轉基因動植物生物反應器研究進展及應用現狀

廖 莎，李國玲，吳珍芳，李紫聰

（華南農業大學動物科學學院/國家生豬種業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642）

自1982年美國華盛頓大學Palmiter等［1］將大鼠生長激素基因導入小白鼠的受精卵里得到比正常體格大一倍的“超級老鼠”，以及在1983年研究出第一例轉基因作物煙草［2］以來，越來越多的科研人員開始進行轉基因的相關研究工作。經歷30多年的發展，隨著克隆技術和基因編輯技術逐漸發展成熟，轉基因動物和轉基因植物的研究變得更為廣泛，“轉基因”一度成為研究熱詞。轉基因動植物的應用主要包括品種改良、提高抗病能力、動物疾病模型、醫院器官移植、作為生物反應器等。隨著醫療科技的發展，人們對重組蛋白藥物的接受度增高，同時人們對這類藥用蛋白的需求量也持續增加，傳統生產重組蛋白的方法已經不能滿足人們的需求量，必須尋求更高效的生產藥用蛋白的方法，而轉基因動植物的出現為此提供了一個契機?？茖W家提出利用轉基因動植物的某些器官組織來表達外源目的蛋白，通過構建合適的載體，選擇適當的啟動子和調控序列可產生高于正常表達水平的重組蛋白，并能在活體動植物上持續不斷地收集純化出來，從而獲得大量目的蛋白。相較傳統生物反應器（微生物和細胞系統），利用轉基因動植物生物反應器生產藥用蛋白具有更廣闊的商業前景，因為轉基因動植物表達的外源蛋白活性高、質量好，產量高、易提純，且這些轉基因動植物可以不斷擴繁，源源不斷生產珍貴的藥用蛋白；其次，轉基因動物的制備成本相對較低，而生產的藥用蛋白大多都很昂貴且需求量大，因此經濟效益高，投資風險小。

至今，轉基因動植物生物反應器研究已經取得多項成果與突破，種類包括乳腺生物反應器（Mammary gland bioreactor）在內的7種動物生物反應器以及20多種植物生物反應器，從中獲得的藥用蛋白包括人乳鐵蛋白（Human lactoferrin，hLF）［3］、 人 血 紅 蛋 白（Human hemoglobin，hHb）［4］、凝乳酶［5］、溶菌酶［6］、人生長激素［7-8］、人表皮生長因子［9］、人凝血因子［10］、抗胰蛋白酶［11-12］、單克隆抗體［13-14］、作為疫苗的抗原蛋白等上百種人用或獸用蛋白。根據所需目的外源蛋白質不同的特點，科學家們選擇了不同的生物反應器［15］，從生產的角度考慮，生物反應器選擇的組織或器官要便于產物的獲得與應用。目前，該領域的很多研究已經進入臨床試驗階段，部分產品已獲批應用。

本文對轉基因動植物生物反應器的研究及其應用現狀進行綜述，討論不同類型生物反應器具有的優勢及存在的問題，以期為動物和植物生物反應器的深入研究提供參考。

1 轉基因動物生物反應器的研究及應用

1.1 轉基因動物生物反應器類型

1.1.1 乳腺生物反應器 哺乳動物乳腺生物反應器是目前應用最廣泛、研究最深入，且生產外源蛋白最多的，也是目前國際上最早證明可以達到商業化生產水平的動物生物反應器。乳腺生物反應器是利用轉基因動物的乳腺表達基因工程藥用蛋白。其原理是將外源蛋白基因連接到乳蛋白基因的調節元件下游，利用乳腺蛋白基因啟動子，使外源蛋白基因能夠在動物乳腺中特異性過表達，并分泌到乳汁中。早期，Gordon等［16］成功培育出在乳汁中表達具有天然活性的組織型纖溶酶原激活劑（Tissue-type plasminogen activator，tPA）的轉基因小鼠。但小鼠乳汁量少，主要作為模式動物進行研究，要進行產業化應用還得開發大型動物。至今，已有多種動物的乳腺生物反應器取得了巨大突破，包括兔、羊、牛、豬等，其表達的外源蛋白產量可觀。如1991年Wright等［11］利用轉基因綿羊生產藥用蛋白——人抗胰蛋白酶，在綿羊乳汁中該酶表達量可高達35 g/L。而Echelard等［17］建立了表達人血清白蛋白的乳腺轉基因牛群，其在乳汁中的表達量高達40 g/L，在表達量和表達規模上實現新突破。2015年Cui等［3］在轉基因豬乳中成功表達了人乳鐵蛋白（hLF）和人溶菌酶（ Human lysozyme，hLZ），表達量分別為6.502 g/L和1.102 mg/L，兩者可協同抗菌，在生產中可用于替代抗生素的作用。最近Chevreux等［18］在轉基因兔的乳汁中表達了一種新的重組人旁路因子VIIa （FVIIa）——LR769，可有效治療血友病。

