褐藻多糖硫酸酯的結構與生物活性研究*

王 晶 張全斌

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褐藻多糖硫酸酯的結構與生物活性研究*

王 晶1, 2張全斌1, 2①

(1. 中國科學院海洋研究所 海洋生物學重點實驗室, 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室, 青島 266071)

褐藻多糖硫酸酯(fucoidan, FPS)是所有褐藻中所固有的細胞間多糖, 存在于細胞壁基質中。生長于潮間帶、長時間與空氣接觸的褐藻種類中, 如多年生的墨角藻()類, 其褐藻多糖硫酸酯的含量可高達20%; 生長在較深處的海帶()類中含量較低, 約為1%~2%。褐藻多糖硫酸酯是一類獨特的結合有硫酸基的水溶性雜聚糖, 其化學組成和結構非常復雜, 以巖藻糖和硫酸基為主, 隨著褐藻的種類不同還含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性, 目前針對墨角藻、泡葉藻()、鼠尾藻()等褐藻中的褐藻多糖硫酸酯研究較多, 發現其具有免疫調節、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、抗氧化等生物活性。本文主要就褐藻多糖硫酸酯的提取、純化、結構及生物活性等方面研究進行綜述。

褐藻多糖硫酸酯; 結構; 生物活性

褐藻多糖硫酸酯(fucoidan, FPS)是一種含有硫酸基的水溶性雜多糖, 主要存在于褐藻和棘皮動物中, 是一種細胞間多糖, 存在于細胞壁基質中。褐藻多糖硫酸酯的含量隨著藻的種類和生長環境不同而不同, 一般占褐藻的1%~20%(紀明侯, 1997)。不同褐藻來源的褐藻多糖硫酸酯的結構不同, 不過其主要的化學成分類似, 是由巖藻糖和硫酸基組成, 隨著褐藻的種類不同還含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分(Bilan and Usov, 2008)。近年來研究表明褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性, 常見的有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、抗凝血等(Senthilkumar et al., 2013)。由于褐藻多糖硫酸酯的結構和功能密切相關, 因此目前對褐藻多糖硫酸酯的研究主要集中在兩個方面: 其一是闡明褐藻多糖硫酸酯的精細結構, 對其構效關系進行系統研究; 其二是研究褐藻多糖硫酸酯的生物學功能及其機制, 為其在生物醫藥領域的應用奠定基礎。

1 褐藻多糖硫酸酯的提取、純化與分離

1.1 褐藻多糖硫酸酯的提取

褐藻多糖硫酸酯可以用水、稀酸或氯化鈣溶液提取, 向提取液中加入氫氧化鉛、氫氧化鋁、乙醇或季胺鹽類陽離子表面活性劑, 可使褐藻多糖硫酸酯沉淀出來; 為了減少色素、蛋白質等的溶出, 提取之前可以先以高濃度醇類或甲醛溶液處理藻體(紀明侯, 1997)。近年來也陸續有學者采用微波、超聲波以及高分子絮凝沉淀等方法提取褐藻多糖硫酸酯(譚潔怡等, 2006; 劉群和徐中平, 2007)。研究表明, 不同的褐藻多糖硫酸酯提取方法, 不僅影響其產率, 而且對其化學組成和結構也有一定影響, 使闡明同一種屬褐藻來源的褐藻多糖硫酸酯結構更加困難。因此, 我們需要建立一種更加溫和的提取方法, 在較低的溫度、酸度和反應時間下, 提取褐藻多糖硫酸酯, 確保褐藻多糖硫酸酯的結構特異性。不同的提取方法制備褐藻多糖硫酸酯的條件及其化學組成如表1所示。

表1 褐藻多糖硫酸酯的提取條件及化學組成

注: FPS為褐藻多糖硫酸酯(degration fucoidan)。

1.2 褐藻多糖硫酸酯的純化

制備的粗褐藻多糖硫酸酯通常含有部分水溶性褐藻膠、蛋白質、褐藻淀粉、色素等, 需要進一步純化, 常用的純化方法有乙醇重沉淀法和季銨鹽類沉淀法。

乙醇重沉淀法應用得比較多, 用乙醇重沉淀法對從鼠尾藻中提取的硫酸多糖進行純化的步驟如下: 將鼠尾藻硫酸多糖粗產品加水溶解, 再加入乙醇(至含量為30%), 離心取上清液, 然后再加入乙醇(至含量70%)后, 攪拌靜置, 離心取沉淀, 用無水乙醚清洗, 經冷凍干燥即得褐藻多糖硫酸(史永富等, 2009)。季銨鹽類沉淀法是利用陽離子表面活性劑如十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridiniumchloridemonohydrate, CPC)或十六烷基三甲基溴化銨(Cetylpyridiniumchlo-ridemonohydrate, CTAB)能與高分子電解質產生沉淀的性質使褐藻多糖硫酸酯沉淀下來。Anno等(1966)將粗褐藻多糖硫酸酯溶于0.5mol/L KCl或CaCl2溶液中, 加入CPC, 比例為1mg褐藻多糖硫酸酯加2mg CPC。靜置生成沉淀, 離心分離, 溶于2mol/L KCl或CaCl2中, 加入2倍乙醇產生沉淀, 經乙醇、乙醚洗滌, 干燥, 即得純褐藻多糖硫酸酯。Paskins-Hurlburt等(1976)用CTAB純化粗褐藻多糖硫酸酯, 在粗褐藻多糖硫酸酯溶液中依次加入CTAB、4mol/L NaCl和乙醇, 將得到的沉淀再溶于水, 經透析、離心、凍干, 即得純的褐藻多糖硫酸酯。王作蕓和趙學武(1985)采用兩種方法對從銅藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯進行純化, 將制得的粗褐藻多糖硫酸酯20g溶于200mL水中, 攪拌加入80mL 4mol/L的CaCl2, 離心(4000r/min), 棄去沉淀。其上清液分為二份, 一份加乙醇至30%(v/v), 離心棄去沉淀, 在上清液中繼續攪拌加入乙醇至60%(v/v), 離心(4000r/min), 收集沉淀, 用95%乙醇和無水乙醇分別洗滌二次后, 烘干得褐藻多糖硫酸酯3.81g。粗褐藻多糖硫酸酯的含巖藻糖為18.5%, 提純后含巖藻糖為44.7%, 按巖藻糖計算, 回收率為92.1%。另一份上清液加50mL5% CPC, 形成白色沉淀物, 離心后棄去上清液, 用25mL 0.5mol/L的CaCl2洗滌沉淀, 然后加150mL 3mol/L的CaCl2, 離心(3000r/min), 將上部白色膠狀物取走, 小心傾倒出中部溶液, 在中部溶液中加入300mL 90%乙醇, 離心棄去上清液, 用CaCl2重新溶解, 再加乙醇60%(v/v)處理兩次, 最后沉淀物用95%乙醇和無水乙醇洗滌, 干燥得褐藻多糖硫酸酯1.56g, 含巖褐糖47.2%, 按巖藻糖計算其回收率為39.8%?？梢? 這兩種方法對褐藻多糖硫酸酯純化效果都非常好, 只是CPC沉淀法的回收率只有乙醇沉淀法的一半。

