快速檢測蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留方法的優化

胡明燕 車明秀 張艷 王駿

摘要：乙酰膽堿酯酶抑制-分光光度法是目前監管中應用最為廣泛的快速篩查蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測方法。對該方法進行了多項條件的優化，結果表明，酶活性ΔA0控制在0.2～0.3時，抑制率能真實反映樣品陽性結果;孵育溫度是影響結果精密度的重要因素，部分儀器自帶恒溫裝置的溫控穩定性較差，比色槽溫度變化較大，導致反應結果的平行性和重現性較差，試樣在恒溫水浴鍋中的反應結果重現性很好;配制標準溶液時，應將丙酮含量控制在≤1%時，丙酮對試驗的影響可以忽略。

關鍵詞：有機磷;氨基甲酸酯;農藥殘留快速檢測;乙酰膽堿酯酶抑制-分光光度法

中圖書分類號：O656.31? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0112-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.028? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The Optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for Determination of Organophosphate and Carbamate Pesticide Residues in Vegetables

HU Ming-yan1，CHE Ming-xiu1，ZHANG Yan2，WANG Jun1

（1.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250103，China;

2.Licheng Direct Food and Drug Administration of Jinan City，Jinan 250100，China）

Abstract： Acetylcholinesterase-spectrophotometry is the most widely used method for rapid detection of organophosphorus and carbamate pesticide residues in vegetables. However，in practical application，the method is seriously limited by numerous peripheral influencing factors and low accuracy. The optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for determination of organophosphate and carbamate pesticide residues in vegetables were studied in this paper.Controlling the ΔA value between 0.2～0.3 and its results were given，which could improve the accuracy of positive test results. Extra thermostatic bath was chosen instead of device came with instrument and the results showed greatly improved reproducibility and parallelism. In order to avoid the influence of acetone on enzyme activity，the added amount of acetone should be controlled less than 1% when preparing standard solution.

Key words： organophosphate;carbamate pesticide residues;rapid detection;acetylcholinesterase

有機磷和氨基甲酸酯類農藥作為一類高效、廣譜的殺蟲劑、除草劑等正被廣泛應用于農業，但大量使用后對人、動物和環境產生的危害也日益嚴重[1]。有機磷 （OPs）及氨基甲酸酯（CBs）類殺蟲劑作為昆蟲神經系統中乙酰膽堿酯酶的專一性抑制劑被篩選出來廣泛應用，占殺蟲劑用量的70%以上[2，3]。有機磷和氨基甲酸酯類農藥對人和動物的毒性較大，絕大多數有機磷農藥是劇毒的，因其可與膽堿酯酶迅速結合，形成磷脂化膽堿酯酶，使膽堿酯酶失去催化水解乙酰膽堿的能力，使乙酰膽堿在體內蓄積，導致神經處于過度興奮狀態而出現中毒癥狀[4]，而且噴灑農藥還會造成生態環境污染[5]。農藥的急慢性中毒，特別是果蔬食品污染后引發的群體中毒事件屢有發生[6]。因此世界各國對有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留問題均高度重視，投入大量資金、人力和物力控制有機磷農藥相關的安全問題。中國GB 2763-2016[7]對馬拉硫磷、毒死蜱、樂果、敵敵畏等多種有機磷和氨基甲酸酯類農藥有嚴格限量規定。

采用酶抑制法的產品是品種最多、應用最為普遍的快檢技術，該類產品可以有效快速檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥。另外速測卡法由于檢驗原理同酶抑制法一致，且其操作簡單、成本低廉，在農貿市場、超市有很高的市場占有率。

現行有效的國家標準僅有GB/T 5009.199-2003[8]和NY/T 448-2001[9]。上述標準中規定方法為酶抑制法和速測卡法，但均為推薦標準方法，應用具有局限性，導致國內市場上農殘快速檢測產品品種繁多，檢測效果差強人意。本研究以GB/T 5009.199-2003[8]為基礎，優化檢測方法，建立酶抑制法快速檢測方法，通用性強且檢驗結果統一準確，實現對蔬菜中有機磷類和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速半定量分析，有效實現不同廠家快速檢測產品結果的比對，滿足市場監督快速篩查需求。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

3種有機磷和2種氨基甲酸酯類農藥參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量見表1，純度均≥98%。

丙酮（CH3COCH3）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、碘化乙酰硫代膽堿（C7H16INOS）。

pH 8.0緩沖溶液：分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鉀及3.2 g磷酸二氫鉀，溶解于1 000 mL水中，混勻。

顯色劑：分別取160 mg 5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氫鈉，用20 mL緩沖溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。

底物：取125 mg碘化乙酰硫代膽堿，加15 mL蒸餾水溶解，搖勻后置于4 ℃冰箱中保存備用。保存期不超過兩周。

乙酰膽堿酯酶4℃冰箱中保存備用。

1.2? 儀器和設備

恒溫水浴鍋、電子天平、分光光度計或相應商品化測定儀。

1.3? 原理

在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農藥的濃度呈正相關。正常情況下，酶催化神經傳導代謝產物（乙酰膽堿）水解，其水解產物與顯色劑反應，產生黃色物質，用分光光度計在412 nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率。