相較于傳統生物反應器（微生物和細胞），乳腺生物反應器具有明顯優勢：一是其合成蛋白的能力強，生產的許多人類蛋白活性高且穩定；二是目的蛋白產量高而生產成本低，且易于收集，而微生物和細胞培養對條件要求高，需要大量昂貴的培養基持續供應，產物收集比較麻煩；三是對轉基因動物自身傷害小，因乳腺分泌的特點，其分泌的產物不會進入轉基因動物自身循環中，對其自身基本沒有影響；四是外源目的基因可以遺傳給下一代，獲得高水平表達目的蛋白的轉基因動物后，可通過人工授精、胚胎分割或體細胞克隆等方法對該轉基因動物進行擴繁，進而持續從這些陽性轉基因動物乳汁中獲得目的蛋白，有利于實現產業化發展，獲得巨大經濟利潤。當然，乳腺生物反應器也存在局限，如只有轉基因雌性動物在泌乳期才能收集目的蛋白，具有周期性；某些珍貴藥用蛋白仍無法表達；乳蛋白總量高、種類多，對純化目的蛋白存在一定干擾等。因此，乳腺生物反應器在向產業化發展的過程中也催發了其他生物反應器的研究進程。

1.1.2 血液生物反應器 外源基因在血液中表達的轉基因動物被稱為血液生物反應器。外源基因編碼產物可直接從血清中分離出來，血細胞組分可通過裂解細胞獲得。由于血液循環系統與動物的生理活動密切相關，對于某些蛋白因子存在一定的生產限制，利用血液生物反應器只能生產一些對轉基因動物健康影響不大的蛋白因子等。例如，Swanson等［4］利用轉基因豬血液系統成功表達了人血紅蛋白；李維納等［19］利用原核顯微注射法建立了血液中表達人α干擾素的轉基因老鼠；Massoud等［12］則利用轉基因兔血液獲得了重組人抗胰蛋白酶。這類蛋白因子都是血液中本身存在的，對轉基因動物的健康不會產生很大影響，有利于對目的蛋白的持續收集。其中大家畜的血液容量較大，更有利于生產。在血液中表達外源蛋白因子可能存在分離純化困難的問題，可通過敲除內源基因等方式排除高同源性內源蛋白的干擾，使轉基因動物將外源基因遺傳下去，擴大群體，將有利于向產業化發展。

1.1.3 膀胱生物反應器 外源基因在膀胱中表達的轉基因動物被稱為膀胱生物反應器，通過收集轉基因動物的尿液來獲得目的蛋白。膀胱生物反應器的研究目前相對較少，但其作為生物反應器所具有的優勢不可忽略：一是尿液產量大、收集方便且不會傷害到轉基因動物；二是膀胱生物反應器無周期和性別的限制，在任何時期，雌雄動物均可通過尿液收集目的蛋白；三是外源基因的表達產物基本不會進入血液循環，對轉基因動物自身影響??；四是從尿中提取蛋白更容易，因為尿液中含有的蛋白種類及其他雜質相對較少易于純化。已有報道利用小鼠膀胱表達人生長因子，結果顯示該基因在膀胱中的表達表現出很高的專一性［20］，證明了膀胱作為生物反應器生產外源蛋白具有可行性。Zbikowska等［21］利用尿調節蛋白啟動子指導人重組促紅細胞生成素在轉基因鼠尿中表達，表達量達到6 mg/L。然而遺憾的是，能確定在膀胱中特異表達的藥用蛋白種類并不多，還需要研究者們進一步探究。

