來源于鹽惰菌屬Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在畢赤酵母中誘導表達及其酶學性質的研究

于成野，韓紅娟，付曉燕，游雙紅，孫 淼，朱恒文，彭日荷，姚泉洪*

（1上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106；2上海海洋大學食品學院，上海 201306）

來源于鹽惰菌屬Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在畢赤酵母中誘導表達及其酶學性質的研究

于成野1，2，韓紅娟1，付曉燕1，游雙紅1，孫 淼1，朱恒文1，2，彭日荷1，姚泉洪1*

（1上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106；2上海海洋大學食品學院，上海 201306）

根據畢赤酵母的密碼子偏愛性和木聚糖酶的蛋白序列設計并合成了木聚糖酶基因片段，與表達載體pYPX88連接，構建成分泌表達載體；構建的分泌表達載體經BglⅡ酶切后電擊轉化到畢赤酵母GS115中，篩選得到陽性克隆。研究了重組木聚糖酶的最適pH、pH穩定性、最適溫度、溫度穩定性以及部分金屬離子、十二烷基硫酸鈉（SDS）和二硫蘇糖醇（DTT）對該酶性質的影響。結果表明：重組木聚糖酶最適pH為6.0，在pH 4.5—8.0時酶學性質穩定；最適溫度為60℃，在20—65℃時酶學性質穩定；金屬離子Mn2+與Cu2+對該酶有抑制作用，化合物DTT對該酶有明顯促進作用。

木聚糖酶；畢赤酵母；酶學性質

木聚糖是半纖維素的主要成分，主鏈由多個D-木糖殘基通過β-1，4糖苷鍵連接而成［1］，在自然界中占植物生物量的20%—40%［2-3］。木聚糖酶作用于木聚糖使其水解為低聚木糖以及木糖［4］。廣義的木聚糖酶主要由 β-1，4-木聚糖內切酶、β-1，4-木聚糖酶和β-1，4-木聚糖外切酶組成［5］。隨著酶產業的發展，木聚糖酶大量用于日常工業生產，在造紙、醫療、釀酒、果蔬加工等行業應用明顯增加［6-7］。傳統工業中如造紙行業的紙漿漂白需大量的化學試劑處理，對環境的危害程度很大且回收利用率低，而木聚糖酶等酶的利用可減少化學試劑的大量使用，進而減少對環境的危害。

自然界中存在多種野生型木聚糖酶產生菌，但大多數木聚糖酶產生菌產率不高，較高的在45 IU/mL左右［8］，且多數酶活很低。本試驗研究的木聚糖酶基因來源于耐鹽菌株Halopiger xanaduensis，該菌是古菌域廣古菌門惰鹽菌屬的原核生物。此類菌株本身利用葡萄糖、半乳糖以及木糖的能力很低，但在其體內卻發現了40余種糖基水解酶以及5種多糖裂解酶。其中木聚糖酶基因就是眾多糖基水解酶基因的一種，但該基因在該物種中的利用率極低，造成了基因的浪費。近年來，有關來源于鹽惰菌屬的木聚糖酶基因的研究未見報道。本試驗擬采用人工合成的方法，根據木聚糖酶的蛋白序列以及畢赤酵母的密碼子偏愛性合成木聚糖酶基因片段，并構建表達載體，在常用外源蛋白表達菌種畢赤酵母［9-10］中表達，研究木聚糖酶蛋白的酶學特性，以期對工業生產有所助益。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、試劑以及主要試驗器材

用于基因表達的畢赤酵母菌株GS115生產于美國Invitrogen公司。表達載體pYPX88（GenBank編號：AY178045）由本實驗室自行設計?？寺≥d體PGEM-t購于Promega公司，限制性內切酶、DNA連接酶、TaqDNA聚合酶購于Takara公司，底物木聚糖由上海生工生物工程有限公司提供，目的蛋白提純所用鎳柱由Sigma公司提供，其他藥品均為分析純級。

