軟骨細胞體外增殖去分化的拉曼光譜分析

金璐頔 徐晶晶 張 勇 余躍洲 劉 暢 趙東平 葉安培,,*

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軟骨細胞體外增殖去分化的拉曼光譜分析

金璐頔1徐晶晶2張 勇3余躍洲2劉 暢3趙東平3葉安培1,3,*

(1北京大學前沿交叉學科研究院，北京 100871；2北京大學-清華大學生命科學聯合中心，北京 100871；3北京大學信息科學技術學院，納米器件物理與化學教育部重點實驗室，北京 100871)

基于顯微拉曼光譜技術，對組織工程的軟骨種子細胞在傳代增殖過程中的去分化進行單細胞分析。首先，對體外單層培養的第1?4代(P1?P4)大鼠軟骨細胞樣本進行了單細胞拉曼光譜檢測，由此識別出軟骨細胞中各種堿基、糖基、氨基酸等主要物質分子結構的特征峰集合。隨后，分析拉曼光譜中若干重點特征峰強度隨細胞傳代次數的變化，發現軟骨細胞體外增殖過程中核酸(789、1094、1576 cm?1)含量降低、II型膠原(特異組分為羥脯氨酸，1207 cm?1)和蛋白聚糖(特異組分為糖胺聚糖，1042、1063、1126、1160 cm?1)合成下降、脂質(1304 cm?1)及磷酸鹽(957 cm?1)含量增加等分子水平變化，從而在活體單細胞層次初步揭示了去分化引起軟骨細胞增殖變緩、分泌減弱、形態纖維化等現象的分子機制。

軟骨細胞；去分化；單細胞分析；顯微拉曼光譜；分子機制

1 引言

軟骨是哺乳動物重要的結締組織，由軟骨細胞(chondrocyte)和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)構成。人體中的關節透明軟骨有承受負荷、減少關節間骨骼摩擦等重要功能，也因此而易消耗磨損，更有退行性病變所引發的關節炎、髕骨軟化癥等高發軟骨病癥。由于軟骨組織中一般不存在血管和神經網絡，細胞增殖能力較為有限1，受損后很難自行痊愈，且傳統治療方法鮮有持久的良好效果。組織工程為解決軟骨疾病問題創造了新的可能，即用“基質誘導下的軟骨細胞移植(matrix-induced chondrocyte implantation，MCI)”技術，將自體或異體(如鼠、兔等動物)軟骨細胞植入具有誘導生長作用的三維支架中，再將支架整體移植到患者的受損關節軟骨處，使其中的細胞不斷生長、分裂并持續產生膠原蛋白等ECM成分，修補病變部位以實現軟骨病癥的治愈2?5。

種子細胞作為組織工程三大要素之一，在很大程度上決定了軟骨移植的修復效果。實驗室條件下單層傳代的傳統細胞培養模式實現容易、操作簡單，但研究發現隨著培養代數和時間的增加，軟骨種子細胞會逐漸喪失其正常細胞表型6?9，與體內關節透明軟骨的原有細胞產生較大差異。這種現象被定義為“去分化(dedifferentiation)”，很可能引起所植入軟骨組織的整體纖維化10，甚至誘發關節炎11，嚴重影響MCI技術的臨床效果。軟骨細胞體外增殖去分化的具體表現為：(1) 細胞增殖速度逐漸下降，生長曲線漸趨飽和，在若干次傳代后完全停止增殖；(2) 通過顯微鏡或電鏡觀察，發現細胞形態由圓形、多角形漸變為類似成纖維細胞的長梭形12；(3) 通過組織學染色等方法，發現去分化軟骨組織ECM中的II型膠原和蛋白聚糖含量降低13，而它們是由組織中的軟骨細胞分泌產生；(4) 軟骨細胞自身力學特性發生較大改變，與MCI三維支架材料的結合力也下降14。目前學界對軟骨細胞去分化現象的單細胞研究成果較為有限，對其內部分子機制也尚不清楚。

拉曼光譜技術的原理基于樣品分子振動所引起對入射光的非彈性散射，不同物質分子因散射光的不同頻率移動而在光譜上有特異性的位置分布，光譜峰值強度則代表該物質相對含量。拉曼光譜是表征樣品化學成分和分子結構信息的有力工具，業已成為化學、物理學、生物學、醫學等交叉學科領域卓有成效的研究手段15,16。顯微拉曼光譜技術的信噪比與空間分辨率較高，相比其他單細胞分析技術具有無標記、無損傷的優點，可以實時監測細胞內生化物質分布及動態變化過程17,18。目前，單細胞顯微拉曼光譜已應用于細胞癌變臨床診斷19、細胞個體老化檢測20、人體血細胞早期病變篩查21等方向。在軟骨醫學方面，Kunstar等22通過拉曼光譜檢測了不同層次軟骨組織的成分差異；Kumar等23則探究了不同程度的關節炎組織中軟骨細胞的拉曼光譜差異。