1.1.4 唾液腺生物反應器 唾液腺生物反應器是外源基因在唾液腺中特異表達的轉基因動物，通過收集轉基因動物唾液獲得目的蛋白。同膀胱生物反應器類似，唾液腺作為生物反應器的報道相對較少，但是其具有沒有性別及生長周期的限制、易于收集純化等優點，因此也是生產外源蛋白較好的生物反應器。唾液腺可以特異性表達某些重要外源蛋白因子及酶類，如神經生長因子、植酸酶等。1992年Mikkelsen等［10］利用小鼠PSP（Parotid secretory protein ）基因啟動子成功在轉基因小鼠唾液中特異性表達人凝血因子Ⅶ。最近曾芳等［22］已經成功從轉基因小鼠的唾液中制備獲得人源神經生長因子并證明了其生物活性。之前Golovan等［23］曾利用豬唾液腺成功表達了植酸酶，使飼料中磷的利用率得到提高，同時降低了豬糞便中的磷含量，減少了對環境的污染，該研究也表明可以用豬唾液腺獲取高產量藥用蛋白。前期研究的成功也為后續研究的可行性提供了有利證明。

1.1.5 家禽輸卵管生物反應器 家禽輸卵管生物反應器主要是讓目的蛋白在輸卵管中特異表達，并能在禽蛋中收集。家禽輸卵管能為一些外源蛋白提供正確的翻譯后修飾，且禽蛋產量高、周期短，蛋清成分也相對簡單，易于純化分離外源目的蛋白。目前主要研究的是雞輸卵管生物反應器。外源基因表達產物在輸卵管特異表達后轉入蛋中，不會進入到轉基因雞的循環系統中；還可通過制備SPF（Special pathogen free）雞來避免人畜共患病的風險，是比較理想的生物反應器，具有巨大潛在商業價值。中國農業大學的Cao等［6］構建了慢病毒載體，顯微注射入雞胚X期胚盤下腔，成功獲得了人溶菌酶表達量高達57.66 μg/mL的轉基因雞。Park等［9］成功獲得在輸卵管表達人表皮生長因子的轉基因雞。最近Kwon等［24］也成功獲得在輸卵管特異表達人類促紅細胞生成素（hEPO）的轉基因雞。雞輸卵管生物反應器的研究雖已取得較大進展，但還未與定點整合、穩定遺傳的轉基因技術很好地結合起來，其中發展相對較為成熟的逆轉錄病毒法也還存在一定安全風險和效率低下等問題，要想實現產業化，制備轉基因家禽的技術還有待進一步研究和優化。

1.1.6 其他類型動物生物反應器 其他類型的動物生物反應器還有精囊腺和家蠶等。對于某些動物（如豬）而言，精液是量相對較大的體液，利用精囊腺也可以特異表達某些外源蛋白。Dyck等［8］證明了小鼠雄性附屬性腺特異性啟動子P12基因可用于生產在精囊上皮細胞中表達人生長激素的轉基因小鼠，該轉基因小鼠的精液中的人生長激素濃度可達0.5 mg/mL。宋成義等［25］成功以豬精漿蛋白Ⅱ基因啟動外源目的蛋白或多肽在精囊腺中特異性表達并分泌到精液中，通過收集精液獲取目的蛋白。因表達的目的產物不會進入轉基因動物的血液循環等，對轉基因動物的健康影響不大，因此精囊腺作為生物反應器具有巨大的潛在利用價值。但目前研究相對較少，表達的外源蛋白也有限，實現產業化較為困難。

