激光解吸/激光后電離質譜法快速檢測黃酒中酪胺

冷宜昕，王彤彤，殷志斌，劉 蓉，杭 緯

(廈門大學化學化工學院，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，福建 廈門 361005)

黃酒是中國特有的酒類，由谷米低度釀造而成。酒曲中的菌種含有蛋白酶，可分解蛋白質產生多種人體必需的氨基酸，故被稱為“液體面包”。在黃酒發酵過程中，酒曲中的微生物所產生的氨基酸脫羧酶可使氨基酸發生脫羧作用產生生物胺(biogenic amine, BA)[1]。生物胺是一類具有生物活性的含氮有機物，屬于生命機體的生理物質，但生物胺含量過高會對人體的神經系統造成損傷[2]。酪胺是黃酒發酵過程中產生的一種重要生物胺，其前體多巴胺由酪氨酸脫羧酶和單胺羥化酶的催化作用產生。當人體攝入過量的酪胺時，會導致神經系統紊亂、亢奮、血壓升高以及偏頭痛，即產生所謂的“奶酪效應”[3]。中華人民共和國國家標準委員會制定了包含酒類、肉類等五大類食品中生物胺含量的分析方法[4]。

由于實際樣品體系的復雜性與生物胺在樣品體系中的低含量，對于酪胺、組胺等生物胺的檢測常常需要預處理，將體系中的組分預先進行分離、提純、富集再檢測。最常見的分析手段是高效液相色譜法，其具有靈敏度高與準確性好的特點，但常常需要復雜的樣品預處理和衍生化[5]，而預處理過程使黃酒中生物胺的監控十分不便，因此本課題組提出了一種無需樣品預處理即可對黃酒樣品直接上樣快速分析的質譜法。

激光解吸/激光后電離質譜法(laser desorption/laser postionization mass spectrometry, L2MS)是一種應用廣泛的質譜分析手段，該方法使用兩束激光對待測物進行分析，第一束激光使待測物在分解前迅速從樣品表面解吸出來，第二束激光將氣化的待測物分子電離形成分子離子進入質譜分析區。在實驗過程中，使用第二束激光使氣化分子電離服從雙光子共振電離機理(resonant two-photon ionization, R2PI)，其原理示于圖1。待測物分子在吸收一個光子能量后到達馳豫時間較長的穩定激發態，再通過吸收第二個光子使其發生電離[6]。激光解吸/激光后電離質譜法對酪胺的研究可以追溯到19世紀80年代，Tembreull和Lubman課題組使用L2MS結合R2PI技術對兒茶酚胺類物質及其衍生物進行分析，在低能量的后電離激光下得到了清晰的酪胺純樣譜圖[7]。對于實際樣品體系，由于其復雜性，直接進行質譜分析十分困難，常常需要使用高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS)進行分析，實驗過程復雜、耗時長。

圖1 雙光子共振電離原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of resonant two-photon ionization

本研究將著眼于R2PI對芳香體系的選擇性[8]，以有效地減少黃酒體系中復雜基體對酪胺檢測的干擾。使用自行搭建的質譜裝置在不進行任何樣品預處理的前提下，對黃酒實際樣品進行直接快速的分析，希望通過使用簡單的標準加入法即可測定實際樣品中的酪胺含量。

1 實驗部分

1.1 裝置與儀器

本課題組自行組裝了一臺激光解吸/激光

后電離質譜儀，裝置圖示于圖2。Nd:YAG納秒激光器(Minilite-Ⅱ)：美國Continuum公司產品，激光頻率10 Hz，激光脈寬5 ns，解吸和后電離激光波長分別為532 nm和266 nm；WaveSurfer 44Xs示波器：美國LeCroy公司產品；microTOF-QⅡ四極桿串聯飛行時間質譜儀：美國Bruker公司產品。