有鑒于此，我們測定了體外單層培養第1?4代軟骨細胞的顯微拉曼光譜，通過數據處理與文獻比對，表征了單個軟骨細胞內多種特征分子結構，定量分析細胞傳代培養過程中關鍵成分的變化趨勢，進而從分子生化效應的角度詮釋軟骨細胞體外增殖中的去分化現象。本工作為進一步研究軟骨細胞去分化奠定了分析基礎，也對組織工程學的機制探索與技術檢驗有一定指導意義。

2 實驗部分

2.1 顯微拉曼實驗平臺構建

相關實驗在我們自建的共聚焦顯微拉曼實驗平臺(詳細結構如圖1所示)上進行。由固體激光器(Excelsior-532-200-CDRH，美國Spectra-Physics公司)發出的532 nm波長單模激光經外光路擴束、準直后導入顯微鏡(Axiovert 200，德國Zeiss公司)，最終通過高數值孔徑物鏡(100 × 油鏡，數值孔徑N.A. = 1.3)聚焦于樣品。實驗中控制樣品處激光功率為10 mW的較低值，以免對細胞造成熱損傷。

圖1 本工作所用的共聚焦顯微拉曼實驗平臺

Color online.

2.2 軟骨細胞提取與培養

大鼠軟骨細胞樣品由北京大學醫學部基礎醫學院朱敬先老師、李晨曦博士等饋贈，采集過程符合實驗動物應用和保護指南。取一只6月齡健康大鼠放血處死，隨即在無菌條件下解剖分離雙側膝關節面軟骨，其間注意細致剝離其表面的關節滑膜等纖維組織。切下的軟骨組織立即用含有“雙抗”(含青霉素、鏈霉素各100 μg?mL?1，美國Hyclone公司)的足量PBS緩沖液(邁晨科技)連續沖洗3次，再在培養基環境下快速切成約1 mm3大小的碎片，放置在15 mL無菌離心管中，加濃度為0.2%的II型膠原蛋白酶(美國Sigma公司)，37°C下靜置消化過夜。次日加血清終止消化，用細胞篩過濾消化物，將濾液以1000 r?min?1速度離心10 min并棄上清液。對沉淀中細胞用PBS緩沖液繼續沖洗、離心3次后，將密度調整為1.5 × 105個/mL，接種在T25培養瓶中開始原代培養。

對軟骨細胞采用傳統的單層培養方式，在37°C、5% CO2培養箱環境下進行，所用培養基體積分數配比為：89%的DME/F12基礎培養基(美國Hyclone公司，含2.5 mmol?L?1谷氨酰胺)、10%的澳洲胎牛血清(美國Gibco公司)、1%的雙抗(美國Hyclone公司)，每3天定時更換1次培養基。每6天(144 h)觀察到細胞增殖至覆蓋瓶底面積的80%以上(預示將發生接觸抑制)，此時用胰蛋白酶(濃度為0.25%，邁晨科技)消化細胞后均分為4份，其中3份用于繼續傳代培養，1份用于光譜實驗。

在傳代過程中我們發現，該大鼠軟骨細胞在第5代時雖經長時間培養和多次更換培養基，其貼壁密度仍無明顯增加跡象，即基本失去增殖能力而無法進行下一次傳代。同時，在顯微鏡下也觀察到貼壁狀態下的軟骨細胞從第1代的圓形、橢圓形逐漸變形，到第4代已呈現長梭狀的類纖維化形態，證明軟骨細胞去分化實際發生于第1–4代的傳代培養過程中。因此，我們選取所培養的前4代軟骨細胞作為拉曼光譜分析對象。