此外, 在提取和純化過程中, 可采取酶消化法除去混雜在提取液中的褐藻淀粉和蛋白質。Fleury和Lahaye等(1993)在研究法國褐藻膠工業的副產品時就采用葡聚糖酶和堿性蛋白酶來清除其中的褐藻淀粉和蛋白質。

1.3 褐藻多糖硫酸酯的分級

由于褐藻多糖硫酸酯化學組分相當復雜, 對制備出的粗褐藻多糖硫酸酯的色譜和電泳檢查一般都呈現不均一性, 因此人們逐步使用分級方法將混雜的多糖分成不同級分以進行深入研究。常用的分級方法有兩種: 一種是乙醇分級沉淀法, 即利用不同的乙醇濃度沉淀出不同的級分; 另一種是色譜法, 利用凝膠過濾色譜和離子交換色譜進行分級。凝膠過濾色譜法將多糖按照分子量大小進行分級, 離子交換色譜法則能將多糖分成荷電性不同的級分。

Larsen等(1966)從泡葉藻的堿提取液中加鈣鹽除去褐藻膠之后, 用乙醇分級沉淀, 分離出至少三種褐藻多糖硫酸酯, 分別皆含有不同量的褐藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、硫酸基和蛋白質, 其中主要部分(占干藻重的6%)為泡葉藻糖膠(ascophyllan), 大約含褐藻糖25%、木糖26%、糖醛酸鈉19%、硫酸基13%和蛋白質12%。

史永富等(2009)將鼠尾藻中褐藻多糖硫酸酯經DEAE-52陰離子纖維素交換層析分級得到F1、F2、F3、F4、F5五個組分, 硫酸根占比分別為0、3.94%、6.57%、12.60%、38.08%。將含有硫酸根的組分F2、F3、F4、F5分別經SephadexG-200凝膠柱層析分級純化后得到f1、f2、f3、f4、f5、f6六個級分, 其中f2、f4為大分子質量凝聚體, f1、f3、f5、f6相對分子質量分別為4.05×104、7.13×104、1.325×105和7.99×104。Dillon等(1953)將多囊墨角藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯用DEAE-纖維素柱進行分級, 分離出少量木聚糖, 同時還得到含有褐藻糖和少量半乳糖的組分。Li等(2006)先用DEAE-Sepharose CL-6B對從羊棲菜()中提取的褐藻多糖硫酸酯進行分級, 用不同濃度的NaCl進行梯度洗脫, 得到3個組分, 其中得率最高的組分F3又用Sepharose CL-6B進行二次分級得到三個組分, 這些組分的主要成分都是褐藻糖、甘露糖和半乳糖, 以及硫酸根、糖醛酸和少量蛋白質。瓊脂糖凝膠電泳顯示這些組分都只有一個條帶, 是單一組分。Wang等(2008)用DEAE-Sepharose FF對從海帶中提取的褐藻多糖硫酸酯進行分級, 用不同濃度的NaCl進行梯度洗脫, 得到F1、F2和F3三個組分, 其中F1糖醛酸含量最多、硫酸基最少, F3硫酸基含量最多。從單糖組成來看, F1含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖等多種單糖; F2主要由巖藻糖和半乳糖組成, 巖藻糖含量是半乳糖的3倍; 而F3主要由巖藻糖和半乳糖組成, 半乳糖含量是巖藻糖的3倍。

對多糖的分級已經是多糖研究中必不可少的手段, 分級的方法越來越多, 分離效果也越來越好, 為結構和構效關系的研究奠定了基礎。

2 褐藻多糖硫酸酯的結構

2.1 褐藻多糖硫酸酯的化學組分

1913年, Kylin首次從褐藻掌狀海帶()中用稀酸提取出一種多糖, 經水解后以苯腙分離出甲基戊糖, 確定為L-fucoidan(褐藻糖或巖藻糖)。隨著人們對這類化合物的深入研究, 了解了其化學成分和結構的復雜性, 得知褐藻多糖硫酸酯并非為單一結構的化合物, 而是具有不同化學組分的一族化合物。Bird和Haas(1931)也對該藻的水提取、酒精沉淀物進行了研究, 產物的灰分為26%~30%, 灰分中硫酸根為17%~19%, 水解后, 總SO4為35.5%~37.7%, 甲基戊糖為33%~37%; 他們提出褐藻多糖硫酸酯的分子式為(RR′O×SO2×OM)n, 其中R為褐藻糖(C6H10O4), R′為未知物, M可能是Na、K、Ca0.5或Mg0.5等金屬離子。Schweiger(1962)從巨藻的分泌物中經分離、提純得到一種多糖, 稱之為半乳糖-褐藻糖膠(galactofucan)。褐藻糖和半乳糖之比, 經數次提純后一直恒定在18︰1, 其中還含有木糖, 變化范圍為0.5%~2.5%。于是, 他首次提出, 褐藻多糖硫酸酯并非純的硫酸褐藻多糖(fucan sulfate), 而是由褐藻糖、半乳糖和微量木糖組成的雜聚物, 即木糖-半乳糖-褐藻糖膠(xylogalactofucan)。Marais和Joseleau(2001)從泡葉藻中提取出的褐藻多糖硫酸酯的組成為褐藻糖66%、木糖3%、硫酸根31%(摩爾百分數)。Bilan等(2007)從太平洋采集了褐藻, 用2% CaCl2水溶液在85°C提取5h, 提取液除去褐藻膠, 用乙醇沉淀得粗褐藻多糖硫酸酯, 其組成為褐藻糖39.0%、硫酸根18.4%、半乳糖7.0%、木糖3.4%、葡萄糖2.1%、甘露糖1.6%。Li等(2006)用水提醇沉的方法提取了羊棲菜中的褐藻多糖硫酸酯, 該多糖主要由褐藻糖、硫酸根和糖醛酸組成, 中性單糖主要為褐藻糖、甘露糖和半乳糖, 還有少量的木糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖。Zhang等(2009)用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)的方法測定了從海帶中提取出的褐藻多糖硫酸酯單糖的組成, 褐藻多糖硫酸酯經2mol/L的三氟乙酸水解后, 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)柱前衍生化的方法, 在245nm處測定, 其單糖組成為褐藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖和葡萄糖。

大量文獻表明, 褐藻多糖硫酸酯的組成復雜, 并非由均一的褐藻糖和硫酸根組成, 由不同褐藻得到的褐藻多糖硫酸酯的化學組成有很大差異, 除含有褐藻糖和硫酸基外, 還含有半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖等多種單糖。常見褐藻中中性單糖的含量如表2所示。