1.2 主要材料與試劑

酪胺純樣(純度98%)：上海源葉生物科技有限公司產品；黃酒樣品：浙江紹興縣唐宋酒業有限公司產品；乙腈(分析純)：美國Sigma公司產品。

1.3 質譜條件

1.3.1純樣實驗 解吸激光(532 nm)能量21 μJ，后電離激光(266 nm)能量400 μJ，延遲時間6 800 ns。

1.3.2激光解吸對比實驗 激光解吸質譜(LDI-MS)解吸激光(532 nm)能量 120 μJ，延遲時間6 800 ns。

1.3.3黃酒樣品實驗 解吸激光(532 nm)能量117 μJ，后電離激光(266 nm)能量1.38 mJ，延遲時間6 800 ns。

1.3.4ESI-MS對比實驗 電噴霧離子源正離子模式，流速180 μL/h，毛細管電壓4 kV。

2 結果與討論

2.1 酪胺純樣分析

酪胺屬于生物樣品，故選擇乙腈-水溶液(1∶1，V/V)作為溶劑對酪胺純樣進行分析。

圖2 自行搭建的激光解吸/激光后電離質譜儀示意圖Fig.2 Schematic diagram of the in-house-built L2MS setup

將酪胺純樣溶于乙腈-水溶液中，配制成1 mL酪胺混合溶液，其濃度梯度為0.5、1、10、50、100 mg/L，取2 μL混合溶液滴于潔凈的樣品靶上(不銹鋼靶)，樣品靶與進樣桿上的二維移動平臺直接相連，將樣品置于高真空下。酪胺分子的電離能為(8.41±0.12) eV，本實驗的后電離激光波長為266 nm(hν=4.67 eV)，雙光子能量(9.34 eV)大于酪胺分子的電離能，符合R2PI機理。在不開啟后電離激光時，通過優化解吸激光(532 nm)至激光能量為21 μJ時，分子離子峰恰好不在質譜圖中顯示；此時再開啟后電離激光(266 nm)并優化至激光能量為400 μJ時，可獲得較強的分子離子峰信號，優化后的延遲時間為6 800 ns，通過譜圖發現，在酪胺濃度很低時仍可以得到較好的分子離子峰及特征峰。

如果使用其他質譜分析手段對酪胺進行分析，所得的譜圖遠不如使用L2MS法得到的譜圖清晰。如對高濃度(1 000 mg/L)酪胺純樣進行激光解吸質譜分析(LDI-MS，解吸激光波長為532 nm)，酪胺分子幾乎完全被擊碎，得到的質譜圖示于圖3b。優化后的解吸激光(532 nm)能量為120 μJ，但無法通過調節激光能量獲取酪胺分子的分子離子峰及特征碎片峰，且雜質峰增加。通過譜圖對比發現，即使將酪胺純樣的濃度升高2個數量級也無法在直接解吸電離下獲得明顯的分子離子峰。

實驗通過將不同濃度的酪胺純樣進行單點完全解吸，對所得譜圖進行疊加，將酪胺分子的分子離子峰峰高與酪胺分子濃度的線性關系進行外推，計算L2MS法對酪胺純樣的檢出限。將濃度梯度為0.5、1、10、50、100 mg/L的酪胺純樣進行L2MS分析，多次重復實驗后所得的譜圖示于圖4?？梢钥闯?，即使濃度降至0.5 mg/L，譜圖依然清晰簡潔，便于解析。其中，為了更好地進行濃度梯度比較，0.5 mg/L和1 mg/L譜圖放大了20倍，將譜圖中分子離子峰(m/z137)峰高與酪胺濃度進行線性回歸，得到的線性關系示于圖5。對譜圖空白處信號進行統計，獲得背景噪音的相對標準偏差，結合線性關系斜率，并根據公式LOD=3σ/k，得到L2MS法檢測酪胺純樣的檢出限為32 μg/L。

圖3 解吸激光能量為21 μJ，后電離激光能量為400 μJ時，酪胺濃度為10 mg/L的L2MS圖(a);解吸激光能量為120 μJ時，酪胺濃度為1 000 mg/L的LDI-MS圖(b)Fig.3 L2MS of tyramine at the concentration of 10 mg/L obtained as the function of laser energy: Edesorption=21 μJ and Eionization= 400 μJ (a); LDI-MS of tyramine at the concentration of 1 000 mg/L obtained at the desorption laser energy of 120 μJ (b)

注：為清晰的表示酪胺濃度為1 mg/L與0.5 mg/L時譜圖，將其信號放大了20倍圖4 解吸激光能量為21 μJ，后電離激光能量為400 μJ時，梯度濃度的酪胺純樣L2MS圖Fig.4 L2MS of gradient concentrations of tyramine solutions obtained as the function of Edesorption=21 μJ and Eionization=400 μJ

公式中σ為譜圖中背景噪音的標準偏差，k為標準曲線的擬合斜率。

圖5 L2MS法獲得的酪胺純樣中酪胺分子離子峰信號強度與濃度的線性關系Fig.5 Intensity-concentration curve of pure tyramine sample by L2MS