2.3 拉曼光譜采集與分析

將上述準備好的實驗細胞樣品用PBS緩沖液以1000 r?min?1、3 min沖洗離心3次，最后加10倍體積PBS緩沖液稀釋后得到待測細胞懸浮樣。取該懸浮樣100 μL加入自制的石英玻片樣品池中，在顯微鏡下隨機尋找50個形狀圓潤、邊緣明顯、直徑范圍為12?16 μm的存活細胞個體作為該組樣本，以減小樣本誤差干擾。為了避免細胞內不同結構成分差異帶來誤差，每次實驗對準細胞核中心位置采集光譜30 s，每個細胞僅采集一次。為扣除背景影響，每組實驗均在細胞同一焦面上對臨近區域的PBS緩沖液采集一組背景拉曼光譜。另外，鑒于相鄰兩組拉曼光譜的采集間隔長達6天，故在每次正式采集光譜之前均用直徑為5 μm的聚苯乙烯微球(美國Bangs Laboratories)進行標定，以確保光譜儀工作狀態始終保持一致。

將所檢測的第1?4代細胞依次記為P1?P4組，每組包含同一代細胞的50個拉曼光譜數據，即4組總數據量為200。在Matlab (美國MathWorks公司)軟件編程環境下，每個光譜數據依次經過去除宇宙射線、扣除背景光譜、9點平滑濾波的同一套處理流程，并以1001 cm?1峰值為參照標準進行歸一化，這也是為了進一步排除不同實驗時間的系統狀態偏差。

如圖2所示，歸一化后的P1?P4組拉曼光譜在400?1700 cm?1范圍內的多個波數區間都存在明顯的組間差異，但圖中代表各組光譜標準誤的灰色陰影部分寬度有限，這說明細胞光譜數據的組內差異相對較小。因此為方便起見，我們直接選用每組軟骨細胞的均值拉曼光譜，在后續統計比較中采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)，通常當假設檢驗成立概率< 0.05時可認為相關光譜強度差異具有統計顯著性。

圖2 P1–P4組細胞歸一化后的均值拉曼光譜

The colored (P1 = orange, P2 = violet, P3 = brown, P4 = green) solid lines indicate the average spectra normalized according to the peak intensities at 1001 cm?1. The grey-shaded areas represent the standard errors. The Raman excitation wavelength is 532 nm. Color online.

3 結果與討論

3.1 軟骨細胞組分的拉曼光譜歸屬

如圖3所示，用MATLAB軟件可自動識別出P1?P4組軟骨細胞均值拉曼光譜的多個共有振動特征峰如789、861、935、1001、1121、1163、1245、1442、1572、1652 cm?1等(考慮到峰移影響，在此取P1組均值拉曼光譜的峰位波數值)，分別代表細胞中含量較為豐富的多種分子振動模式。除此之外，4組拉曼光譜中還各有一些較弱特征峰存在。比照前人文獻對軟骨細胞及組織內主要成分的拉曼譜峰歸屬24?35，篩選其中可明確解析、具有代表性的17個特征峰集合，列出其在P1?P4組光譜上的波數位置如表1所示。這些峰分別指示軟骨細胞中堿基、氨基酸、酰胺鍵、糖基、脂質鏈等分子結構，考慮到不同實驗條件下拉曼光譜可能存在微小的波數差異，測得峰位與文獻數據的符合程度較好。

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圖3 P1–P4組軟骨細胞均值拉曼光譜的共有特征峰

The colored (P1 = orange, P2 = violet, P3 = brown, P4 = green) solid lines indicate the normalized spectra, which are vertically offset for clarity. The Raman excitation wavelength is 532 nm. Color online.

4組軟骨細胞均值拉曼光譜間的差異性顯示出相應生化成分在細胞傳代過程中的變化，這有助于軟骨細胞去分化分子機制的初步鑒識：一方面，多數共有特征峰從P1組到P4組發生峰位移動，如861 cm?1特征峰的總體紅移與935、1121 cm?1特征峰的總體藍移都源于蛋白質分子空間構象的改變34；另一方面，我們也觀察到部分特征峰在P1?P4組有明顯的強度差異，如代表胡蘿卜素的1515 cm?1特征峰僅在P3組出現，這在一定程度上反映出軟骨細胞內分子含量的動態變化。

3.2 軟骨細胞去分化的分子變化分析

根據前述軟骨細胞去分化過程的具體表現，其生化考察應至少關注三個方面，即：細胞增殖活力(遺傳物質復制速率)、細胞分泌活性(特別是對ECM中主要組分的分泌效率36)、細胞表型變異(反映自身化學成分變化)。為了在分子生化水平上解析這些現象，我們對P1?P4組均值拉曼光譜的多個特征峰強度進行代際對比(見圖4，此處忽略各組光譜峰位移動影響)，希望以此揭示軟骨細胞內各類物質的相對含量變化。