表2 幾種褐藻多糖硫酸酯中性單糖的含量

注: Fuc. 褐藻糖; Gal. 半乳糖; Man. 甘露糖; Rha. 鼠李糖; Xyl. 木糖; Ara. 阿拉伯糖; Glc. 葡萄糖; “---”表示“無”。

2.2 褐藻多糖硫酸酯的結構

由于褐藻多糖硫酸酯化學組分復雜、分子量較高, 其結構研究進展十分緩慢。褐藻多糖硫酸酯的主要來源為棘皮動物()和褐藻, 其結構隨著來源的不同有較大的差異。一般來說, 來源于棘皮動物的褐藻多糖硫酸酯結構比較簡單, 多為線性分子, 硫酸根的連接方式也比較有規律; 而來源于褐藻中的褐藻多糖硫酸酯多有支鏈結構, 單糖的種類和硫酸根的連接方式也比較復雜(Pereira et al., 1999)。

Pereira等(1999)運用化學分析和波譜分析的方法, 對從棘皮動物海參和海膽、中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構進行了細致的研究。這些多糖都是以(1→3)連接的α-L-褐藻糖為基本骨架, 硫酸根主要取代在2位或(和)4位上, 每四個糖單元構成一個重復單元(Pereira et al., 1999)。從海膽和卵層膠膜中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構各有兩種, 前者的結構與的相同, 由四個單糖構成一個重復單元, 而后者由三個單糖構成一個重復單元(Vilela-Silva et al., 2002)(圖1、圖2)。

近年來, 科學家對從墨角藻中提取的褐藻多糖硫酸酯進行了深入研究。Conchie 和Percival(1950)將從墨角藻制取的褐藻多糖硫酸酯(褐藻糖38%, SO432.8%)進行甲基化和水解, 得到L-褐藻糖、3-O-甲基-L-褐藻糖和2,3-二-O-甲基-L-褐藻糖, 其摩爾比為1︰3︰1。由旋光性推測褐藻糖均為α構型。有些褐藻多糖硫酸酯可能帶有兩個硫酸基, 而另一些(C1, 4連接)則未被硫酸基取代; 游離褐藻糖是來自C3上結合的末端分枝點單位。由此看來, 褐藻多糖硫酸酯的主要組成單位是1,2-α-L-褐藻糖, C4上帶有硫酸基(圖3)。

1993年, Patankar等(1993)對Conchie等人的結構模型進行了修正, 提出褐藻多糖硫酸酯的骨架結構由(1→3)連接的α-L-褐藻糖組成, 硫酸根主要取代在C4位上, 同時, 每2~3個褐藻糖殘基就有一個由褐藻糖組成的支鏈(圖4)。

Bilan等(2002)先后對不同墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯的結構進行了研究。從枯墨角藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯中L-褐藻糖、硫酸根和乙?；哪柋葹?︰1.23︰0.36, 該多糖主鏈由(1→3)和(1→4)連接的α-L-褐藻糖組成, 硫酸根主要連接在C2位上, 少量連接在3-連接的褐藻糖的C4位上, 乙?；S機連接在褐藻糖剩余的羥基上(圖5)。

圖1 從不同海膽(Echinoidea)中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構(Vilela-Silva et al., 2002)

注: a. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯成分I; b. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯成分II; c. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯; d. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯成分I; e. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯成分II; f. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯; g. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯; h. 從.中提取的褐藻多糖硫酸酯。

圖2 從海參(Holothuroidea)中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構(Pereira et al., 1999)

圖3 從墨角藻(Fucales)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Conchie and Percival, 1950)

圖4 從墨角藻(Fucales)提取的褐藻多糖硫酸酯的修訂后結構模型(Patankar et al., 1993)

圖5 從枯墨角藻(Fucus evanescens)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Bilan et al., 2002)

從兩列墨角藻()提取的褐藻多糖硫酸酯的一個組分中L-褐藻糖、硫酸根和乙?；哪柋葹?︰1.21︰0.08, 從一維和二維的核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)分析可知該多糖的主鏈由C2, 4位硫酸根取代的(1→3)連接的α-L-褐藻糖和C2位硫酸根取代的(1→4)連接的α-L-褐藻糖交替連接的二糖重復單元組成, 每隔一定的重復單元出現乙?；〈摩?L-褐藻糖(Bilan et al., 2004)(圖6)。該結構與枯墨角藻模型十分相近。

圖6 從兩列墨角藻(Fucus distichus)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Bilan et al., 2004)

從齒緣墨角藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯的一個組分中L-褐藻糖、硫酸根和乙?；哪柋葹?︰1︰0.1, 此外還含有少量木糖和半乳糖。該多糖的結構較枯墨角藻和兩列墨角藻更為復雜, 雖然主鏈也是由(1→3)和(1→4)交替連接的α-L-褐藻糖組成, 但它還含有由3個褐藻糖殘基組成的支鏈, 末端可能是4-硫酸根或2, 4-二硫酸根取代的褐藻糖(Bilan et al., 2006)(圖7)。

圖7 從齒緣墨角藻(Fucus serratus)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Bilan et al., 2006)

注: 以a和b指代兩種不同的主鏈結構; (a) (about 50%): R1= SO3–, R2= H, (b) (about 50%): R1= H, R2= α-L-Fucp-(1→4)- α-L-Fucp(2SO3)-(1→3)-α-L-Fucp(2SO3)-(1→。

研究發現, 不同褐藻來源的褐藻多糖硫酸酯的結構并不完全相同。對從粉團扇藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構研究表明, 該多糖含有(1→4)連接的β-D-葡萄糖醛酸、(1→4)連接的β-D-葡萄糖、(1→4)連接的β-D-甘露糖、(1→4)連接的β-D-半乳糖及(1→2)連接的α-L-褐藻糖等多種殘基(Hussein et al., 1980)。Checolot等(2001)采用甲基化分析和NMR的方法對從泡葉藻中提取的褐藻多糖硫酸酯的酸水解產物——低分子量褐藻多糖硫酸酯的結構進行了研究, 結果表明該多糖的主鏈含有大量(1→4)連接的α-L-褐藻糖, 硫酸根主要連接在C2位, 少量連接在C3位, 極少連接在C4位, 同時, 首次發現了C2, 3雙取代的褐藻糖(圖8)。與Patankar等(1993)報道的墨角藻的結構有很大差別。

Periera等(1999)對從巴西海帶()中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構與抗凝血活性進行了研究。從NMR分析結果看, 巴西海帶褐藻多糖硫酸酯在巖藻糖異頭碳的位置出現5個峰, 表明其為雜聚多糖, 由于NMR譜的復雜性, 不能確定其結構。但從NMR分析結果看, 巴西海帶褐藻多糖硫酸酯與墨角藻、泡葉藻褐藻多糖硫酸酯的結構有很大差異, 前者中存在(1→2)連接的糖苷鍵, 而且4-O-硫酸化程度很高, 而后者主鏈已被確定為(1→3)連接。同時他們的研究顯示巴西海帶褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性明顯高于泡葉藻或墨角藻的褐藻多糖硫酸酯, 這表明海帶屬中褐藻多糖硫酸酯結構的獨特性與其生物活性密切相關。