1.4? 方法

1.4.1? 試樣的提取

1）整株提取法。選取韭菜、芹菜等有代表性的樣品，擦去表面泥土，稱取試樣3 g置于表面皿中，加入10 mL緩沖液，殘缺面不得接觸緩沖液，輕輕振搖50次，靜置2 min以上，取上清液備用。

2）整體測定法。選取油菜、菠菜等有代表性的樣品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右見方碎片，稱取3 g放入離心管中，加入10 mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2 min以上，倒出提取液，靜置3～5 min，待用。

1.4.2? 對照液的測定? 先于反應管中加入3 mL緩沖溶液，再加入適量酶液、0.1 mL顯色劑，搖勻后于37 ℃水浴鍋中放置15 min。加入0.1 mL底物搖勻，立即測吸光度，3 min后再測定1次，記錄反應3 min的吸光度的變化ΔA0。

1.4.3? 樣品液的測定? 先于反應管中加入3 mL提取液，其他操作與對照液操作相同，記錄反應3 min的吸光度的變化ΔAt。

1.4.4? 結果判定

結果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。

式中，ΔA0為對照溶液反應3 min吸光度的變化值;ΔAt為樣品溶液反應3 min吸光度的變化值。

當抑制率≥50%時，表示蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留高于檢測限，判定為陽性，陽性結果的樣品需要重復檢驗2次以上。當檢測結果為陽性時，應采用其他分析方法進行確證，進一步確定農藥品種和含量。

2? 結果與分析

2.1? 乙酰膽堿酯酶ΔA0的優化

酶抑制法的結果是樣品溶液與對照溶液ΔA0的比值，因此，ΔA0對結果的準確性影響較大。對照溶液ΔA0的變化值過大或過小，有可能出現假陽性或假陰性的結果。為了考察ΔA0大小對酶抑制率的影響，本研究對比了ΔA0變化對陽性樣本的影響，結果見表2。經過多次試驗比較發現，僅ΔA0控制在0.2～0.3時，抑制率能真實反映樣品陽性結果，其余均為假陰性結果。

2.2? 恒溫裝置的選擇

孵育溫度是影響結果精密度的重要因素，部分儀器自帶恒溫裝置的溫控穩定性較差，為了考察不同恒溫裝置對反應的影響，本研究對比了空白溶液在儀器自帶恒溫裝置和恒溫水浴鍋中的反應效果。由表3可知，自帶恒溫裝置的吸光度相差較大，方差達到0.038，變化起伏超過平均值的16%，而使用恒溫水浴裝置的平行樣品吸光度差距不大，方差僅為0.002。研究發現儀器自帶恒溫裝置的溫控穩定性較差，比色槽溫度變化較大，導致反應結果的重現性較差，試樣在恒溫水浴鍋中的反應結果重現性很好，因此將恒溫水浴鍋用于后續的試驗研究。

2.3? 標準測試液的選擇

對有機磷和氨基甲酸酯類農藥的標準物質進行考察，發現每種農藥都微溶于水，易溶于丙酮，考慮到丙酮的用量對試驗結果有一定影響。因此，本研究用丙酮溶解標準物質，在對照溶液中添加丙酮使其含量分別為100%、10%、5%、1%、0%，測定反應體系反應3 min后的吸光度變化值ΔA，結果見表4。由表4可以看出，隨著體系中丙酮含量的增加，反應體系反應3 min后的吸光度不斷降低，表明丙酮能夠抑制酶促反應的進行，從而影響酶抑制率法測定蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥的結果。丙酮含量≤1%時，幾乎對酶促反應沒有影響，因此，配制標準溶液時，應將丙酮的含量控制在≤1%的范圍里。

2.4? 優化后方法的評價

采用優化后的方法由3家不同的機構對5種商品化的試劑盒進行驗證，驗證結果見表5。由表5可知，品牌A和品牌B兩種試劑盒的驗證結果性能優異，各項性能指標完全符合國家食藥總局發布的《食品快速檢測方法評價技術規范》（食藥監辦科〔2017〕43號）[10]的相關要求;其他3個品牌由于試劑盒質量的原因，性能指標不能達到國家規定的要求。

3? 討論

由于該方法在目前的監管工作中應用非常廣泛，有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測產品在國家總局統計的采購量中占30%以上，主要用于農貿市場、超市、批發市場等流通領域中蔬菜和水果的快速篩查。另外由于目前市場上商品化快檢試劑盒產品質量參差不齊，建議應用A類和B類快檢產品對其性能指標進行考察評價，符合該方法性能指標和評價準則各項要求后方可使用。

參考文獻：

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[5] 陳道勇，楊? 略，郭? 嘉，等.有機磷農藥殘留的分析檢測及最新研究進展[J].河南化工，2011（2）：7-12.

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[7] GB 2763-2016，食品安全國家標準? 食品中農藥最大殘留限量[S].

[8] GB/T 5009.199-2003，蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測[S].

[9] NY/T 448-2001，蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法[S].

[10] 食藥監辦科〔2017〕43號，食品快速檢測方法評價技術規范[S].