3.2.1 核酸(DNA/RNA)分子含量變化

作為遺傳信息載體，DNA和RNA的含量既表示細胞分裂增殖活力，也直觀反映細胞分泌表達能力。DNA和RNA分子結構高度近似，故分析時將兩者合并為“核酸(DNA/RNA)”一類。

根據文獻35，787、1094、1576 cm?1為核酸分子的3個特征峰，分別代表DNA/RNA中磷酸二酯鍵、各種堿基等分子結構的振動模式。如圖4(a)所示，可以發現隨著細胞傳代次數的增加，各峰值強度均呈明顯下降的總體趨勢，說明在去分化過程中軟骨細胞的增殖、生長、分化特性有弱化傾向。注意到P2組1094 cm?1峰值強度相比P1組略有增加，我們認為軟骨細胞在體外培養的最初階段應先經歷一個生長狀態有所改善的適應期，之后才受到去分化的明顯影響。

3.2.2 蛋白聚糖分子含量變化

軟骨ECM中有諸多特異性大分子，包括蛋白聚糖，II、IX、XI型膠原，基質蛋白，軟骨連接蛋白等。其中，II型膠原和蛋白聚糖占比較大，兩者相互結合成網狀結構，使軟骨具有一定彈性，對維持軟骨形狀、承載外來負荷起到重要作用，也是評價軟骨細胞分泌功能的主要標準13。

表1 P1–P4組軟骨細胞拉曼光譜特征峰位置及其歸屬24–35

透明軟骨組織內的蛋白聚糖由一個核心蛋白與一條或多條側鏈糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)等以共價鍵連接構成，并通過連接蛋白與透明質酸分子相結合37。蛋白聚糖中常見的GAG分子類型有硫酸角質素、硫酸軟骨素等。

參照表1及其他文獻38,39，我們選取1042、1063、1126、1160 cm?1為軟骨細胞中GAG分子結構的4個特征峰，如圖4(b)所示。其中，1063 cm?1峰可表征硫酸基團31，與硫酸軟骨素與硫酸角質素有關，可視為GAG的強特異性峰。我們發現，這4個特征峰的強度雖在P1?P2階段有所增加(亦可視為細胞經歷初始適應期的狀態表現)，但在之后的P2?P4階段又呈現出明顯下降的總趨勢，說明軟骨細胞中GAG的合成水平有所減弱，這與受到去分化影響的羊肋軟骨組織GAG染色結果40一致。GAG合成下降可能與蛋白激酶C(PKC)基因表達受到抑制的原理41有關，這有待于合成生物學的進一步探究。

3.2.3 II型膠原分子含量變化

在關節透明軟骨的膠原總量中，II型膠原占比達80%以上，為軟骨提供了特有的張力和硬度，是軟骨細胞高度分化、軟骨組織趨于成熟的標志。II型膠原中富含羥脯氨酸，且羥脯氨酸上的羥基幾乎全部與糖類結合，因而糖化率較高。與之相反的是I型膠原，不含羥脯氨酸組分而含糖量低，作為動物組織纖維形成膠原在人體內有更為廣泛的分布，特別是在成熟骨質中起到關鍵作用42。

我們在此僅選取1207 cm?1特征峰，如圖4(c)所示，觀察到該特征峰的強度隨軟骨細胞傳代次數遞增而有所下降。1207 cm?1峰特異性表征苯環的伸縮振動，其峰值下降源于軟骨細胞中羥脯氨酸(通常含苯環結構)的減少43。這一現象說明軟骨細胞在去分化時對II型膠原的分泌減弱，對應去分化軟骨細胞表型纖維化過程中II型膠原向I型膠原的轉化44。

另外，我們還發現圖4(d)中隨著軟骨細胞代數的增加，1246與1270 cm?1兩個特征峰的強度比值(1246)/(1270)明顯上升。已知1245?1279 cm?1區域被稱為蛋白質拉曼光譜的酰胺III帶(amide III)，其中1246 cm?1峰與1270 cm?1峰各自代表蛋白質二級結構中的無規卷曲和有序卷曲45,46。這兩個特征峰的強度比上升，表明去分化會導致軟骨細胞內膠原蛋白結構的無規卷曲減少、有序卷曲增加，即對軟骨細胞的II型膠原網絡造成一定破壞47。

圖4 P1–P4組軟骨細胞若干拉曼特征峰的相對強度比較

Dependences of the peak intensities are shown as functions of chondrocyte passage number (1?4): (a) 787, 1094, 1576 cm?1;(b) 1042, 1063, 1126, 1160 cm?1; (c) 1207 cm?1; (d) 1246 cm?1to 1270 cm?1; (e) 1304 cm?1; (f) 957 cm?1.Data represent the normalized mean intensities of Raman peaks, and bars represent the standard errors. Color online.