圖8 從泡葉藻(Ascophyllum nodosum)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Checolot et al., 2001)

Rocha等(2005)研究了從施氏褐舌藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構, 該多糖的分子量為215000Da, 褐藻糖、木糖、半乳糖及硫酸根的摩爾比為1.0︰0.5︰2.0︰2.0, 此外還含有少量的糖醛酸?；瘜W分析、甲基化分析和NMR分析的結果表明該多糖擁有一種特殊的結構, 主鏈由4-連接的β-D-半乳糖構成, 硫酸根取代在C3位上, 約有25%的糖殘基含有支鏈, 支鏈由α-L-褐藻糖(C3被硫酸根取代)或者是二個非硫酸根取代的4-連接的β-D-木糖組成(圖9)。

圖9 從施氏褐舌藻(Spatoglossum schroederi)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Rocha et al., 2005)

Chizhov等(1999)通過化學分析和波譜分析的方法對從繩藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯分級組分的結構進行了研究。該多糖的一個組分的單糖全部由褐藻糖組成, 其骨架結構為(1→3)連接的α-L-褐藻糖組成, 含有很多支鏈, 支鏈由1-連接的褐藻糖組成, 硫酸根主要連接在C4位, 少量連接在C2位(圖10)。

從羊棲菜()中提取的褐藻多糖硫酸酯的結構非常復雜。Shiroma等(2008)對此進行了研究。經過DEAE-Sepharose分級后, 組分F4含有較高的褐藻糖(31.9%)和硫酸根(38.0%), 單糖的種類也大大減少, 只有褐藻糖和半乳糖。該多糖的主鏈主要由(1→3)連接的α-L-褐藻糖構成, 每4個褐藻糖殘基含有一個支鏈, 支鏈由2個褐藻糖或半乳糖的殘基組成, 硫酸根的連接位置沒有確定(圖11)。

圖10 從繩藻(Chorda filum)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Chizhov et al., 1999)

Li等(2006)用熱水提取的方法從羊棲菜()中提取出了褐藻多糖硫酸酯, 經過DEAE-Sepharose-CL-6B和Sepharose- CL-6B柱層析分級, 對得到的一個組分F32利用甲基化分析和NMR進行結構鑒定。F32含有的中性單糖種類多, 主要為褐藻糖、甘露糖和半乳糖, 還含有少量的木糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖。F32含有多個支鏈結構, 具體如圖12所示?？梢姴煌驐撕衷宥嗵橇蛩狨サ慕M分在結構上有很大差異。

圖11 羊棲菜(Hizikia fusiforme)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Shiroma et al., 2008)

注: R為α-L-Fuc-(1→4)- α-L-Fuc-(1→(50%)或α-L-Gal-(1→4)- α-D-Gal-(1→(50%)。

圖12 從羊棲菜(Hizikia fusiforme)提取的褐藻多糖硫酸酯的結構模型(Li et al., 2006)

本文作者利用弱的陰離子交換樹脂對低分子量褐藻多糖硫酸酯DFPS進行分級純化, 得到分級組分DF1、DF2、DF3(Wang et al., 2010)。結合化學分析和波譜分析的方法對DF2的結構進行了鑒定, 發現其主要由(1→3)連接的褐藻糖組成, 還有少量的(1→4)連接的褐藻糖, 每四個糖單位就有一個支鏈, 支鏈由褐藻糖或(1→6)鏈接的半乳糖組成, 硫酸根的連接方式不均一, 分別連接在褐藻糖的2或4位, 或者半乳糖的3、4位, 有些雙取代(圖13)。Jin等(2012)對DF1組分結構進行了研究, 發現其主鏈以2-連接甘露糖和4-連接葡萄糖醛酸交替連接組成, 同時在2-連接甘露糖的C6位有部分硫酸化, 在C3位有部分巖藻糖基化。

圖13 海帶中褐藻多糖硫酸酯組分DF2的結構推測(Wang et al., 2010)

Thanh等(2013)使用電噴霧離子化質譜(electrospray ionisation mass spectrometry, ESI-MS)方法對從褐藻中制備的褐藻多糖硫酸酯的結構進行了研究, 其主鏈由1-3-α-L-Fucp構成, 支鏈→4)-Galp(1→鏈接在巖藻糖的4位上, 硫酸基取代在巖藻糖的2位或半乳糖的4位上(圖14)。

Usoltseva等(2016)對褐藻和中制備的褐藻多糖硫酸酯的結構進行了比較研究, 它們的主鏈結構相似, 都是由→3)-α-L-Fuc-(2,4-O3?)-(1→構成, 但是支鏈結構不同, 從制備的褐藻多糖硫酸酯中發現了HexA-(1→2)-Fuc、HexA-(1→2)-Gal、Gal- (1→4)-HexA、Fuc-(1→2)-Gal-6-SO3?、Fuc-4- SO3?-(1→6)-Gal、Gal-(1→2)-Gal-2-SO3?、Gal- 4-SO3?-(1→6)-Gal, Gal-4-SO3?-(1→3)-Fuc-(1→3)- Fuc、Fuc-4-SO3?-(1→6)-Gal- (1→4)-Gal, Gal- (1→4)-Gal-(1→3)-Fuc、Gal-2-SO3?-(1→4)-Gal-(1→4)-Gal, Gal-(1→4)-Gal-6-SO3?-(1→2)-Gal等支鏈結構。

近年來, 隨著多維核磁共振技術的發展和高分辨質譜在多糖結構分析中的應用, 以及褐藻多糖硫酸酯特異性酶的發現, 褐藻多糖硫酸酯的結構研究有了很大進展, 但是, 對很多不同來源的褐藻多糖硫酸酯的結構還沒有完全明確。褐藻多糖硫酸酯在很多方面有較強的生物活性, 為了更好地開展應用, 必須加快其結構方面的研究。

圖14 Turbinaria ornata中褐藻多糖硫酸酯的結構(Thanh et al., 2013)

注: a~d代表不同的結構; F. 巖藻糖; G. 半乳糖; 主鏈1-3鏈接, 支鏈1-4鏈接; 硫酸基:巖藻糖或者半乳糖的C2 和/或 C4殘基上

3 褐藻多糖硫酸酯的生物活性

3.1 抗凝血活性

褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性是研究最早、最廣泛的生物活性。褐藻多糖硫酸酯具有跟肝素類似的抗凝血活性, 通過直接作用于凝血酶或激活凝血酶抑制因子阻礙了凝血酶原(Ⅱa因子)和Ⅹa因子的產生, 并通過肝素輔助因子Ⅱ(HCⅡ)而不是抗凝血酶Ⅲ較緩慢地抑制Ⅹa因子的活性(Chen et al., 2012)。褐藻多糖硫酸酯對纖溶系統也有影響, 能夠加強組纖溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)對纖溶酶原的活化, 增加纖溶酶的產生(Grauffel et al., 1989)。墨角藻和水云()中的褐藻多糖硫酸酯還對血小板聚集具有明顯的抑制效果(Ustyuzhanina et al., 2013)。

