清液于滅菌錐形瓶中以備后續試驗使用。

1.2.6 盾纖毛蟲的培養

將盾纖毛蟲接入纖毛蟲培養液中, 于17℃培養箱中進行擴繁培養。培養大約10 d后, 盾纖毛蟲種群密度可達到8 000個/mL, 此時的密度適合后續試驗的進行。

1.2.7 細菌發酵液與盾纖毛蟲的共培養

取10 mL雜質少的盾纖毛蟲培養液于滅菌錐形瓶中, 然后加入等量經離心處理的細菌發酵液, 輕輕震蕩混勻, 于20℃培養箱中共培養。

1.2.8 盾纖毛蟲的顯微及掃描電鏡觀察

顯微觀察: (1)取剛剛混勻后的共培養液500 μL于浮游生物計數框中, 在顯微鏡下觀察并記錄盾纖毛蟲的運動情況; (2)分別在0、3、6、9、12、24 h后, 取1 mL共培養液于1.5 mL Ep管中, 并立即加入100 μL 2%戊二醛進行固定[12], 然后取200 μL液體于載玻片上, 在顯微鏡下觀察纖毛蟲的裂解情況, 并拍照記錄。掃描電鏡觀察: 分別取適量纖毛蟲原液及共培養6 h后的纖毛蟲于胚胎皿中, 在解剖鏡下按照胡鏑[24]的方法進行固定、清洗、脫水、置換, 采用真空冷凍干燥進行最終干燥后, 使用掃描電鏡觀察拍照。

1.2.9 YCSC6發酵液裂解能力的初步測定

準備12個相同規格的50 mL錐形瓶, 分別準確量取20 mL液體培養基并高壓滅菌。其中11瓶按1%的接種量接種等量細菌母液, 剩余1瓶加等量無菌海水作為對照組。將接種后的錐形瓶于30℃搖床培養箱中分別培養12、18、24、30、36、42、48、54、60、66及72 h后, 按照1.2.5的方法收集發酵液。將發酵時間不同的發酵液與等體積纖毛蟲共培養, 培養時間分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12 h, 設置3組平行實驗, 然后各取1 mL共培養液, 經戊二醛固定后用浮游生物計數框在顯微鏡下計數完整盾纖毛蟲個體數量, 并記錄。

2 結果

2.1 菌株形態特征及生長特性

YCSC6為革蘭氏陰性菌, 菌落表面較濕潤、平滑, 邊緣平整, 正反面、中央與邊緣顏色一致, 均呈淡黃色、半透明, 菌落小而隆起, 致密。透射電鏡下觀察: 菌體彎曲成弧形尾部有一長鞭毛、大小為(1.40~ 2.85)μm×(0.57~0.71)μm(長×寬, 圖1)。

圖1 YCSC6的透射電鏡照片(標尺為500 nm)

該菌株的生長鹽度范圍為1%~15%, 最適生長鹽度為3%; 生長溫度范圍10~45 ℃, 最適生長溫度為37℃, 生長pH范圍6~9, 最適生長pH為6~7。生長曲線顯示YCSC6在液體培養11 ~12 h后達生長穩定期(圖2)。

2.2 YCSC6生理生化特性

采用API 20NE、API ZYM、API 50CH試紙條對菌株YCSC6的生理特性進行測定, 結果如表1所示。

表1 細菌YCSC6的API測試結果

圖2 菌株YCSC6的生長曲線

Biolog測試結果顯示下列物質可以被YCSC6用作單一碳源: 糊精、吐溫-40、吐溫-80、N-乙?；?D-半乳糖胺、N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-果糖、α-D葡萄糖、麥芽糖、D-阿洛酮糖、D-山梨醇、D-海藻糖、甲基丙酮酸、D-葡萄糖酸、D, L-乳酸、琥珀酸、肌苷、胸腺嘧啶核苷、丙三醇。主要碳源: 吐溫-40、N-乙?；?D-半乳糖胺、α-D葡萄糖、D-海藻糖、甲基丙酮酸。

通過對YCSC6的17種常見抗生素藥物的藥敏測試, 發現該菌對慶大霉素、新霉素、青霉素(G)、林可霉素、萬古霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、丁胺卡那有抗性, 能夠被硫酸粘菌素、多西環素多粘菌素B、恩諾沙星、氟苯尼考、環丙沙星、復方新諾明、諾氟沙星、氯霉素抑制。