1.2 木聚糖酶基因的合成與基因擴增

本研究中木聚糖酶基因來源于菌株Halopiger xanaduensis（GenBank編號：wp_013881271）。根據木聚糖酶的蛋白序列和畢赤酵母的密碼子偏愛性，采用兩步PCR的方法（PTDS法）合成目的基因［11］。首先通過NCBI上公布的Halopiger xanaduensis木聚糖酶基因片段構建多段60 bp左右具有重疊序列的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用該引物合成480 bp左右的中長度片段，再利用中長度片段合成全長目的基因。在其3’端和5’端分別引入Bam HⅠ和Sac lⅠ切點，將合成的基因片段克隆到克隆載體PGEM-t中轉化后測序，將Bam HⅠ和Sac1Ⅰ雙酶切后的質粒通過凝膠電泳回收目的基因片段，把回收的基因片段克隆到表達載體pYPX88中。由于電擊到酵母細胞中需要的質粒濃度較高，所以將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α中富集，在含150μg/mL的卡那霉素LB固體培養基中培養過夜，挑取單菌落于含150μg/mL的卡那霉素LB液體培養基中培養過夜，抽提質粒并用BglⅡ進行酶切鑒定。

1.3 重組質粒的轉化和篩選

通過電擊轉化的方法把重組載體轉化到畢赤酵母菌株GS115中，轉化后的畢赤酵母菌株涂布于SD-山梨醇培養基上［K2HPO4·3H2O 6.6 g/L、KH2PO427 g/L、（NH4）2SO420 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、NaCl 0.4 g/L、CaCl20.3 g/L、硼酸 0.1 g/L、FeCl30.04 g/L、山梨醇 0.5 g/L］28℃培養 72 h。挑取單菌落，劃線于SD培養基中，28℃培養48 h。取pH為5.3的檸檬酸緩沖液、體積濃度為1%的木聚糖溶液、甲醇濃度為1%的BMMY培養基（SD培養基50%，雙蒸水50%）各50μL混合，將預混樣注入40孔板，挑取劃線培養基中單克隆菌落于40孔板中，28℃搖床培養24 h。取出培養液，8 000 r/min離心1 min，取上清，用DNS顯色法進行顯色［12］，上清液與DNS混合，100℃煮沸10 min，混合液顯紅色即為轉化成功的陽性克??；雙蒸水50μL，木聚糖底物100μL，60℃反應10 min后加入150μL的DNS溶液，100℃顯色15 min做為空白對照。

1.4 轉化后陽性克隆的誘導表達

挑取酵母陽性克隆轉化子于50 mL BMGY培養基中（甘油濃度為1%），28℃培養24 h，4℃、8 000 r/min離心8 min，取沉淀用100 mL去離子水重懸，8 000 r/min離心8 min，取沉淀，在100 mL BMMY（甲醇濃度為1%）培養基中誘導72 h，每24 h補充一次甲醇，使甲醇濃度始終為1%。取50 mL誘導液于4℃、8 000 r/min離心15 min，上清即為誘導酶液。

1.5 誘導酶液的去糖基化與純化

糖基化現象在畢赤酵母表達體系中比較常見，酶蛋白分子糖基化會造成SDS-PAGE電泳結果與理論推算酶蛋白分子量值不符且所得蛋白分子量偏大的現象，為了驗證所得蛋白分子量為試驗木聚糖酶蛋白，用去糖基化酶處理酵母誘導表達的酶液。聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）驗證去糖基化與未去糖基化酶液樣本，如有糖基化現象的存在，去糖基化酶處理樣本條帶應低于未處理樣本，電泳過后的凝膠用考馬斯亮藍R-250進行過夜染色（Sangon）。取用SDS-PAGE驗證過的粗酶液，用瓊脂鎳柱（Ni-NTA）進行純化。

