馬西替坦片中有關物質的HPLC測定

聶忠莉，王 倩，胡一冰，王曉玲，葉 丁，張 勇，蕭茂玲，郭 瑞

(1.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都克萊蒙醫藥科技有限公司，四川 成都 610041)

馬西替坦片中有關物質的HPLC測定

聶忠莉1，王 倩1，胡一冰1，王曉玲2，葉 丁2，張 勇2，蕭茂玲2，郭 瑞2

(1.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都克萊蒙醫藥科技有限公司，四川 成都 610041)

為測定馬西替坦片中的有關物質，利用高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調至pH值=3.0)為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為220 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min,進樣量10 μL.實驗顯示，在各破壞條件下產生的雜質與主峰以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，雜質MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6檢測限分別為0.019 ng、0.013 ng、0.072 ng、0.108 ng，峰面積與濃度呈良好的線性關系，校正因子都為1.0.結果表明，本方法簡單、準確度高，專屬性強，適用于馬西替坦片中有關物質的測定.

馬西替坦；有關物質；高效液相色譜法

0 引 言

肺動脈高壓，是一種以肺血管阻力升高最終導致右心衰竭的嚴重的癥候群[1].馬西替坦，為美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療肺動脈高壓(PAH)的一類內皮素受體拮抗劑[2].內皮素受體拮抗劑類藥物能使肺動脈松弛、降低肺部血壓[3].臨床實驗證明，馬西替坦的耐藥性和安全性良好，藥物與藥物之間相互作用風險較小，可降低肺動脈高壓(PAH)患者的發病率和死亡率，且主要是通過減緩疾病進展發揮作用[4-5].馬西替坦片為馬西替坦的制劑，而制劑質量標準中有關物質項下主要考慮的雜質為原料在儲存和運輸過程中產生的降解雜質，以及在制劑制備工藝過程與儲存及運輸過程中產生的降解雜質.本研究擬采用高效液相方法，對本品的雜質MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3和MAA6進行分析，并對其進行了方法學驗證，擬對制劑的質量控制提供相應的依據.

1 試藥與儀器

1.1 試 藥

實驗所用試藥包括：馬西替坦對照品(批號，130802)，雜質MAA6-1對照品(批號，MAA6-1-20130601)，雜質MAA6-2對照品(批號，MAA6-2-20130601)，雜質MAA7-3對照品(批號，MAA7-3-20130701)，雜質MAA6對照品(批號，A6-130726)，馬西替坦片(小試3批的批號：140101、140102、140103)，均由成都克萊蒙醫藥科技有限公司提供；馬西替坦片(中試3批批號，140201、140202、140203)，由峨眉山通惠制藥有限公司生產，馬西替坦片(批號，UM 010B0801)，由Actelion Pharmaceuticals，Ltd生產；乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)、三乙胺(分析純)，由天津科密歐公司生產.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：5410/L-2455型高效液相色譜儀(Hitachi HITACHI)，BP 210D型電子天平(Sartorius)，pHS-3C型酸度計(上海佑科).

2 方法與結果

2.1 色譜條件

實驗的色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調至pH值為3.0)為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為220 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min,進樣量10 μL.梯度洗脫程序見表1.

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

取本品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋至每1 mL約含1.0 mg的溶液，超聲15 min，作為供試品溶液.

精密量取供試品溶液適量，加乙腈制成每1 mL中約含1 μg的溶液，作為對照溶液.

精密稱取雜質MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6和馬西替坦對照品適量，用乙腈溶解并稀釋制成每1 mL含各雜質約1.0 μg、含馬西替坦約1.0 mg的混合溶液，作為對照品溶液.

2.3 系統適用性

精密量取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，MAA6-2、MAA6-1、MAA6、MAA7-3和馬西替坦分別依次出峰，各成分峰之間的分離度應符合規定，理論塔板數按馬西替坦主峰計不得低于5 000.

精密量取對照溶液10 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的20%；再精密量取供試液、對照溶液和對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍.

供試品溶液色譜圖中如有與對照品溶液峰保留時間一致的峰，按外標法以峰面積計算，不得過0.1%；其他雜質峰的峰面積不得大于對照液主峰面積的0.1倍(0.1%)，總雜質不得超過0.5%.

2.4 專屬性

精密稱取馬西替坦樣品適量分別進行強酸、強堿、氧化、高溫和光照破壞性實驗.取上述專屬性試驗樣品溶液，分別進樣，測定結果見圖1和表2.

