基于交流阻抗技術的可再生型核酸適配體電化學傳感器的研究

盧 瑩，劉晶晶，楊 恪，韓 祺，田 燕

(安徽農業大學 理學院應用化學系，安徽 合肥 230036)

生物傳感技術在疾病的早期診斷、基因測試和法醫鑒定等領域發揮著越來越重要的作用[1,2]。一些與生理和病理過程相關的生物活性分子在人體內含量低、易降解、檢測困難，因此開發和尋找特異性好、靈敏度高的識別元件一直是生物分析工作者們關注的熱點[3-6]。核酸適配體作為一種選擇性高、親和力強、制備成本低、穩定性好的生物傳感識別元件，已成為當今生物學、醫學領域的研究熱點[7-11]。

據文獻報道，很多核酸適配體電化學傳感器將核酸適配體固定在電極表面作為靶標的識別元件，通過將核酸適配體識別靶標的過程轉化為電化學響應信號來實現對于靶標的測定[12-15]。由于適配體和靶標之間的結合力很強，使得這類傳感器的再生非常困難，需要采用劇烈的實驗條件將適配體和靶標解離，而劇烈的操作條件難免不會對核酸本身造成傷害，從而降低傳感器的使用壽命。因此發展可再生型的核酸適配體電化學傳感器成為了科研工作者研究的目標之一。

三磷酸腺苷(ATP)是生物體內組織細胞生命活動所需能量的直接來源。ATP在生物體液中的濃度很低，通常為10-9～ 10-8mol·L-1，建立選擇性高、靈敏度好的ATP檢測方法是一項具有挑戰性的工作[16-18]。電化學方法具有靈敏度高、檢測限低的優點，核酸適配體作為識別元件具有良好的選擇性，利用核酸適配體電化學傳感器檢測ATP已成為當前的研究熱點之一[19-21]。

本研究在ATP的核酸適配體互補鏈的5’端標記巰基，然后使該互補鏈與核酸適配體雜交。將雜交后形成的雙鏈DNA寡核苷酸固定在電極表面。在電解液中加入[Fe(CN)6]3-/4-作為探針分子。由于DNA磷酸骨架帶負電荷，可以阻礙陰離型探針[Fe(CN)6]3-/4-與電極之間的電荷轉移。當沒有ATP存在時，雙鏈DNA寡核苷酸修飾的金電極阻抗值較高。當引入ATP后，由于核酸適配體會與ATP結合而從電極表面解離，使得電極表面所帶的負電荷的量減少，對[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面的電荷傳遞的阻礙作用降低，測得的電化學阻抗值降低。通過檢測阻抗值的變化可以實現對于ATP的測定。與以往文獻報道的傳感器相比，該方法具有更廣泛的普適性，該傳感器無需在DNA寡核苷酸上標記電活性基團，使得傳感器的制備較為簡便，且降低了制備成本。并且該傳感器的再生僅需將電極表面固定的互補鏈與未標記的核酸適配體重新雜交即可實現，再生操作簡單、成本低廉。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CHI660B電化學工作站購自上海辰華儀器公司。電化學測定采用三電極體系：DNA修飾的金電極(直徑為2 mm)為工作電極， Ag/AgCl電極為參比電極，Pt絲為對電極。27個堿基的ATP的核酸適配體(5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT- 3’)和5’端標記巰基并且除去3’端最后四個堿基的該核酸適配體的互補鏈(5’-SH-(CH2)6-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCC-3’, cDNA)由上海英駿生命技術有限公司合成和純化；CTP、UTP、GTP和ATP購自Merck公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)由Amresco公司提供；3-巰基丙酸(MPA)由Acros公司提供。本研究中所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 雙鏈 DNA(ds-DNA)寡核苷酸的制備和標記

用超純水將ATP的核酸適配體及其互補鏈分別配成100 μM溶液。分別取核酸適配體和其互補鏈的溶液30 μL和15 μL，混合后向該混合液中加入5 μL退火緩沖液(annealing buffer: 100mM Tris, 1 M NaCl, 0.5 M EDTA, pH 7.4)。將混合溶液加熱到95°C，在95 °C 維持10 min，然后使溶液溫度以每分鐘1 °C的速率緩慢降至20 °C即可得到雙鏈DNA寡核苷酸(ds-DNA)溶液。所得的ds-DNA溶液用3KD的超濾管以3000 r·min-1的速率超濾20 min，以除去未雜交的單鏈DNA寡核苷酸。