隨著對抗凝作用的深入研究, 人們發現不同褐藻來源的褐藻多糖硫酸酯由于其結構不同, 抗凝血活性也不同。多糖的分子量、單糖組成、硫酸根的含量和取代位置對抗凝血活性有顯著影響(Nishino and Nagumo, 1992; Chevolot et al., 1999; Chandía and Matsuhiro, 2007)。一般來說, 隨著分子量和硫酸根含量的增加, 抗凝血活性增強, 但是分子量太大其抗凝血活性反而下降。對從海帶中提取出的褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性研究表明, 分子量在8000Da的樣品的抗凝血活性最強。褐藻多糖硫酸酯分子量對抗凝血活性的影響要比硫酸根含量的影響更大, 其抗凝血活性隨著分子量的降低而顯著降低。褐藻多糖硫酸酯達到抗凝劑活性則需要相當大分子量的糖鏈才能與凝血酶(血流中的凝結蛋白)相結合。Senthilkumar等(2013)證實褐藻多糖硫酸酯的分子量在近似于100kDa時, 能夠具有一定的抗凝性, 且其抗凝血活性與抗凝血酶和肝素輔酶2有關。肝素能夠刺激肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)的釋放, 促進組織再生, 具有十分高效的抗凝血活性, 是一種廣泛應用的抗凝劑。對于分子量相近的褐藻多糖硫酸脂, 硫酸根含量越高則抗凝血活性越高(趙雪等, 2007)。Haroun-Bouhedja等(2000)研究發現從泡葉藻中提取的褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性與硫酸基的取代度有關, 雙硫酸根取代能增強抗凝血活性。從墨角藻中提取的褐藻多糖硫酸酯經過氨基化修飾后可以有效激活血纖維蛋白溶酶原, 從而促進血凝物的溶解(Soeda et al., 1994), 可見不同的取代基團對抗凝血活性有一定影響。Jin等(2013a)對11種褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性進行了研究, 結果表明樣品Y5~Y11的分子量從大到小為50.1kDa ~8.4kDa, 隨著分子量的降低其活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)和凝血酶時間 (thrombin time, TT)活性也逐漸降低且有濃度依賴性, 樣品Y1~Y4不僅分子量不同而且巖藻糖和半乳糖的比值也不同, 其抗凝血活性更為復雜, 這說明不僅分子量對生物活性有影響, 巖藻糖和半乳糖的比值對生物活性也有一定影響。Zhang等(2014)對從墨角藻中制備的褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性的構效關系進行了研究, 討論了電荷密度、分子量和單糖組成對抗凝血的活性影響。當褐藻多糖硫酸酯每個糖單元含有0.5個硫酸基、且含有大于70個糖單元時可以通過改善血漿中IX凝血因子不足起到抗凝血作用。為了探討抗凝機理, Pereira等(1999)對不同來源的褐藻多糖硫酸酯的抗凝血活性進行了比較, 從褐藻中提取的帶有支鏈的褐藻多糖硫酸酯直接具有抗凝血活性, 然而從棘皮動物中提取的線性褐藻多糖硫酸酯抗凝血作用的發揮需要有肝素介導因子Ⅱ存在, 由此可知, 多糖的空間結構對抗凝血的作用機制也有一定影響。

3.2 抗腫瘤作用

褐藻多糖硫酸酯具有直接的抗腫瘤作用。褐藻多糖硫酸酯能明顯抑制小鼠S180實體瘤的生長, 延長腫瘤負荷鼠的生存期, 且呈現劑量相關性, 其抑瘤率達到環磷酰胺陽性對照的70.4%~78.2%。但是它對體外培養的A549細胞、HeLa細胞和L1210細胞的生長均無顯著抑制作用, 這說明褐藻多糖硫酸酯的抗腫瘤作用不是通過細胞毒作用實現。褐藻多糖硫酸酯中劑量組和大劑量組能顯著提高碳粒廓清實驗中的廓清指數K、吞噬指數α和脾臟器指數, 推測其抗腫瘤機制可能是通過對免疫功能的增強來實現的(王君和胡霞敏, 2009)。Nagamine等(2009)研究了褐藻多糖硫酸酯對Huh7肝癌細胞的抑制作用并探討了其作用機制。MTT法結果顯示褐藻多糖硫酸酯能明顯抑制Huh7的生長, 且與濃度成正相關性, 其半數抑制率為2.0mg/mL。蛋白質印跡結果表明褐藻多糖硫酸酯處理的Huh7細胞的培養基中α-胎蛋白的含量下降, 在1.0mg/mL褐藻多糖硫酸酯作用下, Huh7細胞中趨化因子配體12 mRNA表達顯著下調, 而趨化因子受體4的表達不受影響, 他們認為褐藻多糖硫酸酯的抗腫瘤活性是通過下調趨化因子配體12 mRNA的表達所實現。劉秋英等(2004)研究了從半葉馬尾藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯對抑癌基因p53和Rb的影響。他們將濃度分別為50、100和200mg/kg的褐藻多糖硫酸酯經腹腔注射入S180肉瘤小鼠體內, 連續10天, 抑瘤率分別為30.5%、47.6%和63.5%。用逆轉錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)分析抑癌基因p53和Rb中mRNA的含量, 并用Western-blotting檢測p53和Rb中蛋白質的表達水平發現, 褐藻多糖硫酸酯可上調抑癌基因p53和Rb中mRNA的表達以及增加p53和Rb中蛋白質的含量。他們認為褐藻多糖硫酸酯通過上調抑癌基因的表達起到一定的抑瘤作用。褐藻多糖硫酸酯的抗腫瘤活性可能還和它的分子量以及硫酸根含量有關。Boo等(2011)發現褐藻多糖硫酸酯能引起人肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HT-29和HCT116的凋亡, 使其活細胞數量急劇減少, 并且褐藻多糖硫酸酯的這種促細胞凋亡作用呈現出一種劑量相關性。Lee等(2012)發現褐藻多糖硫酸酯能夠通過調控PI3K-Akt-mTOR和NF-kB信號通路抑制MMP-2、MMP-9的活性, 下調癌細胞的遷移和侵蝕水平, 進而抑制人肺癌細胞的新陳代謝。Ye等(2008)對從馬尾藻()中提取的褐藻多糖硫酸酯分級組分的抗腫瘤活性進行了研究, 發現低分子量、高硫酸根含量的組分SP3-1和SP3-2對HepG2、A549和MGC-803細胞有顯著的抑制活性。