1.6 酶活以及酶學特性的測定

木聚糖酶酶活的測定采用DNS顯色法。150μL的反應體系包括50μL酶液和100μL底物（底物為質量濃度為1%的木聚糖溶液），60℃反應10 min后加入150μL DNS溶液，100℃顯色15 min，酶標儀540 nm處測量其OD值，酶活測定方法參考文獻［13-14］。

測定最適 pH與 pH穩定性的緩沖液為：檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 2.0—7.0），Tirs-HCl緩沖液（pH 7.0—9.0），甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0—10.0）。測定的 pH分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。pH穩定性的測定是將酶液在相應的 pH溶液中常溫處理2 h。最適溫度與溫度穩定性的測定選用的溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃。溫度穩定性的測定是在相應的溫度條件下處理酶液2 h，并在最適pH溶液中測定其酶活。

金屬離子及化合物SDS、DTT對酶活性的影響試驗在最適溫度與最適pH的環境下進行。畢赤酵母誘導表達純化后酶液在對應離子溶液中處理12 h，在SDS與DTT溶液中處理12 h。利用處理后酶液與木聚糖底物反應，進行相應酶活測定。測定的金屬離子為 Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Pb2+、Ca2+、K+、Ni2+、Na+、Cr2+、Cu2+、NH4+、Co2+。溶液中金屬離子濃度均為10 mmol/L。將金屬離子溶液置換成水作為對照。

2 結果與分析

2.1 載體構建

根據畢赤酵母密碼子的偏愛性以及Halopiger xanaduensis基因的特點構建木聚糖酶基因序列，連接到克隆載體上。結果表明：目的基因序列正確，經酶切得到的基因片段與表達載體pYPX88連接得到重組質粒；重組質粒經BglⅡ酶切后，電泳所得基因片段長度與預期相符。

2.2 重組質粒陽性克隆的篩選與表達

重組質粒與畢赤酵母感受態細胞電擊轉化后72 h即在SD-山梨醇平板上長出單菌落，利用40孔板法篩選出陽性克隆，用含1%甘油的BMGY培養基富集菌體，利用甲醇在BMMY培養基中誘導表達，DNS顯色為紅色，說明轉化子成功分泌并表達了木聚糖酶蛋白?？瞻讓φ瘴闯霈F顯色反應。試驗成功篩選出8個陽性克隆轉化子，選取紅色最深的單克隆誘導表達木聚糖酶。

2.3 木聚糖酶酶液的SDS-PAGE電泳

取1.4中所述步驟得到的酶液1 mL，利用去糖基化酶對其進行去糖基化，分別取16μL原酶液和去糖基化酶液與4μL Loading Buffer混合，SDS-PAGE電泳2 h，考馬斯亮藍過夜染色，脫色液脫色6 h。酶液經去糖基化酶處理后，蛋白的分子量在45 kD左右（圖1）。

2.4 酶學特性

木聚糖酶最大反應速率為219μmol/（min·mg），純化后酶液濃度為200μg/mL。酶液的Km值為2.2 mol/L。重組木聚糖酶最適pH為6.0，在pH為5.0—8.0時相對酶活達到50%以上，當pH小于3.5或者大于8.5時，酶活較低，且酶活降低速率較快（圖2）。在pH為4.5—8.0的緩沖液中處理酶液2 h后，其殘余酶活仍在85%及以上，說明重組的木聚糖酶具有較好的pH穩定性（圖3）。重組木聚糖酶的最適溫度為60℃（圖4），當溫度低于30℃或者高于80℃時酶活較低。在溫度穩定性方面，酶液在20—65℃處理后，相對殘余酶活為60%以上（圖5）。金屬離子以及部分化合物對酶液的影響中（圖6），大部分離子，如 Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Fe2+、Ni2+、Cr2+、Na+、NH4+，能夠增強重組木聚糖酶的酶活性，而Mn2+、Cu2+對酶有抑制作用，DTT能明顯增強酶活性。