2.3 YCSC6的16S rRNA基因的同源性比對及系統發育分析

菌株YCSC6的16S rDNA的Genbank注冊號為KU984713.1, 序列長度為1 409 bp。將該菌株的16S rDNA序列在Genbank中進行同源性比較, 可知菌株YCSC6與死谷肋生鹽弧菌亞種(subsp)DSM8285T[25]親緣關系最近(圖3)。

圖3 依據16S rDNA基因序列構建的菌株YCSC6與其他相關細菌的系統發育樹

2.4 共培養下纖毛蟲體的變化

將發酵液與等量纖毛蟲混合后, 立即取0.5 mL于計數框中, 在顯微鏡下可逐漸觀察到纖毛蟲運動明顯變緩慢, 且出現纖毛蟲原地打轉的現象。當培養時間3、6、9、12、24 h后, 纖毛蟲逐漸表現出運動停止、纖毛停止擺動、裂解的現象。且共培養時間越長, 纖毛蟲裂解數量越多, 裂解程度越大, 直至最后蟲體結構完全裂解, 胞質流出。共培養過程中纖毛蟲裂解如下圖(圖4)所示。

掃描電鏡下, 未經共培養的完整蟲體結構如圖5所示, 蟲體表膜結構完整, 表膜無裂解。經過共培養的纖毛蟲結構如圖6所示, 纖毛蟲表膜開始出現裂解現象, 在纖毛蟲的尾端出現穿孔, 纖毛蟲表膜完整性喪失。

圖4 盾纖毛蟲裂解過程圖

2.5 共培養下盾纖毛蟲裂解率

數據統計顯示, 當發酵時間為12 h時, 共培養12 h后, 完整蟲體剩余量為40.4%; 隨發酵時間的延長, 共培養12 h后, 完整蟲體剩余量逐漸減少。最終當發酵時間為60 h時, 共培養12 h后, 盾纖毛蟲的剩余量為0; 而當發酵時間為66 h時, 共培養10 h, 完整蟲體的剩余量就降為0; 當發酵時間為72 h時, 共培養9 h后, 完整蟲體的剩余量就降為0 (圖7)。

圖5 完整盾纖毛蟲掃描電鏡圖

圖6 裂解盾纖毛蟲掃描電鏡圖(箭頭指示裂解處)

圖7 YCSC6的殺蟲活性

上述統計數據表明, 在一定時間范圍內, 隨著發酵時間的延長, 發酵液的裂解能力也隨之增強, 且發酵66 h和72 h的發酵液, 其裂解活性相當。由表2可見: 發酵液的不同發酵時間與共培養液蟲體剩余量呈負相關, 且回歸方程相關系數的絕對值均大于0.8, 說明共培養時間與完整盾纖毛蟲剩余量之間密切相關。

3 討論

微生物代謝產物具有結構新穎性和多樣性的特點, 其在抗菌、殺蟲、抗真菌等各領域得到廣泛的認可并展現出巨大的潛力[26]。然而, 目前在水產動物殺蟲藥物研究開發領域還極少, 本研究從近海微生物菌種資源庫中篩得一株有殺盾纖毛蟲效果的細菌YCSC6, 對該菌株開展了細菌鑒定和殺蟲能力的初步研究, 旨在為防治大菱鲆盾纖毛蟲病開發安全、高效的新型藥物。

表2 YCSC6殺蟲活性的統計學分析

本實驗自黃海分得一株對盾纖毛蟲有明顯裂解作用的海洋細菌YCSC6, 該菌最適生長條件是37℃, pH為6, 鹽度3%, 這與菌株DSM8285T的最適生長條件相近; 該菌菌體彎曲成弧形, 尾部有一長鞭毛, 這一特征與菌株DSM8285T相同。在碳源利用方面, 兩菌均主要利用α-D葡萄糖、D-海藻糖、丙酮酸, 且兩者16S rDNA序列相似度高達99.18%, 系統發育分析也顯示, 菌株YCSC6與肋生鹽弧菌也聚類到同一支上[25], 因而將菌株YCSC6鑒定為肋生鹽弧菌。

