PCR技術在布魯氏菌檢測與鑒別中的應用

秦立得，南文龍，陳義平

（中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

布魯氏菌?。˙rucellosis，以下簡稱布?。┦怯刹剪斒暇˙rucella）引起的一種人獸共患病。布魯氏菌分為10個種型：6種經典型菌種，即羊種、牛種、豬種、綿羊附睪種、沙林鼠種和犬種；4種新發現種型，即B.microti、B.ceti、B.inopinata和B.pinnipedialis[1-2]。它們可感染豬、牛、犬、羊、鼠、駱駝等多種哺乳動物，其中羊種、牛種和豬種可感染人。

常用的布魯氏菌病原檢測方法包括布魯氏菌分離培養和分子生物學方法[3]。布魯氏菌分離培養是布魯氏菌檢測和種型區分的金標方法，但該方法耗時長，并需要在生物安全三級實驗室中進行[4]。分子生物學病原檢測技術具有安全可靠、靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點，已開始在布魯氏菌檢測中推廣應用[5-6]，其中研究最多的是聚合酶鏈式反應（PCR）方法。PCR方法已廣泛應用于布病診斷、環境及動物產品的布魯氏菌檢測、布魯氏菌分型等方面，能從全血、血清、組織、體液等多種樣品，以及牛奶、奶酪、生肉等食品中檢出布魯氏菌，而且能從患病初期血清學陰性樣品中檢出病原，從而彌補了血清學檢測方法的不足[7]。

1 通用型布魯氏菌PCR檢測方法

通用型布魯氏菌PCR檢測方法包括普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR等。1990年，Fekete等[8]首先開發出檢測布魯氏菌的PCR方法，證明PCR方法具有靈敏度高、特異性強的優點。通用型布魯氏菌PCR檢測方法常檢測的保守基因包括16S-23S rRNA基因[9]、omp2基因[10]、bcsp31基因[11]、IS6501（IS711）重復序列[12]和per基因[13]等。大量的比對驗證表明，這些基因檢測結果的敏感性存在差異。

2007年，Manal等[14]使用bcsp31基因引物（B4/B5）、omp2基因引物（JPF/JPR）和16S-23S rRNA基因引物（F4/R2），檢測147份陽性血清和50份陰性血清。結果顯示，這3對引物檢測結果的特異性強，但敏感性存在差異。其中：B4/B5引物敏感性最高為98%（144/147），最低檢出限為700 CFU/mL；JPF/JPR引物敏感性為88.4%（130/147），最低檢出限為7×105CFU/mL；F4/R2引物敏感性為53.1%（78/147），最低檢出限為7×107CFU/mL。

2009年，Bounaadja等[15]根據IS711、bcsp31和 per基因，建立了3種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，并與檢測相同基因的普通PCR和巢式PCR方法進行了比對試驗。結果顯示，上述熒光定量PCR方法較普通PCR和巢式PCR方法靈敏度提高了50～500倍，IS711、bcsp31和 per基因熒光定量PCR方法最低檢出限分別為0.2、2和2 fg布魯氏菌基因組，但這3種方法在檢測不同種型布魯氏菌時存在敏感性差異。

2 不同種型布魯氏菌PCR檢測鑒別方法

2.1 多重PCR

多重PCR是布魯氏菌種型檢測與鑒定的常用方法。1994年，Bricker等[16]根據高度保守的IS711重復序列在不同種型布魯氏菌基因組中的數量和分布特點，設計了通用型IS711引物和不同種型布魯氏菌引物，建立了能同時檢測1型、2型和4型牛種布魯氏菌，羊種布魯氏菌，綿羊附睪種布魯氏菌和1型豬種布魯氏菌的多重PCR（AMOS PCR）。隨后Bricker等[17]又在上述方法中增加了兩對引物，使該方法能夠區分牛種布魯氏菌疫苗株S19株和RB51株。2000年，Ewalt等[18]使用AMOS PCR方法檢測經分離培養確定為牛種布魯氏菌的231份樣品，發現檢測結果與布魯氏菌分離培養鑒別結果一致。目前，AMOS PCR已得到廣泛認可，并在布魯氏菌檢測、種型鑒別和流行病學調查中得到廣泛應用。