圖1 SDS-PAGE檢測重組木聚糖酶蛋白Fig.1 Detection of recombinant xylanase protein by SDS-PAGE

圖2 重組木聚糖酶的最適pHFig.2 The optimum pH of recombinant xylanase

圖3 重組木聚糖酶的pH穩定性Fig.3 The pH stability of recombinant xylanase

圖4 重組木聚糖酶的最適溫度Fig.4 The optimum tem perature of recombinant

圖5 重組木聚糖酶的溫度穩定性Fig.5 The tem perature stability of recombinant xylanase

圖6 金屬離子及SDS、DTT對重組木聚糖酶活性的影響Fig.6 Effects ofmetal ions and SDS，DTT on the activity of recombinant xylanase

3 結論與討論

自然界中木聚糖酶的來源十分豐富，每種木聚糖酶的酶學性質也不完全相同，不同的行業對其酶學特性也有其特殊的要求。在木聚糖酶的工業應用過程中，高的酶活和水解能力是十分重要的，因此，尋找野生型高產菌株以及通過基因突變等生物技術手段改造木聚糖酶基因越來越受到科研工作者的重視。在產木聚糖酶菌株方面，此前曾有報道在耐熱與低溫菌中尋找到的產木聚糖酶菌株［15-16］，也分別對其酶學特性做了研究，表明木聚糖酶的耐熱與耐低溫多與其來源菌株所處環境相關。

木聚糖酶的活性發揮受到很多金屬離子的影響。本研究表明，Mn2+、Cu2+對該酶有抑制作用，這與Cu2+等離子與酶的反應底物木聚糖發生絡合反應形成絡合物從而使有效底物濃度降低有一定關聯，而多數金屬離子如Cr2+等對酶有促進作用。巰基化合物DTT對該酶有明顯的促進作用，與未添加DTT的反應體系比較，其酶活增強了2.5倍左右。

目前，木聚糖酶作為動物飼料添加劑與食品添加劑主要存在2個方面的問題，即木聚糖酶溫度的穩定性和pH最適范圍。本研究中Halopiger xanaduensis來源的木聚糖酶基因與其他來源的木聚糖酶基因比較有一定優勢。首先，溫度的穩定性較好，在20—65℃均有較高酶活，很好地解決了飼料生產過程中因造粒而產生的高溫影響酶活性的問題。其次，在pH穩定性方面跨度較大，可以適應pH 4.5—9.0的范圍。

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Induced expression of xylanase gene from Halopiger xanaduensis in Pichia pastoris and its enzymatic properties

YU Cheng-ye1，2，HAN Hong-juan1，FU Xiao-yan1，YOU Shuang-hong1，SUN Miao1，ZHU Heng-wen1，2，PENG Ri-he1，YAO Quan-hong1*
（1Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；2College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

The xylanase gene was designed and synthesized according to the codon preference of Pichia pastoris and xylanase protein sequence，which was connected with expression vector pYPX88 and constructed into secretory expression vector.The secretory expression vector was transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation after Bgl IIdigestion，and the positive clones were screened out.The optimum pH，pH stability，optimum temperature and temperature stability of the recombinant xylanase，and the effects of somemetal ions，sodium dodecyl sulfate（SDS），dithiothreitol（DTT）on the properties of the recombinant xylanase were studied.The results showed that the optimum pH of the recombinant xylanase was 6，and the enzyme properties were stable at pH 4.5—8.0；the optimum temperature was 60℃，and the enzyme properties were stable at 20—65℃；the metal ion Mn2+and Cu2+could inhibite the enzyme activity，and DTT coud promote the enzyme activity obviously.

Xylanase；Pichia pastoris；Enzymatic properties

2016-03-28

上海市農業委員會重點項目（No.2011-1-8；2013D-8）

于成野（1991—），男，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。E-mail：yuchengye163＠163.com

*通信作者，E-mail：yaoquanhong777＠163.com，Tel：021-62203180

Q78

A

1000-3924（2017）06-001-05

閆其濤）