轉基因家蠶生物反應器是在家蠶絲腺中表達外源基因，在蠶繭中收集目的蛋白。主要利用家蠶的桿狀病毒（BmNPV）表達系統結合piggyBac轉座子介導法進行操作來表達外源蛋白。該方法能高效整合外源基因，并在家蠶體內穩定高水平表達。家蠶生長周期短，經馴養、選育已難以逃逸到自然界，其在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強的能力，合成的蛋白可隨蠶絲蛋白一起分泌到體外。Song等［26］利用轉基因家蠶絲腺制備的類胰島素生長因子（Human insulin-like growth factor-Ⅰ，hIGF-Ⅰ）有效降低I型糖尿病小鼠的血糖水平。Wang等［27］成功制備了能在蠶繭中高水平表達重組人酸性成纖維生長因子（Recombinant human acidic fibroblast growth factor，r-haFGF）的轉基因蠶，且證明了其產物的生物活性。利用家蠶生物反應器生產藥用蛋白也將會是一種有效途徑，相關研究已開展臨床試驗。

1.2 轉基因動物生物反應器應用現狀

人們對于各類藥用蛋白的需求日益增加，促使生物反應器制備藥用蛋白開始向產業化發展。目前，進入臨床試驗的動物生物反應器生產的藥用蛋白已達上百種，部分轉基因動物生物反應器制得的藥用蛋白已獲批生產上市。

1.2.1 已獲批上市的動物生物反應器 目前，已知獲批上市的轉基因動物乳腺生物反應器主要有兩個。一個是世界上第一個利用轉基因動物乳腺生物反應器生產的基因工程蛋白藥物——重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）。2006年該藥首次獲得了歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）人用醫藥產品委員會的上市批準，隨后在2009年獲得了美國食品與藥品管理局（Food and drug administration，FDA）的上市批準。該藥是GTC Biotherapeutics生物公司利用轉基因山羊的乳腺作為生物反應器表達獲取的，其主要成分重組人抗凝血酶Ⅲ具有抑制血液中凝血酶活性，預防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。他們現在僅用幾十只轉基因山羊就能生產出全世界1年需求的抗凝血酶Ⅲ。該藥品的上市掀起制藥業的一場革命，開辟生物制藥業的新紀元。轉基因動物乳腺生物反應器制藥將逐漸取代低效的細菌發酵制藥和高成本的哺乳動物細胞制藥，成為最主要的基因工程制藥技術。

另一個是荷蘭Pharming公司研發的轉基因兔乳中生產的重組人C1抑制劑（Recombinant human C1 esterase inhibitor protein，rhC1INH，商品名：RUCONEST），該轉基因藥用蛋白于2010年被EMA批準上市，2014年被美國FDA批準上市。RUCONEST主要適應癥包括治療成年人及青少年遺傳性血管性水腫以及功能延遲恢復缺血性再灌注損傷。另外該藥也正在進行針對治療2～13歲的兒童遺傳性血管水腫和急性發作血管性水腫的Ⅱ期臨床試驗研究。

另外，Alexion Pharmaceuticals公司利用雞輸卵管作生物反應器生產的用于治療溶酶體酸性脂肪酶缺乏癥（Lysosomal acid lipase deficiency， LAL-D）的藥物Kanuma，目前已被FDA、歐盟以及日本批準上市。Kanuma是一種重組人溶酶體酸性脂肪酶（Recombinant human lysosomal acid lipase，rhLAL）蛋白，在轉基因雞蛋的蛋白中提取制備。這是除了乳腺生物反應器以外新獲批上市的動物生物反應器，預示著未來也許將有更多動物生物反應器獲批生產應用。

1.2.2 已批準進行臨床試驗階段的動物生物反應器 國外多家公司利用轉基因動物乳腺生產的多種藥用蛋白已經取得了前期試驗的成功，進入了臨床研發階段，其中幾家上市公司尤為突出。

GTC公司（后被LFB公司收購）除了已獲批的人抗凝血酶外，還有利用羊乳腺生產的甲種胎兒球蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP，MM-093）進行了對自身免疫疾病的臨床Ⅱ期試驗。另外，生產的用于治療肺纖維囊腫的抗胰蛋白酶（AAT）、治療燒傷和血量擴積的血清白蛋白、單克隆抗體CD20和CD137（4-1BB）以及瘧疾疫苗均已基本完成臨床前期階段；利用兔乳生產的人凝血因子Ⅶα已進入了臨床Ⅲ期試驗。