通過共培養實驗, 在光學顯微鏡下發現盾纖毛蟲的裂解過程為: 蟲體運動變緩慢, 原地打轉, 3 h后蟲體顯微結構變模糊, 開始出現裂解現象, 隨著作用時間延長, 蟲體表膜裂解程度越大, 胞質流出, 直至最后蟲體結構完全裂解。掃描電鏡可觀察到作用初期纖毛蟲胞膜出現穿孔, 裂解作用開始。姚嘉赟等[26]發現鏈霉菌-XY52代謝產物可導致小瓜蟲胞膜及細胞核破裂; 胡金城[12]發現某些中草藥可完全被破壞纖毛蟲結構, 使胞質流出, 凝固; 田海軍[27]曾報道復方中草藥制劑可導致南美白對蝦()纖毛蟲蟲體結構完全被破壞, 胞質流出, 凝固; 孫裔雷等[28]發現當某些中草藥可損害小瓜蟲()細胞膜完整性, 增加細胞膜通透性。本實驗所研究YCSC6發酵液與上述所研究的中草藥及抗生素作用效果相似, 說明YCSC6發酵液中可能含有某種或某幾種成分, 也具有裂解盾纖毛蟲的作用; 樊海平等[29]發現, 當中草藥質量濃度40 mg/ L以上時, 作用10 min后刺激隱核蟲()幼蟲死亡率大于50%, 作用2 h死亡率為100%, 其中質量濃度200 mg/ L作用1 h的死亡率達100%, 質量濃度400和800 mg/L 2個處理作用10 min的死亡率達100%。本研究在對YCSC6的殺蟲能力進行初步測定后, 發現隨著發酵時間延長, 發酵液的裂解活性增強, 完全裂解蟲體所需要的時間縮短, 但發酵66 h后, 其作用效果無明顯增強。表明隨著細菌的生長繁殖, 其代謝產物中的殺蟲成分不斷積累, 濃度增大, 殺蟲效果增強, 但積累到一定程度不再增加。

本研究初步探究了YCSC6的殺蟲能力及殺蟲機制, 但尚未對其有效成分進行分離鑒定, 因此本研究下一步將重點從有效殺蟲成分提取鑒定及基因組方向深入研究其殺蟲機制, 為大菱鲆盾纖毛蟲病的防治提供新材料。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Identification of marine bacterium YCSC6 and its insecticidal ability against Scuticociliate

DU Guang-xun1, QU Ling-yun1, 2, SHANG Kun1, 3, WANG Chen1, GAO Ping1

(1. First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China; 2.Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266235, China; 3. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

To develop a safe and effective new drug for the prevention and control of turbot scuticociliate disease, from the library of offshore marine microbial resources we screened out a marine bacterium that showed insecticidal activity against scuticociliate. We identified YCSC6 asusing morphological and molecular biological methods. We conducted co-culture pharmacodynamics experiments in which YCSC6 killed pathogenic scuticociliate. We characterized the insecticidal properties of YCSC6 by optical and scanning electron microscopy. The results show that the fermentation supernatant of YCSC6 can lead to membrane perforation inscuticociliate, after which the scuticociliate loses its membrane integrity and cracks. After a certain period of time, the cracking ability strengthens with time. In this research, we made preliminary explorations of the insecticidal characteristics and abilityof YCSC6 and found it to be a safe and effective source for the development of a microbe insecticide for aquaculture.

turbot; scuticociliatlda; YCSC6; lytic process; microbe insecticide

[National Key R & D Program of China, No. 2017YFC1404504; Independent Innovation and Achievement Transformation Project in ShandongProvince, No. 2014ZZCX06205; The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for MarineScience and Technology, No. 2015ASKJ02-03]

Dec. 2, 2016

Q939.99

A

1000-3096(2017)08-0024-08

10.11759//hykx20161202001

2016-12-02;

2017-03-06

十三五海洋環境安全保障重點專項(2017YFC1404504); 山東省自主創新及成果轉化專項(2014ZZCX06205); 青島海洋科學與技術國家實驗室鰲山科技創新計劃(2015ASKJ02-03)

杜光迅(1991-), 男, 山東章丘人, 碩士研究生, 主要從事海洋微生物學研究, 電話: 18954296525, E-mail: 1193892753@qq.com; 曲凌云, 通信作者, 博士, 研究員, 電話: 13407609057, E-mail: qly@fio.org.cn