基于樹突狀細胞激活建立皮膚致敏的體外方法

陳 健，柯逸暉，陳 彧，談偉君，程樹軍*(1.廣州市華代生物科技有限公司，廣州 5106； .廣東檢驗檢疫技術中心， 廣州 5106； .廣東藥科大學，廣州 510006)

接觸性過敏性皮炎(allergy contact dermatitis，ACD)是由T淋巴細胞介導的抗原特異性皮膚過敏反應，以抗原刺激后局部皮膚出現一系列的皮膚炎癥細胞浸潤、炎癥介質釋放為特征，屬于遲發IV型變態反應。臨床主要表現為瘙癢、紅斑、紅腫等癥狀，對患者的正常生活和工作影響較大。日常生活中能引起ACD的物質繁多，如化妝品、香精香料等，因此對這些物質的致敏性檢測也顯得至關重要。法規認可的皮膚致敏檢測的動物實驗方法是豚鼠最大值試驗(guinea pig maximinatim test，GPMT)和封閉涂皮法(buchler test，BT)，后來，開發了小鼠局部淋巴結試驗(local lymph note assay，LLNA)，這些試驗需要大量動物，耗時長、成本高。隨著替代方法的興起，ACD發生過程與角質細胞、樹突狀細胞和T細胞之間關系逐漸清晰，在有害結局通路(adverse outcome pathway，AOP)理論指導下，皮膚致敏替代方法研究取得了顯著的進步[1]，其中對于樹突狀細胞激活這一關鍵事件的研究最為活躍。

1 皮膚致敏的AOP理論與樹突狀細胞的關鍵作用

基于AOP理論，皮膚致敏的AOP通路可分為一個起始事件和三個關鍵事件(key event，KE)。分子起始事件(molecular initiating event，MIE)：具有親電作用的化學物質與表皮蛋白質的親核位點共價結合，形成半抗原。角質細胞激活(KE1)：角質細胞對半抗原-蛋白質復合物的攝取，誘導炎性因子生成。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)激活(KE2)，DC攝取和呈遞抗原，未成熟的表皮DC識別半抗原蛋白復合物，表面特征性標志物表達上升，同時釋放細胞因子，遷移至淋巴結，通過主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)分子將半抗原-蛋白質復合物呈遞給T細胞。T細胞活化/增殖(KE3)：T細胞識別細胞表面的MHC呈遞的抗原肽被激活形成記憶T細胞，當皮膚再次接觸致敏原時，這些記憶T細胞就會增殖，誘發ACD。針對這些關鍵事件開發出不同機制的皮膚致敏的替代方法，其中直接肽鏈反應分析(direct peptide reaction assay，DPRA)、KeratinoSens、U-SENSTM和人細胞系活化試驗(human cell line activation test，h-CLAT)已經通過驗證，被經濟合作和開發組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)接受為測試指南442C、442D和442E[2]。

在AOP通路中，DC作為機體功能最強的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，向上可以攝取呈遞抗原，向下可以活化T細胞，激活過敏免疫反應，在AOP通路中作為關鍵事件2起到承上啟下的作用。其中，表皮和胃腸上皮中的DC又稱為朗格漢斯細胞(Langerhans cell，LC)，LC在活化成熟時，Ⅱ型MHC、共刺激分子(CD86、CD54、CD80和CD40)等表達上調。但由于原代樹突狀細胞在誘導分化和提純方面存在很大困難，因此有研究選用具有相同性質的類樹突狀細胞如THP-1細胞、U937細胞等來開發替代方法。

2 基于KE2的體外方法

2.1 h-CLAT體外致敏檢測方法

THP-1細胞是一類單核細胞，與LC功能相似，實驗中不需要誘導分化就能準確判斷出化合物的致敏性，大量研究發現THP-1細胞相比其他單核細胞更穩定，準確率更高。使用THP-1細胞構建的h-CLAT方法于2016年被OECD列為測試指南442E。實驗時先測定受試物的細胞毒性，確定75%細胞活率濃度，再將THP-1細胞暴露受試物24 h，通過流式細胞儀檢測CD86和CD54的表達，對受試物致敏性進行判斷。陳彧等[3]采用h-CLAT方法，對11種已知成分化學物質和9種未知植物樣品和日用產品進行預測，準確區分了11種已知參考物質的皮膚致敏性，對9種未知樣品的分類結果與動物實驗結果一致。Sakaguchi等[4]也使用同樣的方法對8種防腐劑的皮膚致敏性進行了評價。Parise等[5]在分析23種物質致敏性時發現，細胞表面標志物CD86表達情況和細胞炎性因子白介素8(interleukin-8，IL-8)釋放量之間存在正相關，說明IL-8也可以作為鑒別化學物質致敏性的指標。也有學者發現白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)釋放量與受試物致敏性之間存在關聯。Ashikaga等[6]研究發現在THP-1細胞，能觀察到致敏暴露組CD86與MHC Ⅱ類分子的表達較非致敏組明顯上升，提示CD86、MHC Ⅱ類分子可能是區分致敏物與刺激物的敏感指標。研究表明，h-CLAT在預測親脂性物質致敏性時靈敏度和準確度分別為95%和88%[7]。