荷蘭Pharming公司除了已獲批上市的RUCONEST以外，還有利用奶牛乳腺作生物反應器生產的乳鐵蛋白，目前已基本完成臨床前期試驗階段，主要應用于營養制劑；利用轉基因兔和轉基因牛乳腺生物反應器生產的膠原蛋白等也進入了臨床前期試驗階段。

英國PPL公司利用綿羊乳腺生物反應器生產的抗胰蛋白酶已完成臨床Ⅲ期試驗，生產的血纖維蛋白原進行臨床Ⅲ期試驗，生產的蛋白C進入臨床Ⅰ期試驗。PharmAthene公司利用轉基因山羊乳腺生物反應器生產的丁酰膽堿酯酶（Protexia—butyrylcholinesterase）在治療有機磷中毒上已進入臨床Ⅰ期試驗，在治療老年癡呆上已進入臨床前期試驗。BioSidus公司利用轉基因山羊乳腺生物反應器生產的生長激素已進入臨床Ⅰ期試驗。ProGenetics公司利用豬乳腺生物反應器生產的人凝血因子Ⅸ完成臨床前期試驗。

而在國內，獲批試驗的生物反應器生產的藥物極少，大部分研究還處在臨床前的探索階段。主要由于一些哺乳動物研究周期相對較長，存在技術上的挑戰，國內審核也較為謹慎，因此產業化進展緩慢。但在一些研發周期較短且研究技術成熟的動物上也取得了一些產業化進展。例如，張耀洲等［28］完成了利用家蠶蛹生物反應器生產的人粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子（Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, hGM-CSF）口服給藥的臨床前安全性評價；2010年浙江大學的張文平等［29］完成了該研究的Ⅰ期臨床試驗，實現了在國內外首次以家蠶作為生物反應器生產人用生物制品的突破。

動物生物反應器生產重組蛋白的優勢以及帶來的經濟價值，不斷推動動物生物反應器制藥向前發展，國內外各大生物科技公司及相關科研機構將繼續對轉基因動物生物反應器生產藥物蛋白進行新的研究與試驗，未來將會有更多動物生物反應器生產的重組藥用蛋白獲批應用。

2 轉基因植物生物反應器的研究及應用

2.1 轉基因植物生物反應器概述

植物作為真核表達系統，可以表達具有生物活性的人類或動物蛋白，因此在生物反應器研究領域也一直是研究熱點。植物生物反應器廣義上指以植物懸浮細胞培養或整株植物為工廠大量生產具有重要功能的蛋白質，如人或動物用疫苗、抗體和重要的氨基酸等。與其他生物反應器（微生物生物反應器和動物生物反應器）相比，植物細胞具有全能性，能夠再生植株且易于成活，用作生物反應器具有成本更低、周期更短、安全性好、利于規?；a以及表達產物具有與高等動物細胞一樣的免疫原性和生物活性等優點，且不存在有關轉基因動物倫理道德的問題。早在20世紀80年代末，人們在研究動物生物反應器的同時也將目光放在了植物生物反應器上。1986年Barta等［30］在煙草和向日葵中將激素與農桿菌胭脂堿合成酶進行融合表達，實現了首次使用植物表達系統生產藥用蛋白；1989年Hiatt等［13］第一次使用煙草表達抗體；1997年Curtiss等［31］利用轉基因煙草表達鏈球菌變異株SpA蛋白（一種表面蛋白抗原），這是第一例利用植物表達系統生產疫苗。之后陸續有研究報道了各種轉基因植物生物反應器生產疫苗、抗體、激素因子等外源產物，至今已有大約20多種植物被用作生物反應器，產物種類近百種。根據產物需求的不同，選擇哪一種植物作為生物反應器是研究者們首先要考慮的問題，目前農作物是應用比較多的一類植物生物反應器。