1.3 電極的制備和再生

金電極在拋光布上依次用直徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉懸濁液拋光，然后依次用丙酮和超純水超聲清洗5 min。清洗過的電極在0.5 M的硫酸溶液中以0.5 V·s-1的掃速在-0.2 V～ +1.6 V的電位范圍內掃描，直至得到典型的清潔的金電極特征循環伏安圖。將該電極用超純水沖洗，除去表面剩余的硫酸溶液，然后將電極表面用氮氣吹干。將50 μL 5 μM的巰基標記的ds-DNA溶液滴涂在電極表面使其反應2小時，使ds-DNA通過自組裝的方式固定在電極表面。當自組裝反應結束后，用超純水沖洗電極表面，以除去電極表面殘余的ds-DNA溶液。然后將電極浸入1 mM的MPA溶液中反應10 min，以除去電極表面未結合牢固的ds-DNA。使用20 mM的Tris緩沖液(20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.6)和超純水充分清洗電極，以除去電極表面殘余的MPA溶液。 將制備好的電極在100 μL不同濃度的靶分子或干擾物的Tris緩沖溶液(20 mM Tris, pH 7.6)中浸泡10 min，反應溫度為室溫。10 min后將電極從溶液中取出， 使用20 mM的Tris緩沖液(pH 7.6)和超純水充分清洗電極，清洗過的電極即可用于電化學測定。測定靶分子后的電極使用Tris緩沖液和超純水充分沖洗。將清洗過的電極浸入300 μL 10 μM的核酸適配體溶液中，溶液中加入30 μL的退火緩沖液。將體系升溫至95 °C，在95 °C維持10 min，然后使體系溫度以每分鐘1 °C的速率緩慢降至20 °C。使用Tris緩沖液和超純水充分清洗電極以除去電極表面殘余的核酸適配體溶液。通過該方法使得電極得以再生。

1.4 電化學測定

電化學檢測在含有20 mM的亞鐵氰化鈉(Na4[Fe(CN)6])的Tris緩沖液(20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.6)中檢測，交流阻抗(electrochemical impedance spectroscopy, EIS)電化學檢測條件為： 測定電位，開路電位(open circuit potential)；交變電位，5 mV；頻率范圍，2×104Hz ～ 0.1 Hz。

2 結果與討論

2.1 傳感器的設計方案

本研究構建的ATP適配體交流阻抗電化學傳感器的傳感機理見圖1，首先將ATP的核酸適配體互補鏈的5’端標記巰基，然后使該互補鏈與核酸適配體雜交。將雜交后形成的雙鏈DNA寡核苷酸固定在電極表面。在電解液中加入[Fe(CN)6]3-/4-作為探針分子。 由于DNA的磷酸骨架帶負電荷，可以阻礙陰離子型探針[Fe(CN)6]3-/4-與電極之間的電荷轉移。當沒有ATP存在時，雙鏈DNA寡核苷酸修飾的金電極阻抗值較高。當引入ATP后，由于核酸適配體會與ATP結合而從電極表面解離，使得電極表面所帶的負電荷的量減少，對[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面的電荷傳遞的阻礙作用降低，測得的電化學阻抗值降低。通過檢測阻抗值的變化測定ATP。當使用該傳感器檢測靶標過后，將無標記的ATP的核酸適配體與電極表面固定的互補鏈再次雜交，傳感器即可得到再生。

圖1 基于交流阻抗技術的可再生型ATP適配體電化學傳感器檢測機理

2.2 ds-DNA 在電極表面的固定

圖2中(●)和(■)分別表示裸金電極和ds-DNA修飾的金電極在含有140 nM NaCl和20 nM Na4[Fe(CN)6]的20 mM Tris緩沖液中的交流阻抗圖譜。從圖可以看出，裸金電極的交流阻抗圖譜中半圓部分的半徑值非常小，當電極表面修飾了DNA后，對應于電荷轉移電阻的交流阻抗譜圖中半圓部分的半徑明顯增大。這是因為DNA的磷酸骨架帶負電荷，會對陰離子型探針[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面之間的電荷轉移產生阻礙，導致電荷轉移電阻增大。通過這一對比，證明ds-DNA被成功地修飾到電極表面。