3.2.4 脂質分子含量變化

1304 cm?1峰通常被認為是細胞中脂質分子的CH2/CH3振動特征峰48。由圖4(e)可以看到，該峰強度隨軟骨細胞增殖代數增加呈上升趨勢，故可認為脂質在去分化軟骨細胞中含量增加。但鑒于迄今尚無軟骨細胞去分化與脂質分子關系的相關報道，故該結果還需要其他方面研究的支持。

3.2.5 磷酸鹽含量變化

生物體內主要的礦化無機鹽成分為磷酸鹽(特征峰在957 cm?1，代表物質為羥基磷灰石，主要分布于骨纖維組織中)。圖4(f)中957 cm?1峰強度49隨細胞傳代有上升趨勢，說明軟骨細胞內磷酸鹽成分的確有所增加。

4 結 論

我們基于單細胞顯微拉曼光譜技術，檢測了體外單層培養第1?4代大鼠軟骨細胞的化學組成。通過對拉曼光譜主要特征峰強度的比較分析，得到軟骨細胞體外增殖去分化過程中若干重要組分的變化趨勢：核酸含量減少，蛋白聚糖與II型膠原分泌水平下降，脂質與磷酸鹽含量增加等。去分化會導致體外培養軟骨細胞表型改變、功能失調，不利于組織工程的應用。本研究結果有助于在分子水平上揭示軟骨細胞傳代培養中的去分化機制，從而對MCI技術優選種子細胞、克服去分化影響提供指導。

此外，調整細胞密度、添加調控因子50、改變培養環境51等措施都能有效提升傳統單層細胞培養方法的效率，更有三維支架、離心管、生物反應器等諸多改進型培養方法52。在本工作基礎上，結合拉曼光譜技術，可以對所培養的軟骨種子細胞分別進行質量鑒定，并直觀對比這些培養方法對細胞去分化的實際抑制效果。

本研究結果也表明，在細胞分子機制的定量研究方面，無標記、無損傷的單細胞拉曼光譜技術確有一定優勢，有望應用于更廣泛的組織工程學課題研究。

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Raman Spectroscopic Analysis of Chondrocyte Dedifferentiation duringProliferation

JIN Lu-Di1XU Jing-Jing2ZHANG Yong3YU Yue-Zhou2LIU Chang3ZHAO Dong-Ping3YE An-Pei1,3,*

(1;2;3)

Seeded chondrocytes play a crucial role in current cartilage tissue engineering, yet both the quality and quantity of these cells could be impaired owing to cell dedifferentiation duringproliferation. Here, we used micro-Raman spectroscopy to investigate changes in cellular components upon monolayer culturing of primary rat chondrocytes through multiple passages. Based on the average spectral profiles, we detected a series of Raman peaks and recognized related radicals such as nucleobases, pyranose rings, sulfate, tyrosine, proline, and amides at the single-chondrocyte level. Quantitative analysis of the Raman peak intensities showed that nucleic acids (at 789, 1094, 1576 cm?1) decreased significantly from passage 1 (P1) to passage 4 (P4), whereas lipids (at 1304 cm?1) and phosphate (at 957 cm?1) increased significantly. Moreover, the syntheses of two major hyaline cartilage-associated proteins, aggrecan and type-2 collagen, were impeded, as indicated by the marked decline in the levels of their specific components (glycosaminoglycan at 1042, 1063, 1126, 1160 cm?1, and hydroxyproline at 1207 cm?1). Taken together, these featuresreveal thediminished propagation and secretion abilities of passaged chondrocytes needed for matrix-induced implantation, and shed light on the molecular mechanism of chondrocyte dedifferentiation.

Chondrocyte; Dedifferentiation; Single-cell analysis; Micro-Raman spectroscopy; Molecular mechanism

May 2, 2017;

June 5, 2017;

June 13, 2017.

Corresponding author. Email: yap@pku.edu.cn; Tel: +86-10-62762323.

10.3866/PKU.WHXB201706133

O641

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (U1636110), the National Key Technologies R&D Program of China (2012BAF14B14), and the Medicine-Informatics Interdisciplinary Project of Peking University, China (2014-MI-19).

國家自然科學基金(U1636110), 科技部“科技支撐計劃”(2012BAF14B14)及北京大學“醫學-信息”交叉研究種子基金(2014-MI-19)資助項目