2.2 U-SENSTM體外致敏檢測方法

U937細胞是來源于人體骨髓系的單核細胞，在細胞被活化后其表面標志物CD86會特異性上升，因此該細胞也可用于模擬DC細胞激活引起T細胞增殖的關鍵步驟。U-SENSTM就是基于該細胞系建立的體外致敏檢測方法，將受試物與U937細胞共孵育后，定量檢測細胞表面標志物CD86表達的變化，從而對受試物致敏性進行判斷。Alépée等[8]報道4個實驗室使用U-SENSTM方法對24種物質的檢測結果，發現該方法的實驗室內可重復性約為90%，實驗室間重復性為84%。對24種受試物進行預測的敏感性、特異性和準確度均高于93.8%。Piroird等[9]通過將175種物質的U-SENSTM評價結果與人體數據和LLNA試驗結果進行對比，發現U-SENSTM的特異性為79%，靈敏度為90%，準確度為85%。與h-CLAT方法相比，檢測參數只有CD86，可以作為組合測試策略的一部分。該方法在2017年作為補充方法列入OECD測試指南OECD442E。

2.3 外周血單核細胞試驗

外周血單核細胞(peripheral blood monocyte-derived cell，PBMDC)是從新鮮血沉棕黃層中分離得到的單核細胞，使用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導分化形成CD1a-/CD14+單核細胞。在暴露于受試物48 h后，根據細胞表面CD86的表達情況判斷受試物致敏性。Karschuk等[10]使用誘導的CD1a-/CD14+單核細胞對受試物的致敏性進行了分析，發現相比于刺激性化學物和非致敏性化學物質，致敏性化學物會特異性使細胞CD86表達增加，而CD83與人白細胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)則不明顯，提示在PBMDC實驗中，同樣選擇了CD86作為評價受試物致敏性的特異性指標。但細胞供體來源不穩定，細胞需要誘導分化。

2.4 VITOSENS?試驗

VITOSENS?試驗使用來自人臍帶血分化的CD34+祖細胞來對受試物致敏性進行檢測，在與受試物共孵育后，通過比較暴露組與溶劑組中趨化因子2型受體(chemokine receptor type 2，CCR2)和cAMP應答元件調節因子(camp responsive element modulator，CREM)的表達來判斷受試物致敏性。將細胞暴露于受試物24 h后，使用流式細胞儀測定受試物的IC20值。然后以測定的IC20為最低暴露劑量，孵育6 h取部分細胞通過qPCR分析相關基因的表達，孵育24 h后收集全部細胞，使用qPCR測定細胞CCR2和CREM表達情況。Hooyberghs等[11]通過對10種致敏物和11種非致敏物進行檢測，使用RT-PCR分析基因表達情況，發現致敏組基因CREM和CCR2的表達均顯著高于非致敏組(P< 0.05)。Lambrechts等[12]使用該方法對15種已知致敏性化學物進行預測。實驗中需要使用qPCR技術，實驗成本相對其他體外替代方法較高，且不同來源的CD34+祖細胞也會影響到實驗結果的穩定性。

2.5 基因組過敏原快速檢測方法

MUTZ-3是人類急性骨髓單核細胞白血病細胞系，其在免疫反應中具有激活特異性T細胞的能力，并且在成熟過程中也其細胞相關表型變化也與DC相似，能夠表達CD1a、HLA-DR和CD54，同時還能低表達CD80和CD86。利用MUTZ-3細胞在免疫反應中的特性建立了體外致敏預測的基因組過敏原快速檢測方法(genomic allergen rapid detection，GARD)。Johansson等[13]在研究使用20種非致敏物和20種致敏物刺激MUTZ-3，共孵育24 h后，通過對MUTZ-3細胞的基因表型進行分析，確定了200個相關基因的表達與受試物致敏性存在相關性，也提示該方法在有能力對受試物的致敏性進行預測。但該方法與VITOSENS?相似，檢測成本比較高。