(a)未破壞樣品圖譜

(b)酸破壞樣品圖譜

(c)堿破壞樣品圖譜

(d)氧化破壞樣品圖譜

(e)高溫破壞樣品圖譜

(f)光照破壞試驗圖譜

(g)雜質對照品圖譜

圖1樣品實驗圖譜

從圖1可知，各峰依次為雜質MAA7-8、MAA6-2、MAA6-1、MAA7-6、起始物料C、中間體A6、MAA7-7、MAA7-2、MAA7-3、中間體A5、起始物料A4和馬西替坦。

表2 有關物質專屬性實驗結果

由專屬性實驗結果可知，在各破壞條件下產生的雜質與主峰，以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到1.0000，雜質峰峰純度均達0.99以上，峰的降解平衡在90%～102%之間.實驗結果表明，方法專屬性良好，能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產生的降解產物.

2.5 重復性

取馬西替坦自制片10片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量(相當于馬西替坦10 mg)置10 mL量瓶中，加入雜質貯備液(含雜質約為0.1 mg/mL)各0.1 mL，加乙腈至接近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，同法制備6份樣品.

取上述供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算各雜質的含量，同一樣品連續重復測定6次，各雜質含量的RSD%均小于2.0%，表明方法的重復性良好.

2.6 穩定性

取馬西替坦自制片10片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量(相當于馬西替坦10 mg)，置10 mL量瓶中，加入雜質貯備液(含雜質約為0.1 mg/mL)各0.1 mL，加乙腈至接近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液.

取上述供試品溶液分別于0、2、4、8、24 h分別測定，記錄圖譜，以各成分峰面積計算RSD.實驗結果表明，供試品溶液在室溫下放置24 h，其峰面積和雜質個數均無明顯變化，供試溶液室溫放置24 h穩定.

2.7 檢測限與定量限

取馬西替坦及各已知雜質適量，用乙腈溶解后，分別稀釋制成適宜濃度，分別精密吸取一定量注入液相色譜儀并檢測信號噪音比.檢測結果為：MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6檢測限分別為0.019 ng、0.013 ng、0.108 ng、0.072 ng，定量限分別為0.116 ng、0.052 ng、0.251 ng、0.162 ng.定量限樣重復6次，進樣峰面積RSD分別為2.57%、4.21%、1.70%、3.64%.

2.8 線 性

精密稱取馬西替坦及各雜質適量，用乙腈逐級稀釋，制備系列混合溶液(0.05 μg～1.5 μg/mL)并分別進樣測定，記錄色譜圖，以進樣濃度對峰面積進行線性回歸，求得標準曲線.實驗結果表明，雜質MAA6-1在濃度為0.05～1.5 μg/mL范圍內，進樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線性關系，其線性方程式為，Y=143 655.59x+1 099.39，R2=0.9997，校正因子1.0；雜質MAA6-2在濃度為0.05～1.6 μg/mL范圍內，進樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線性關系，其線性方程式為，Y=146 467.46x-1 067.70，R2=0.9987，校正因子1.0；雜質MAA7-3在濃度為0.06～1.9 μg/mL范圍內，進樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線性關系，其線性方程式為，Y=159 007.60x-587.41，R2=0.9998，校正因子1.0.雜質MAA6在濃度為0.05～1.5 μg/mL范圍內，進樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線性關系，線性方程式為，Y=138 620.14x+510.81，R2=0.9999，校正因子1.0.

2.9 回收率

1)雜質對照溶液的制備.分別取馬西替坦各雜質適量，精密稱定，分別用乙腈配制成每1 mL約含0.1 mg的貯備溶液.

2)對照品溶液的制備.分別取雜質貯備液各0.1 mL，置同一10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液.

3)供試品溶液的制備.取馬西替坦粉末適量(相當于馬西替坦10 mg)，共10份，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，其中1～3號樣品分別加入雜質貯備液0.05 mL(相當于雜質標準限度50%)，4～6號樣分別加入雜質貯備液0.1 mL(相當于雜質標準限度100%)，7～9號樣品分別加入雜質貯備液0.15 mL(相當于雜質標準限度150%)，再分別加入乙腈至近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.