裙帶菜()中的褐藻多糖硫酸酯能夠通過增加活性氧產物, 引發線粒體氧化性損傷, 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)去極化和細胞色素C的釋放, 下調凋亡抑制蛋白的水平, 激活caspase-3和caspase-9, 誘發活性氧介導的線粒體通路, 進而引起肝癌細胞凋亡, 這揭示了由線粒體介導的通路可能在由褐藻多糖硫酸酯引發的細胞凋亡中起到了重要作用(Yang et al., 2013)。Zhang等(2011)還發現褐藻多糖硫酸酯誘發的細胞凋亡伴隨著胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)活性的降低, ERK通路是細胞凋亡的主要調節子, 而褐藻多糖硫酸酯能夠引發MCF-7細胞中ERK的磷酸化。

褐藻多糖硫酸酯不僅對腫瘤有治療作用, 也可以從一定程度上抑制腫瘤的形成。Gamal-Eldeen等(2009)研究了長角馬尾藻()中不同分級組分的褐藻多糖硫酸酯的癌癥化學預防活性。組分E1和E4具有較好的腫瘤形成抑制活性, 它們可以保護性地調控癌癥誘導因子的新陳代謝, 抑制癌癥誘導因子激活細胞色素P450, 同時提高癌癥誘導因子脫毒酶谷胱甘肽S-轉移酶的活性, 從而表現出很好的癌癥化學預防活性。另外, 褐藻多糖硫酸酯在對癌細胞產生抑制作用的同時不影響正常細胞的生長增殖(Senthilkumar et al., 2013)。因此, 褐藻多糖硫酸酯可作為一種無毒副作用的化合物, 用于腫瘤預防和化學治療領域。

3.3 免疫調節活性

褐藻多糖硫酸酯的免疫調節活性是通過對免疫細胞的調控實現的。從馬尾藻中提取的褐藻多糖硫酸酯的免疫促進作用與劑量有密切關系。以不同的劑量喂養小鼠, 當劑量為20、40和60mg/kg·d時, 使小鼠脾的重量顯著增加; 當多糖劑量為40、60mg/kg·d時, 使小鼠腋下淋巴結的重量顯著增加, 對單核巨噬細胞的吞噬功能加強有顯著影響, 能明顯提高小鼠碳粒廓清速率和吞噬指數α, 并對巨噬細胞增生以及淋巴小結形成有明顯作用; 當多糖劑量為60mg/kg·d時, 對肝增重的效果也達到顯著水平(王士長等, 2006)。

樹狀細胞是一種重要的抗原提示細胞, Kim等(2007)研究了褐藻多糖硫酸酯對樹狀細胞(dendritic cells, DCs)的免疫調節作用。從墨角藻中提取的褐藻多糖硫酸酯能提高DCs細胞的活力, 增加白介素-12和腫瘤壞死因子α的產量, 以及提高主要的組織相容性細胞classⅠ、classⅡ、CD54和CD86的表達, 同時可以延長脾細胞中同種抗原壽命。他們認為對DCs細胞進行免疫調節的其中一種途徑至少包含多顯性轉錄核因子(NF-kappa B)。

褐藻多糖硫酸酯的免疫調節活性與褐藻多糖硫酸酯的物理性質有一定關系。將褐藻多糖硫酸酯做成被卵磷脂包裹的納米微球與免疫細胞連接, 可以提高人體B細胞和T細胞的增長速度, 改善白介素-6的分泌情況, 比單純用褐藻多糖硫酸酯效果好, 這可能和褐藻多糖硫酸酯納米微球更容易被吸收有關。且T細胞在褐藻多糖硫酸酯納米微球的濃度為0.6mg/mL時的生長狀況好于1.0mg/mL, 這說明0.6mg/mL是T細胞生長的最佳濃度(Qadir et al., 2008)。

近年來, 褐藻多糖硫酸酯提取物被廣泛應用于臨床試驗中, 有研究發現, 口服褐藻多糖硫酸酯提取物溶液1.5至4個月可以增加乳腺癌病患者血液中IL-12、干擾素γ和TNF-α的水平(Zhang et al., 2011)。這些因子參與免疫調節過程, 說明褐藻多糖硫酸酯具有明顯的免疫調節活性。

食用褐藻中的褐藻多糖硫酸酯可通過直接抑制病毒復制和刺激免疫系統功能對機體起到一定的保護作用, 還可以通過修飾細胞表面來激發人體內的免疫功能。褐藻多糖硫酸酯還能促進肝臟淋巴細胞和外周巨噬細胞的有絲分裂, 形成免疫保護。在自然殺傷細胞中, 褐藻多糖硫酸酯能夠顯著增強細胞溶解和有絲分裂的活性, 能誘導單核細胞來源的樹突細胞的成熟, 并與其他細胞因子和T細胞介導的免疫應答協同作用激活人體免疫功能(Yang et al., 2008)。Lee等(2012)證實了褐藻多糖硫酸酯能通過調控PI3K-Akt-mTOR和NF-kB信號通路抑制MMP-2/-9的活性, 抑制人肺癌細胞的新陳代謝, 下調癌細胞的遷移和侵蝕水平, 誘導內皮祖細胞向基底膜等類似結構的增殖、遷移和分化, 改善基底膜結構, 對糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)等與基底膜相關的疾病有一定的影響。

3.4 抗病毒活性

關于褐藻多糖硫酸酯的抗病毒活性已有不少報道。褐藻多糖硫酸酯對單純性包疹病毒1(herpes simplex virus-1, HSV-1)的復制有抑制作用(Besednova et al., 2016)。HSV-1的復制受生物體的免疫應答體系控制。用褐藻多糖硫酸酯喂養受HSV-1感染的小鼠, 可以增強小鼠巨噬細胞和B細胞的吞噬作用, 同時增加自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)的活性。連續喂養三周后, 小鼠體內中性抗體顯著增強。他們認為褐藻多糖硫酸酯對受HSV-1感染小鼠的保護作用可能是通過直接抑制病毒復制和激活免疫防御系統實現的。

抗人類免疫缺陷病毒(human immunode-ficiency virus, HIV)作用是硫酸多糖抗病毒研究中的熱點, 硫酸化基團的存在對其抗HIV活性是必要的, 其作用強度隨硫酸化程度的升高而增強。其抗HIV病毒機理主要是通過阻斷HIV與靶細胞上的受體CD4的連接發揮抗病毒作用。細胞上的CD4分子氨基末端含有豐富的堿性氨基酸, 是HIV入侵宿主細胞和硫酸多糖抗HIV的作用靶點。褐藻多糖硫酸酯對HIV感染的起始階段和后來的復制階段均有抑制作用。在不產生細胞毒性的濃度下均可抑制HIV誘導的合胞體形成和HIV逆轉錄酶的活性(Dinesh et al., 2016)。