圖2 裸金電極(●)和ds-DNA修飾的金電極(■)在含有140 nM NaCl和20 nM Na4[Fe(CN)6]的20 mM Tris緩沖液中的交流阻抗圖譜

2.3 傳感器對ATP的響應

圖3給出了使用該傳感器對于不同濃度的ATP 的交流阻抗響應信號。其中空心圓符號(○)表示裸金電極的交流阻抗譜圖。實心符號所代表的交流阻抗信號由外至內分別代表將該電極在不同濃度的ATP的Tris溶液中浸泡10 min后在電極上得到的交流阻抗譜圖，其對應ATP的濃度分別為0、10、20、40、60、80、100 nM。其中對應10 nM和20 nM 的ATP的譜圖和檢測ATP之前的電極上得到的譜圖幾乎重合。 由圖中可以看出隨著ATP濃度的升高，電極的電荷轉移電阻值不斷減小。

圖 3 裸金電極(○)和ds-DNA修飾的金電極檢測不同濃度的ATP后在含有140 nM NaCl和20 nM Na4[Fe(CN)6]的20 mM Tris緩沖液中的交流阻抗圖譜

根據交流阻抗圖中電極的電荷轉移電阻值， 我們繪制了阻抗值隨ATP的濃度變化的關系圖，如圖4所示。由圖4可以看出，ATP的濃度在20～100 nM之間時， Anson曲線上電荷轉移電阻值與ATP濃度成正比(ΔRet/ Ω = 1.6 CATP/nM-27.40, R = 0.998)。傳感器的檢出限為10 nM (S / N= 3)

圖4 電極的電荷轉移電阻值隨檢測ATP的濃度變化的關系圖

我們運用循環伏安技術作為輔證來檢驗該傳感器對于ATP的響應，結果如圖5所示。圖5中虛線部分是ds-DNA修飾的金電極在含有20 mM [Fe(CN)6]3-/4-的Tris緩沖液中的循環伏安圖，實線部分是使用該電極檢測100 nM的ATP后的循環伏安圖。由該圖可以看出當ds-DNA修飾的電極與ATP作用后 [Fe(CN)6]3-/4-的峰電位差降低，峰電流增加。該實驗證明，在檢測ATP后，[Fe(CN)6]3-/4-和電極表面的電荷轉移得到了促進，驗證了傳感器設計的合理性。

圖5 ds-DNA修飾的金電極檢測100 nM ATP前(虛線)后(實線)，在含有140 nM NaCl和20 mM [Fe(CN)6]3-/4-的20 mM Tris緩沖液中的循環伏安圖

2.4 傳感器的選擇性

我們研究了傳感器對ATP類似物CTP、UTP和GTP的響應，結果如圖6所示。選用的CTP、UTP、GTP和ATP濃度均為100 nM。由圖6結果可以看出，采用本傳感器檢測100 nM ATP的響應信號ΔRet為檢測100 nM CTP、UTP和GTP響應信號20倍以上，檢測100 nM的CTP、UTP和GTP的響應信號分別相當于20.2、20.5和20.6 nMATP的響應信號。該結果證明所構建的核酸適配體傳感器檢測ATP具有良好的選擇性。

圖6 傳感器的選擇性

2.5 傳感器的再生

本研究所構建的傳感器是將cDNA固定在電極表面，核酸適配體通過雜交的方式與cDNA結合。 在檢測ATP樣品后， 核酸適配體從電極的表面解離下來，因此傳感器的再生僅需將檢測后的傳感器與無標記的核酸適配體雜交即可實現。圖7顯示了新制備的傳感器以及經過六次再生的傳感器檢測100 nM ATP前后的電化學響應信號。經過六次再生后電極對于ATP的響應仍能達到電極初始響應的90%以上。該結果證明本傳感器能夠反復再生使用，可有效降低檢測成本。

圖7 傳感器的再生

3 結論

本文構建了一種可再生的ATP核酸適配體交流阻抗型電化學傳感器。該傳感器將ATP的核酸適配體互補鏈的5’端標記巰基，再與ATP核酸適配體雜交，通過自組裝法將雜交后的雙鏈DNA固定在金電極表面。當使用該傳感器檢測靶分子時，靶分子與核酸適配體結合，[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面的電荷傳遞的阻礙作用降低，電化學阻抗值降低。本傳感器具有普適、簡單的特點，電極易于再生，再生成本低廉。

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