按有關物質檢查色譜條件分別精密吸取上述10 μL進樣，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算各樣品中各雜質的含量和回收率.實驗結果顯示，雜質MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6的平均回收率分別為，102.68%、101.74%、105.47%、104.00%，RSD分別為，1.50%、1.18%、1.51%、1.07%.

實驗結果表明，各雜質的回收率均在100%～110%之間，RSD均小于2.0%.表明本方法回收率良好，準確度符合要求.

2.10 精確度

由不同專業人員在不同日期用不同儀器按重復性試驗測定6份供試液有關物質，記錄色譜圖，計算結果的RSD.實驗結果表明，同一批樣品在不同日期由不同專業人員在不同儀器上測得含量基本一致，RSD%小于2.0%.表明本方法精密度符合要求.

2.11 耐用性

取本品粉末適量，精密稱定，置10ml量瓶中，加入雜質對照品貯備液0.1 mL，加入乙腈至近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，制得供試品溶液.

在變動色譜條件中的流動相pH值、流速、柱溫及不同色譜柱條件下，分別精密量取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察各雜峰之間、雜峰與主峰之間的分離情況及各雜質含量的變化情況，結果見表3.

表3 有關物質耐用性實驗結果

表3結果顯示，在測定條件出現小的變動時，所測定的各雜質含量變化不大，含量的RSD%均小于5.0%.表明本方法的耐用性良好.

2.12 樣品測定

按照上述色譜條件，采用高效液相色譜法對小試和中試各批樣品及對照藥品進行測定，測定結果見表4.

表4 小試、中試樣品及對照藥品檢測結果

結果表明，在3批小試、3批中試樣品中均只檢驗出了降解雜質MAA7-3.

3 結 論

本研究參照《中國藥典》2015年版中藥品質量分析方法驗證指導原則，對該方法進行了方法學驗證.結果表明，方法學驗證項目中各項均符合檢測要求.最終確定馬西替坦片中有關物質檢測條件為：采用高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調至pH值為3.0)為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為220 nm.柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min,進樣量10 μL.實驗結果表明，本方法操作簡便，高效快速，專屬性好，靈敏度高，分離效果好，適用于馬西替坦片中有關物質的檢測.

[1]中國醫學會心血管病學分會，《中華心血管病雜志》編輯委員會.肺動脈高壓篩查診斷與治療專家共識[J].中華心血管病雜志,2007，35(11):979-987.

[2]摘自《丁香園》.FDA批準馬西替坦用于治療肺動脈高血壓[J].上海醫藥,2013，34(21):61-62.

[3]潘曉菲，譚初兵，時麗麗，等.新型肺動脈高壓治療藥物馬西替坦[J].中國新藥雜志,2014，23(1):3-5.

[4]金玉潔，肖桂芝，王文倩，等.新型內皮素受體拮抗劑馬西替坦[J].現代藥物與臨床,2013，28(3):405-407.

[5]趙文麗.馬西替坦Ⅲ期臨床試驗資料表明治療肺動脈高壓有效[J].國際藥學研究雜志，2016，40(6):806-80?.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015.

DeterminationofRelatedSubstancesinMacitentanbyHPLC

NIEZhongli1,WANGQian1,HUYibing1,WANGXiaoling2,YEDing2，ZHANGYong2，XIAOMaoling2，GUORui2

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2.Chengdu Climb Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Chengdu 610041, China)

The paper establishes an HPLC method for the determination of the related substances in macitentan.The silane bonded silica is used as filler,with water(1 000 mL water,with three triethylamine 1ml being added,adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid) as mobile phase A,acetonitrile as mobile phase B,Gradient elution.The detection wavelength is 220 nm.With the flow rate of the mobile phase being 1.0 mL/min and column temperature being 40 ℃,the sample volume is 10 μL.The results show that the separation degree between the main peak and impurity produced in different damaging conditions,as well as that between impurity and impurity is more than 1.5,which means that complete separation can be achieved.The detection limits of impurity MAA6-1，MAA6-2，MAA7-3 and MAA6 are 0.019,0.013,0.072,0.108 ng respectively.There is a good linear relationship between the peak area and the concentration.The correction factor is 1.0.It's concluded that the method mentioned in this paper is simple,accurate,specific enough and suitable for the determination of the related substances in macitentan.

macitentan;related substances;HPLC

TQ460.7+2；O657.7+2

A

1004-5422(2017)04-0342-05

2017-09-24.

聶忠莉(1966 — )，女，副主任藥師，從事藥物制劑與分析研究.