2.2 植物生物反應器應用現狀

2.2.1 生產疫苗 目前植物生物反應器生產疫苗是一個比較熱門的研究方向。傳統疫苗生產和純化過程較為復雜和昂貴，在運輸和儲存過程中必須冷藏，這進一步增加了疫苗生產的下游成本。用轉基因植物作生物反應器生產疫苗具有可當地種植、常溫儲藏的天然優勢，將降低疫苗制作的下游成本。煙草是較早開始研究的轉基因植物，常作為研發疫苗等外源蛋白表達的模式植物。利用煙草作生物反應器生產目的蛋白的研究最為廣泛，用它表達的疫苗種類多達20種以上，包括如抗登革熱病毒［32］、霍亂毒素［33］、狂犬病病毒［34］、鼠疫桿菌［35］等。除了煙草，還有如擬南芥等植物作為植物生物反應器開發疫苗的模式植物，用以表達的疫苗有豬瘟病毒［36］、豬繁殖與呼吸綜合征病毒［37］、人輪狀病毒［38］疫苗等。

與不能直接食用的植物生物反應器生產疫苗相比，可食用植物生產疫苗更具有優勢和應用前景。利用植物可食用部分表達疫苗抗原蛋白，通過直接口服的方式獲得抗原蛋白，使機體產生免疫效應，稱之為“口服疫苗”。經研究證明，“口服疫苗”食用后可同時引起粘膜免疫反應與血清免疫反應，在消化道內植物細胞壁能夠保護疫苗抗原不被消化酶降解，直到腸道微生物降解植物細胞壁后，抗原被釋放出來，引發免疫反應［39］。與傳統注射疫苗免疫相比，“口服疫苗”具有更多優勢，我們可以通過吃蔬菜、水果等植物性食品就可以獲得免疫抗體，養殖的動物也可以通過飼喂的方式進行防疫工作，節省了注射疫苗的成本和勞力等。該新型簡單有效的免疫接種方式一出現就成為科學家們關注的熱點。已報道轉化成功的口服疫苗植物有番茄［40］、馬鈴薯［41］、萵苣［42］、胡蘿卜［43］、花生［44］、玉米［45］、菠菜［46］、白三葉草（畜禽飼喂）和苜蓿［47］等。對于人而言，考慮到有些植物不能直接生食（如馬鈴薯），而加熱可能破壞免疫原蛋白，研究口服疫苗更趨向于利用可直接生食的植物，如番茄、蘋果、花生、香蕉和胡蘿卜等。對于家畜的飼用疫苗，可選用苜蓿、大豆和玉米等作為受體植物，使抗原蛋白積累于種子、葉子等天然蛋白貯藏器官中或整株植物體中。最近，Bertini等［48］用菠菜和紅甜菜作生物反應器制備谷氨酸脫羧酶（GAD65），用于預防自身免疫疾?、裥吞悄虿?，證明紅甜菜效果更佳。諸多研究成果推動了“口服疫苗”臨床應用的發展。

目前，已有十多種疫苗獲批應用或進行臨床試驗。如美國陶氏益農（Dow AgroSciences）公司利用煙草生產新城疫病毒的疫苗已被美國農業部批準使用，該疫苗是第一個獲得批準的用于預防禽類的新城疫病毒的獸用植物疫苗。由美國Bayer Innovation公司研發的用煙草制備的治療非霍奇金淋巴瘤癌癥疫苗已進入臨床Ⅲ期試驗。Medicago公司利用煙草、馬鈴薯、番茄、玉米、萵苣、菠菜等植物研發的H5N1疫苗已完成臨床Ⅱ期試驗［49］。由美國Arizona State大學研發的利用馬鈴薯制備的乙肝疫苗抗原已經進入臨床Ⅱ期試驗，利用馬鈴薯和番茄制備的Norwalk病毒衣殼蛋白進入臨床Ⅰ期試驗。Thomas Jefferson大學利用萵苣和菠菜分別研發的乙肝疫苗抗原和包含狂犬病抗原表面的融合蛋白已進入臨床Ⅰ期試驗。Guardian biosciences公司利用油菜籽研發的抗球蟲病的家禽疫苗進入臨床Ⅱ期試驗等。利用植物生產疫苗正越來越受到關注，就目前取得的成果來看，植物來源的疫苗有廣闊的應用前景。