褐藻多糖硫酸酯對于禽流感病毒(newcastle disease virus, NDV)有顯著的抑制作用, 在NDV感染前或后1h用0.25~16μg褐藻多糖硫酸酯處理雞胚胎, 可以顯著抑制NDV病毒感染, 最高可以使感染率降低90%(Trejo-Avila et al., 2016)。

褐藻多糖硫酸酯對植物病毒性感染也有一定的抑制作用。Lapshina等(2006)研究了從墨角藻中提取的褐藻多糖硫酸酯對養殖煙草葉感染煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)后傳染速度的抑制作用。該實驗用2μg/mL的TMV感染煙草葉, 向治療組添加1mg/mL褐藻多糖硫酸酯。研究發現, 治療組煙葉由TMV引起的壞死損傷數目比模型組減少90%; 添加TMV和褐藻多糖硫酸酯混合物3天之后, 病毒的毒性和濃度分別為62%和66%, 比單獨用TMV培育的要低。由此可見, 褐藻多糖硫酸酯可以有效抑制TMV感染的擴散。同時研究還發現褐藻多糖硫酸酯是在基因水平上發揮作用, 其抗病毒活性機制是通過抑制病毒誘導的多核體細胞的形成來抑制病毒對細胞的吸附作用, 硫酸根是褐藻多糖硫酸酯抗病毒活性必需的成分。

3.5 抗氧化活性

自由基在體內積累可以引起衰老、心腦血管、老年癡呆等多種疾病, 近年來尋求高效、低毒的抗氧化劑成為科學家研究的熱點。褐藻多糖硫酸酯具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等多種生物活性。利用五種蛋白酶和六種碳水化合物酶對裙帶菜中的褐藻多糖硫酸酯進行了提取和體外抗氧化活性研究。不同酶提取的褐藻多糖硫酸酯均有較強的清除DPPH(2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl)自由基和羥自由基的能力, 雖然它們清除超氧陰離子自由基的能力較弱, 但仍然是一種安全性高、水溶性好的抗氧化劑來源(Je et al., 2009)。褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性與多糖的分子量和硫酸根含量及單糖的種類有關。Ajisaka等(2016)研究了從不同褐藻中制備的褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性和其化學組成的關系。結果表明, 硫酸基是褐藻多糖硫酸酯發揮抗氧化活性的關鍵基團, 但是硫酸基的增加并不能導致抗氧化活性增加, 當褐藻多糖硫酸酯的支鏈連有葡萄糖醛酸等單糖時其抗氧化活性相近?？傊? 褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性是由多種因素決定的。

3.6 腎臟保護活性

P-選擇素是一種黏附分子, 從正常腎小球的免疫組化染色中無法檢測出, 但在腎臟炎癥早期, P-選擇素在腎小球內皮細胞和附著的血小板表面均有表達, 這有助于中性粒細胞的聚集, 從而促進炎癥的進展(周同等, 1998)。在很多腎病動物模型中, 都發現P-選擇素對腎病的發生、發展起著很重要的作用。褐藻多糖硫酸酯是P-選擇素的抑制劑, 它在腎臟疾病中表現出的作用可能和P-選擇素有一定關系(Bachelet et al., 2009)。周同等(1998)研究發現褐藻多糖硫酸酯可以抑制腎小球性腎炎中P-選擇素的表達, 減少炎性細胞浸潤和血小板在腎組織的聚集。但是, De Vriese等(1999)指出, 在抗腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)腎炎中, P-選擇素幾乎消除了小靜脈內中性粒細胞的移動, 但對蛋白尿的發生沒有影響, 他們認為P-選擇素介導的中性粒細胞的黏附對于中性粒細胞和腎小球毛細血管內皮細胞的相互作用不是必要條件?？梢? P-選擇素在慢性腎功能衰竭(chronic renal failure, CRF)中的作用還需要進一步研究。Zhang等(2005)研究了褐藻多糖硫酸酯在海曼腎炎中的作用, 在海曼腎炎的模型中, 分別以50、100和200mg/kg劑量的褐藻多糖硫酸酯每天給大鼠灌胃。持續四周后, 在劑量為100和200mg/kg的治療組中, 尿蛋白和血肌酐均明顯下降, 這可能和褐藻多糖硫酸酯阻斷P-選擇素和中性粒細胞黏附之間的相互作用有關(Zhang et al., 2005)。

氧化應激是體內活性氧(reactive oxygen species, ROS)產生增加和(或)抗氧化防御能力降低的結局。ROS可通過多種途徑損傷腎臟的功能和結構。ROS通過對入球小動脈、出球小動脈及系膜細胞舒縮性質的影響, 引起小球血流動力學改變和腎臟進行性損傷; 過氧化物能損害腎小球的選擇性通透性能, 引起尿蛋白排泄增加, 腎小管內的大量尿蛋白可通過產生ROS損害腎小管上皮細胞; 過氧化物對腎小球、血管及腎間質成分具有直接細胞毒性作用。此外, 過氧化物還可以上調炎癥反應, 誘導前炎癥因子及化學趨化因子產生(Goi et al., 2009; Korish, 2009)。這些因素都可以加速慢性腎功能衰竭(chronic renal failure, CRF)的進程。研究發現腎結石對腎臟損傷是由于腎結石可以誘導產生氧自由基, 而褐藻多糖硫酸酯可以保護由草酸鹽導致的腎臟損傷。褐藻多糖硫酸酯可以降低高草酸尿癥老鼠的體內自由基, 并增加其抗氧化酶的活性, 降低脂質過氧化水平, 從而減輕對腎臟的損傷(Thamilselvan et al., 2003; Veena et al., 2006)。

現代醫學認為CRF患者末期腎組織病理均表現為腎間質纖維化。目前研究認為腎間質纖維化是單核巨噬細胞浸潤, 細胞外基質合成增加、降解減少, 以及致纖維化的細胞因子表達上調等多種因素綜合作用的結果。商濱等(2006)的研究表明, 褐藻多糖硫酸酯可以明顯抑制人腎間質成纖維細胞(human renal interstitum fibroblast, HRIF)增殖, 同時抑制HRIF分泌FN、IN兩種糖蛋白, 推測其可顯著減少細胞外基質的合成, 從而減少細胞外基質的聚集, 改善和延緩腎間質纖維化。劉建春等(2007)研究發現, 在CRF早中期褐藻多糖硫酸酯可以抑制TGF-β1和MCP-1兩種細胞因子的表達, 從而延緩腎間質纖維化進展。

腎小球硬化(glomerulosclerosis, GS)是多種生物活性物質、多種細胞成分參與的復雜過程, 腎臟局部和機體系統的環境都可以影響其發生、發展。引起腎小球硬化的原因可大致分為腎小球內高血壓、免疫性和代謝性三類。細胞外基質產生細胞、血流動力學改變、血管緊張素Ⅱ、內皮素、細胞因子、細胞外基質轉化失平衡、脂代謝紊亂、氧化應激、細胞凋亡等都是影響腎小球硬化的因素。王兆華等(2005)針對褐藻多糖硫酸酯對阿霉素腎病腎硬化大鼠腎臟的保護作用進行了研究, 結果表明, 褐藻多糖硫酸酯可以降低阿霉素腎病腎硬化大鼠的尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平, 改善腎臟功能。該多糖可以抑制大鼠腎臟中TGF-β1表達并減少細胞外基質中Ⅳ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的合成, 并且可以減少腎皮質TGF-β1、mRNA和PAI-1 mRNA的表達, 具有延緩腎小球硬化的作用(王兆華, 2005)。