2.2 黃酒實際樣品分析

取2 μL黃酒實際樣品滴在潔凈的不銹鋼靶上，進行質譜分析。當解吸激光(532 nm)能量為117 μJ，后電離激光(266 nm)能量為1.38 mJ時，信噪比最高，分子離子峰較強且碎片較少，便于譜圖解析，得到的L2MS圖示于圖6a?？梢园l現，酪胺分子的分子離子峰(m/z137)與特征峰(m/z107)信號較強。黃酒的主要成分是乙醇、水及糖類，并含有少量的有機酸、蛋白質、維生素以及礦物質。在實驗過程中，糖類、有機酸等分子質量較大的有機物無法被R2PI電離。食品中的生物胺包括酪胺、組胺、色胺、尸胺、精胺、亞精胺、腐胺、苯乙胺[10-11]。在譜圖中只有酪胺有較強的信號產生，這是因為酪胺的芳香性結構使其能夠通過R2PI方法進行電離，266 nm激光的后電離可以對其高效電離。由于實際樣品分析中的激光功率較高，在譜圖上可以發現較多的有機物碎片，這是由部分小分子的糖類和有機酸裂解造成的，同時還有環境中的鈉鉀污染，以及不銹鋼靶所含有的金屬元素，質譜圖示于圖6b。從整張譜圖上看，酪胺分子的信號強度較強，說明該方法對酪胺的檢測具有較高的選擇性。

如果不進行預處理，直接使用電噴霧飛行時間質譜(ESI-MS)對黃酒實際樣品進行分析，由于ESI-MS的質量歧視問題，在譜圖中無法獲得小分子質量的碎片峰，同時，由于黃酒體系的復雜性，酪胺分子無法在基體中獲得競爭電離，譜圖解析困難。與之相比，L2MS法體現了高選擇性檢測的優勢，酪胺可以在復雜基體中通過R2PI電離機理被選擇性電離，產生較強的信號，使檢測過程簡單便捷。

圖6 解吸激光能量為117 μJ，后電離激光能量為1.38 mJ時，黃酒實際樣品的L2MS圖(a)；黃酒實際樣品L2MS局部放大譜圖(m/z 0～100)(b)Fig.6 L2MS of yellow rice wine obtained at Edesorption=117 μJ and Eionization=1.38 mJ (a); the enlarged mass spectrum of (a) at m/z 0-100 (b)

2.3 標準加入法測定黃酒中酪胺含量

黃酒中生物胺的含量與其原料產地、釀造工藝、原材料品種及添加劑有較大關系。不同的米種本身所含的生物胺差異較大，同時在釀造過程中使用不同的發酵劑也會使生物胺含量發生變化[12-13]。除此之外，黃酒中酪胺含量測定也與使用的分析手段有關，從文獻[2,13-16]報道可知，黃酒中酪胺含量最低處于100 μg/L量級，最高約100 mg/L。

實驗采用標準加入法測定黃酒樣品中酪胺含量，向100 μL黃酒樣品中分別加入900 μL的10、20、50、80、100 mg/L酪胺的乙腈-水溶液(1∶1，V/V)，制備5組平行溶液，混勻后分別取2 μL不同濃度的混合液進行L2MS分析。為了保證在樣品中仍能獲得最優化的酪胺分子離子峰，實驗延續使用對于黃酒樣品的優化實驗參數。在進行多組重復實驗后，通過酪胺分子離子峰信號強度與加入不同酪胺濃度的線性關系對黃酒中的酪胺含量進行估算，示于圖7。得到的黃酒實際樣品中含有約68 mg/L酪胺，處于文獻值[2]范圍內，符合實際情況，可知該黃酒中的酪胺未達到對人體產生危害的含量(100 mg/L)。

圖7 黃酒樣品中酪胺分子離子峰信號強度與濃度的線性關系Fig.7 Intensity-concentration curve of tyramine in yellow rice wine sample

3 結論

建立了一種黃酒中酪胺的快速、高靈敏度的質譜檢測方法，采用激光解吸/激光后電離質譜法結合標準加入法選擇性檢測復雜黃酒體系中的酪胺成分，該方法對酪胺的檢出限可達32 μg/L，酪胺的分子離子峰信號強度與濃度具有良好的線性關系。結合標準加入法可以估算黃酒樣品中酪胺含量約為68 mg/L，在安全食用范圍內，不會對人體造成危害。

L2MS法具有高效、便捷的特點，在無需任何樣品前處理的情況下，仍能對復雜體系中的關鍵組分進行高選擇性檢測，提高了分析效率，同時具備取樣量少的特點。L2MS法也可以快速分析白酒、葡萄酒、醬油等含有生物胺的食品中酪胺含量，還可以用于食品中酪胺形成規律的探索，在食品安全領域有著廣泛的應用前景。

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