2.2.2 生產抗體 為更好地利用植物生物反應器解決藥物生產量的不足及快速免疫問題，科學家采用的另一個策略是利用植物表達特定抗體。將編碼全抗體或抗體片段的基因導入植物，即可在植物中表達出具有功能性識別抗原及具有結合特性的全抗體或部分抗體片段；植物細胞不但可以對表達的重組抗體蛋白進行正確的組裝和后期加工，其表達產物能保持良好的生物學特性，而且植物表達的抗體以二聚體形式存在，表達產物的親和力高，有助于全面發揮抗體的功能。2000年St?ger等［50］利用谷類（水稻、小麥）成功表達了針對癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen ，CEA）的單鏈Fv抗體，表達量達30μg/g，實現了從煙草等模式植物系統到谷物類農作物的轉變。2005年Hull等［14］利用煙草成功制備了治療炭疽的單克隆抗體。近年來也有許多科學家利用植物制備了具有生物活性的抗體。如Phoolcharoen等［51］在煙草中瞬時表達狂犬病中和單鏈抗體和狂犬病病毒肽融合蛋白，該蛋白可穿過纖維素血腦屏障去中和狂犬病毒，可為狂犬病提供更有效的緊急預防。Julve等［52］利用煙草成功制備重組蛇毒多克隆抗體，可用于制備低成本抗蛇毒血清抗體。在臨床應用研究方面，美國PB（Planet Biotechnology）公司利用煙草研發的單克隆抗體（CaroRxTM），主要應用于阻止導致蛀牙的細菌對牙齒的粘附，有預防齲齒的作用［53］，目前已被歐盟批準應用。CIGB公司用煙草研發的用于B型肝炎疫苗試劑的純化的重組單克隆抗體已被古巴批準上市。NeoRx/Monsanto公司利用玉米研制的癌癥抗體進入臨床Ⅱ期試驗；Bayer Innovation公司利用煙草研制的治療非霍奇金淋巴瘤的IgG抗體已進入臨床Ⅰ期試驗；Pharma-plantaconsortium公司利用煙草研發的預防艾滋病的抗體2G12已獲批進入臨床Ⅰ期試驗階段［54］；Biolex公司利用浮萍作生物反應器研發的Anti-CD20單克隆抗體用于治療非霍奇金淋巴瘤，目前已準入臨床前期試驗；Thomas Jefferson大學利用生菜研發的B型乙肝表面抗體開展臨床Ⅰ期試驗。美國Mapp公司利用轉基因煙草表達了3種抗埃博拉病毒的人鼠嵌合單克隆抗體mAbs進行“雞尾酒”療法，該試驗性抗體藥物名為ZMapp，2014年8月《Nature》報道了該藥治愈了18只感染埃博拉病毒的恒河猴［55］，為抗埃博拉藥物研發帶來了新希望。

總之，利用轉基因植物生產抗體已取得許多成效，對未來制備低成本、高產量的特異性抗體提供了新思路、新途徑，更多治療性抗體有待研究人員進一步研究。

2.2.3 生產其他藥用蛋白 利用植物作為生物反應器，除了用于生產了那些傳統方法難以獲得的疫苗抗體外，還表達了其他類型的藥用蛋白，如各種酶制劑［56］、激素［7］、血蛋白［57］、生理營養因子［58］等。首先實現商業化生產的植物源藥用蛋白是以色列藥品研發公司Protalix開發的在胡蘿卜細胞中表達的葡糖腦苷脂酶，于2012年被美國FDA批準上市，主要用于治療β-葡萄糖腦苷脂酶減少或缺乏引起的一種遺傳代謝病高雪氏?。℅aucher’s disease），其價格要比天然來源的藥物更便宜。此外，已獲批上市的還有ProdiGene公司和Kentucky BioProcessing公司分別利用玉米和煙草研發的抑肽酶，以及ProdiGene公司利用玉米研發的抗生物素蛋白（Avidin）和β-葡糖醛酸酶（GUS），Ventria Bioscience公司利用玉米和水稻研發的重組人乳鐵蛋白（Lacromin），加拿大SemBioSys公司利用紅花（safflower）研發的蝦飼料添加劑Immunosphere，ORF Genetics公司利用大麥研發的人生長因子ISOkine、DERMOkine，Meristem Therapeutics公司利用玉米研發的治療囊性纖維化的胃脂肪酶，Cobento AS公司利用擬南芥研發的人內因子（用于治療維生素12缺乏）等均已獲批上市銷售。另外也有多家公司研發的其他轉基因植物表達的藥用蛋白獲批臨床試驗，如SemBioSys公司已于2008年開始用植物（紅花種子）制胰島素進行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，目前已進入臨床Ⅲ期試驗；還有Protalix公司利用胡蘿卜細胞研發的乙酰膽堿酯酶已進入臨床Ⅰ期試驗等。除了這些已獲批臨床試驗的植物源人用蛋白，還有許多其他相關研究在開展臨床試驗前的準備工作。與動物生物反應器相比，植物生物反應器的產業化進展似乎推進得更快。