3.7 神經保護活性

有研究發現, 從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯能減輕1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPP+)引起的細胞損傷, 對1-甲基-4-苯基- 1,2,3,6-四氫吡啶誘導的PD小鼠模型有顯著的保護作用, 該成果已獲國家發明專利授權(ZL 200710099008.8) (羅鼎真等, 2009; Luo et al., 2009; Cui et al., 2010)。FPS是從海帶中制備得到的粗多糖, 其分子質量不均一, 化學組成復雜, 化學結構難以確定, 限制了其進一步開發為多糖類藥物。因此, Jin等(2013)對FPS進行了氧化降解和分級純化, 并利用PD細胞模型對得到的一系列分級組分進行活性篩選, 實驗結果表明, 硫酸雜聚糖組分UF具有最強的神經保護作用, 是FPS神經保護活性的主要組分。進一步對其神經保護機制進行研究, 發現UF對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞的保護作用與UF抗凋亡活性有關, 其UF抗凋亡活性與PI3K/AKT信號通路有關, UF可以促進PI3K和AKt的磷酸化, 激活PI3K/AKT信號通路, 同時, UF對PI3K/AKT信號通路中的相關蛋白也有一定的調控作用, 可以提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達, 降低促凋亡蛋白Bax P53的表達(Wang et al., 2017)。

3.8 其他活性

選擇素又稱凝集素樣細胞黏附分子, 為跨膜糖蛋白, 主要位于白細胞(L-選擇素)、血小板(P-選擇素)和內皮細胞(P-和E-選擇素)表面, 介導細胞與細胞間的黏附。它們具有高度選擇性, 其配體為位于細胞膜上的寡糖。在炎癥早期, 白細胞穩定黏附、滲出和向炎癥部位遷移之前, 選擇素與細胞表面聚集的寡糖結合, 介導白細胞最初的著邊和滾動。褐藻多糖硫酸酯因具有與L-、P-選擇素配體類似的硫酸化寡糖結構, 容易與L-和P-選擇素結合而抑制它們與各自的配體結合, 從而發揮對L-和P-選擇素的抑制作用(Novoyatleva et al., 2016)。褐藻多糖硫酸酯還可以抑制CCl4引起的肝細胞呈纖維化過程, 保護肝細胞, 延長星形肝細胞的壽命(Song et al., 2017)。

褐藻中的褐藻多糖硫酸酯能夠有效降低血清中總膽固醇(total cholesterol chol, CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein- cholesterol ldl-c, LDL-C)和三酯甘油(triglyceride, TRIG)的含量, 并且增加高密度脂蛋白膽固醇(high density lipid-cholesterol, HDL-C)的濃度, 減少人們得高血脂、高血糖疾病的風險。還能夠減輕體重, 減少脂肪組織塊, 下調脂肪形成轉錄因子和其他特定的靶基因, 具有潛在的減肥作用(Kim et al., 2014)。

此外, 褐藻多糖硫酸酯還具有抗炎、保護缺血再灌注損傷、抑制血管緊張素酶等多種生物活性(Cong et al., 2016; Atashrazm et al., 2016)。隨著研究技術和方法的深入, 相信更多褐藻多糖硫酸酯的生物活性會被發現, 其應用也將更加廣泛。

4 褐藻多糖硫酸酯未來研究趨勢

褐藻多糖硫酸酯的結構復雜, 是制約其生物活性應用的一個主要因素。目前, 對褐藻多糖硫酸酯結構的研究主要是通過降解的方法制備寡糖, 結合波譜學方法進行一級結構的鑒定。但是, 很少有人從褐藻多糖硫酸酯的生物合成途徑對其結構進行研究。我們認為未來褐藻多糖硫酸酯的一個研究重點是從海藻體內尋找褐藻多糖硫酸酯合成的關鍵酶, 從生物合成途徑來解析褐藻多糖硫酸酯的結構特點。同時, 利用尋找到的褐藻多糖硫酸酯合成的關鍵酶在體外合成褐藻多糖硫酸酯寡糖, 這對于寡糖的大量制備和應用有重要的意義。

對褐藻多糖硫酸酯生物活性的研究逐漸從藥效學的研究深入到藥理機制的研究, 但是, 由于多糖是一個大分子物質, 尋找能和靶目標特異性結合的糖單元十分困難。未來一方面可以針對制備特異性褐藻多糖硫酸酯寡糖單元進行機制研究, 另一方面可以通過一些模擬軟件來尋找可以和特定靶點結合的糖單元。同時, 可以利用相關軟件模擬褐藻多糖硫酸酯的二級結構, 通過糖與靶點的結合能力分析優化多糖的結構。

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A Study on the Structure and Activity of Fucoidan

WANG Jing1, 2, ZHANG Quan-Bin1, 2*

(1. Institute of Oceanology Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Qingdao National Laboratory and Marine Science and Technology, Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Qingdao 266071, China)

Natural polysaccharides made predominantly of sulfated α--fucose residues are known as fucoidan. They are present in brown algae and in some marine invertebrates. The amount of fucoidan in brown algae varies from 20% in Fucus to 2% in Laminaria. Fucoidan, over the past few years, has attracted steady attention as a readily accessible biopolymer possessing diverse biological activity. Algal fucoidans have much more complex and heterogeneous structures devoid of regularity. It is noteworthy that fucoidans isolated from species belonging to different orders of brown algae differed in the structure of their main chain that was built of either 3-substituted or alternating 3- and 4-substituted α-L-fucose residues. Algal fucoidans are mainly composed of sulfated fucose. As the type of their glycosidic bond and sulfate group distribution are still under debate, their molecular structure remains to be strongly established. Fucoidan displays diverse biological activity with potential medicinal value, such as being an anticoagulant, antithrombotic, anti-inflammatory, antitumor, contraceptive, antiviral, and antioxidant. This review discusses the different extraction methods, purification methods, the structural features, and activities of fucoidan.

Fucoidan; structure; biological activity

TS255.1

10.12036/hykxjk20170811001

國家自然科學基金項目(41406144); 中國科學院青年創新促進會基金項目(2016190)。王 晶, 女, 副研究員, 主要從事海洋藥物開發和海藻資源高值化利用研究, E-mail: jingwang@qdio.ac.cn

張全斌, 男, 研究員, 博士生導師, 從事海藻化學與海洋藥物研究, E-mail: qbzhang@qdio.ac.cn

2017-08-11,

2017-08-24