近年來多重PCR方法在AMOS PCR的基礎上又有了進一步發展。2006年，García-Yoldi等[19]開發出能區分經典型布魯氏菌種型和亞種，牛種布魯氏菌疫苗株S19和RB51，以及羊種布魯氏菌疫苗株Rev1的多重PCR。2009 年，Huber等[20]開發出不僅能實現之前此類多重PCR檢測的效能，并能區分牛種布魯氏菌1、2、4型與 3、5、6、9型，豬種布魯氏菌1、3、4型與2、5型的多重PCR。2010年，Mayer-Scholl等[21]進一步完善了該方法，設計了能檢測區分包括B.microti、B.inopinata、B. ceti和B.pinnipedialis在內的目前已知的所有種型布魯氏菌多重PCR方法。

2.2 不同種型熒光定量PCR

最初建立的布魯氏菌不同種型檢測與鑒別熒光定量PCR方法的目的基因，往往選擇經多重PCR方法確認的相應序列，由此開發出了牛種、豬種和羊種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法。2007年，Ai Dahouk等[22]對比了2種羊種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法、3種牛種布魯氏菌和1種豬種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，檢測了248份已知樣品（包括各型布魯氏菌菌株、臨床分離布魯氏菌菌株和68株其他菌株）。檢測結果表明：這些方法特異性強，與檢測同種布魯氏菌的熒光定量PCR方法靈敏度相同，其中羊種布魯氏菌基因組最低檢出限為16 fg，豬種為100 fg，牛種為18 fg；檢測敏感性存在差異，羊種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法可檢測所有種型羊種布魯氏菌樣。Redkar等[23]開發的牛種和豬種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法只能單獨檢測1型、2型、4型和部分6型牛種布魯氏菌和1型豬種布魯氏菌。

隨著對布魯氏菌全基因序列的深入研究，布魯氏菌的不同種型和生物型的特異性核酸多態性位點或特異性序列相繼被發現，并依此開發了相應的熒光定量PCR檢測鑒別方法。

2008年，Hini?等[24]根據不同種型布魯氏菌特異性序列，建立了通用型布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，羊種、豬種、牛種、綿羊附睪種、沙林鼠種和犬種6種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，通過樣品檢測發現，只有豬種、沙林鼠種和綿羊附睪種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法特異性強。

2010年，Winchell等[25]分析總結出7種布魯氏菌的特異性單核氨酸多態性位點，建立了能檢測區分羊種、豬種、綿羊附睪種、沙林鼠種、犬種和感染海洋生物的布魯氏菌（B.ceti和B.pinnipedialis）的熒光定量PCR方法，證明以上方法的最低檢測限分別為100、1、100、10、100和10 fg布魯氏菌基因組；使用以上方法檢測153份樣品，證明這些方法具有良好的特異性和敏感性。

2015年，Vahhab等[26]根據牛種和羊種布魯氏菌的種特異性核酸位點，建立了能檢測區分牛種和羊種布魯氏菌的熒光定量PCR方法，發現該方法對牛種和羊種布魯氏菌基因組最低檢出限均為1.5 pg；使用該方法檢測160份臨床樣品和17株非布魯氏菌菌株，證明其具有良好的特異性和敏感性。

2016年，Kim等[27]發現牛種布魯氏菌基因組種特異性突變位點，建立了能檢測并區分牛種布魯氏菌的熒光定量PCR方法，發現該方法最低檢出限為20 fg或4 CFU牛種布魯氏菌基因組；使用該方法檢測296株已知布魯氏菌菌株和8株非布魯氏菌菌株，結果檢測出了所有牛種布魯氏菌菌株。

2017年，Kaden等[28]發現羊種布魯氏菌基因中存在種特異性核酸缺失，以此建立了能檢測區分羊種布魯氏菌的熒光定量PCR方法，發現該方法最低檢測限約為6.25個布魯氏菌基因組；使用該方法檢測120份人類臨床分離羊種布魯氏菌、37株布魯氏菌代表型菌株和45株非布魯氏菌菌株，證明其具有良好的特異性和敏感性。