3 展望

近幾十年來，基因工程藥物產業蓬勃發展。全球生物技術公司總數已近5 000余家，上市公司有600余家，銷售總額近400億美元，其中生物技術藥物占總銷售額的70%。就目前已上市的轉基因生物反應器的產品銷售額來看，因需求增加，預計銷售額將持續增加。雖然轉基因生物反應器取得了許多巨大的成果，但是仍然有許多問題需要面對和解決。首先，對于轉基因動物生物反應器而言，存在理論和技術尚有不完善之處：一是非定點整合技術（如piggyBac轉座子介導）存在目的基因整合位點的不確定性，不能完全保證在預期位點，有可能出現片段缺失、調節失控、遺傳不穩定等問題，而新型定點打靶基因編輯技術，如鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）技術［59］、類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcriptional activator like effector nuclease，TALEN）技術［60］、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術［61］也有打靶效率較低、脫靶的問題；二是轉基因動物的克隆效率低，尤其是較大的哺乳動物，低下的體細胞克隆效率極大地阻礙了轉基因動物的生產，要獲得更多轉基因動物必然會增加時間和資金的投入成本；三是安全性問題，插入外源基因首先是存在轉基因動物逃逸繼而污染野生型基因的風險，其次是轉基因動物生物反應器產物可能存在免疫原性問題以及人畜共患病等風險；四是動物生物反應器產物的收集與純化技術的問題，既要保證收集純化到足量的目的產物，又要確保對轉基因動物不會有太大影響，要同時滿足這些要求對動物生物反應器的選擇是個挑戰。

對于轉基因植物生物反應器而言，存在的主要問題有：一是表達產物的量普遍偏低［62］，增加了下游加工的成本，很難實現產業化水平，同時在生產疫苗應用方面，表達量低下可能導致免疫耐受問題；二是免疫原性問題，因為植物的糖基化與動物的有差異，某些植物源性的藥用蛋白可能會使人產生過敏反應［63］；三是植物表達系統針對性強，由于不同植物和不同組織的生理差異較大，因此單一的表達系統只適合生產幾種甚至一種目標產品。在應用過程中不同植物生物反應器存在一定差異，如何選擇最適表達系統是成功生產植物生物反應器藥用蛋白的重要一環；四是有安全性問題，轉基因植物要防止被動物誤食或帶出實驗室進而污染外界野生型植物基因。

目前被真正批準生產應用的動植物生物反應器并不多，而限制動植物生物反應器產業化應用的原因主要是因為轉基因產品一直存在爭議，公眾的輿論讓政府審批也很保守，轉基因藥品的產業化與批準上市涉及多個監管部門，特別是我國相關領域監管空白，法規政策缺乏，轉基因藥品產業化更是落后。另外未將藥品審評與動物審評主管部門集中在一起，導致相應的工作難以協調。但隨著日益發展的科技，相信科學家們能一步一步解決理論與技術上存在的問題，不斷完善轉基因動物生物反應器的制備方法，提高轉基因藥用蛋白的產量。轉基因動植物生物反應器生產藥用蛋白等產品具有光明前景，相信能為企業、為國家贏得更大利潤的同時，也為患者謀得福音。