2.3 不同生物型熒光定量PCR

2015年，H?nsel等[29]發現豬種布魯氏菌1～4型有特異性重復序列，而后建立了能檢測豬種布魯氏菌1～4型熒光定量PCR方法，發現該方法最低檢測限為12.5 fg布魯氏菌基因組DNA；使用該方法檢測25份各種型布魯氏菌基因組樣品、75份已知豬種布魯氏菌分離株樣品和30株非布魯氏菌樣品，發現該方法特異性強，對布魯氏菌1～4生物型檢出率為95%。

2.4 其他PCR方法

1996年，Ouahrani-Bettache等[30]根據IS711序列在不同種型布魯氏菌基因組中分布的多態性，建立了能區分多種布魯氏菌和疫苗株B19的錨定PCR方法。2012年，Mirnejad等[31]設計能同時檢測區分牛種和羊種布魯氏菌的PCR方法（RFLPPCR），通過對PCR產物進行限制性內切酶酶切，可進一步分析結果。此外，將限制性片段長度多態性分析、多位點可變數目串聯重復序列分析、隨機擴增多態性DNA技術、芯片技術等與PCR技術相融合并應用于布魯氏菌種型或菌株的檢測與鑒別，都取得了理想的效果。

3 布魯氏菌疫苗菌株PCR檢測鑒別方法

接種弱毒疫苗是控制布病的有效方法。常見的疫苗包括牛種布魯氏菌19（S19）、4520（4520）疫苗，羊種布魯氏菌Rev.1疫苗，豬種布魯氏菌S2疫苗，粗糙型牛種布魯氏菌株51（RB51）疫苗等。目前，多種布魯氏菌弱毒疫苗在我國布病防控中發揮了積極作用，但也出現了干擾診斷等問題，而PCR方法可區分弱毒疫苗株與野生型菌株。

3.1 普通PCR

1994 年，Sangari等[32]發現牛種布魯氏菌弱毒疫苗株 B19存在702 bp的基因缺失，并依此設計了檢測B19弱毒疫苗株的PCR方法。1999 年，Vemulapalli等[33]發現牛種布魯氏菌弱毒疫苗株RB51存在特異性的IS711基因插入，因此建立了能檢測弱毒疫苗株RB51的PCR方法。2002 年，Cloeckaert等[34]發現羊種布魯氏菌弱毒疫苗株Rev.1存在特異性基因突變，設計了能檢測Rev.1弱毒疫苗株的PCR方法。此外，還將上述布魯氏菌疫苗菌株普通PCR檢測方法有效整合于布魯氏菌快速檢測和分型的多重PCR方法中[18-21]。

2014年，Nan等[35]建立能檢測區分豬種布魯氏菌弱毒疫苗株S2的雙重PCR方法，發現檢測豬種布魯氏菌1型時產生285 bp條帶，檢測S2時產生285和497 bp兩條帶。該方法最低檢出限為27 fg豬種布魯氏菌1型菌株基因組和60 pg S2弱毒疫苗株基因組。

3.2 熒光定量PCR

2016年，Nan等[36]發現牛種布魯氏菌弱毒疫苗株A19菌株存在特異性位點，以此設計了能檢測區分A19疫苗株的熒光定量PCR方法，發現該方法最低檢出限為7.6 fg A19疫苗株布魯氏菌基因組；使用該方法檢測79株已知布魯氏菌菌株、125份陽性血清樣品和4株非布魯氏菌菌株，證明其具有良好的特異性和敏感性；2018年，Nan等[37]還發現牛種布魯氏菌弱毒疫苗株104M存在特異性的基因突變，以此設計了能檢測區分104M疫苗株的熒光定量PCR方法，發現該方法最低檢出限為220 fg 104M疫苗株基因組。

4 結語

布魯氏菌PCR方法與傳統的血清學和細菌學檢測方法相比具有簡便快捷、特異性強、靈敏度高、操作簡便等優點，其檢測結果得到了廣泛接受和認可。目前多重PCR和熒光定量PCR在布魯氏菌檢測、布魯氏菌菌種鑒別、疫苗株與野毒株區分等方面得到了廣泛應用，滿足了檢驗檢疫、流行病學調查、人和動物布病診斷等多方面的需求。目前，PCR技術又實現了與芯片技術、微流體技術等新技術的融合，可進行大量樣品中多種病原的快速同步檢測和分析，有效提高了檢測效率，將更有助于布魯氏菌的快速檢測和分型。