3 以KE2為核心建立組合模型和方法

類樹突狀細胞作為免疫細胞能夠單獨用來檢測化學物質致敏性，但作為體外系統的單細胞體系，在評價化合物致敏性時會因為系統代謝機能不足，對于一些小分子物質或者半抗原類物質還存在缺陷。同時，細胞活率對細胞表面標志物的表達有很大影響，為了改善這種情況，基于單細胞體系的致敏檢測系統做出了改良。

3.1 THP-1細胞與角質細胞共培養模型

角質形成細胞除了構成皮膚的屏障功能，還能通過代謝功能對外源受試物進行處理，并產生和釋放炎性因子，同時也可對半抗原或半抗原前體物進行修飾、活化和蛋白結合。在皮膚致敏感的AOP理論中，角質形成細胞激活是KE1?；诮琴|細胞活化的方法可用于篩選致敏物，但由于其并非專職的抗原提呈細胞，因此使用正常角質細胞的測試方法通常預測能力較弱，可以通過對細胞進行基因修飾轉染抗氧化元件(如KeratinoSens方法)以提高其敏感性，或者與其它方法組合使用。

Hennen等[14]通過將HaCaT與THP-1細胞聯合培養來探討共培養體系在預測化學物致敏性中的優勢。單獨培養HaCaT 48 h后，加入受試物和THP-1細胞共培養24 h，分析細胞表面標志物CD86、CD40和CD54的表達，發現共培養體系中THP-1細胞表面標志物的表達量顯著增加。并且在實驗中發現，使用共培養系統檢測化學物致敏性時，THP-1細胞表面標志物的表達不受細胞活率影響。使用CD86作為生物標志物時，共培養體系還可以用來區分半抗原物質和半抗原前體物質。這些研究成果對體外致敏評價技術的發展提供了很好的基礎。近來，Hennen等[15]使用共培養方法正確區分了14種致敏物和9種非致敏物，說明共培養體系能提高致敏檢測的靈敏度和特異性。采用靜態的兩種細胞的共培養模型不僅可用于研究角質細胞與THP-1細胞產生致敏反應的機制，還有助于探討細胞間的相互作用。

3.2 THP-1細胞與皮膚模型共培養模型

盡管共培養體系能夠提升體外致敏檢測試驗的靈敏度和特異度，但在處理難溶或不溶性物質時，仍然存在很大的缺陷。隨著組織工程技術的發展，組織工程皮膚也逐漸被應用到化學品的安全評價中，如普遍使用的商品化皮膚模型EpiskinTM、EpidermTM和SkinEthie RHE。皮膚模型經刺激物或變應原處理后會出現細胞活力改變、組織學改變以及細胞因子釋放等，可通過有效手段進行檢測，但是單獨皮膚模型不能模擬復雜的生物代謝過程，并且沒有免疫細胞參與，可能無法對待測物進行有效預測。Cao等[16]使用分離的原代角質形成細胞，經過培養后分化形成組織工程表皮，將THP-1細胞與組織工程表皮共培養24 h后，將質量濃度2 g/L DNFB和10 g/L SDS分別取5 μL均勻涂抹于構建的組織工程表皮表面，孵育24 h。孵育完成后使用流式細胞儀分析細胞表面標志物CD86和CD54的活化情況，使用ELISA試劑盒檢測培養液中白細胞介素1β的水平。結果DNFB處理組中，THP-1細胞表面標志物CD86和CD54表達量顯著增加，而在SDS處理組中則未觀察到此現象，提示該檢測模型能用來預測化學物致敏性。

3.3 含LC的皮膚模型

含免疫細胞的皮膚模型的構建有一定的技術難度，文獻報道了一種含有功能性LC細胞的皮膚模型，采用MUTZ-3來源的LC細胞，以模擬人體皮膚的方式局部接觸抗原或刺激物，可以啟動固有的免疫應答[17]。模型開發的下一步是引入T細胞，用于研究獲得性免疫反應。把含LC細胞的皮膚模型與T細胞共培養，可以實現把AOP通路中三個關鍵事件的整合成一個實驗系統。

3.4 皮膚致敏芯片

THP-1細胞與HaCaT細胞，或者與皮膚模型的共培養模型，是一種靜態水平的研究兩種或多種細胞間相互作用的模型。隨著微流控技術的發展，小型化、高通量的模擬人體皮膚血液流動的動態環境的裝置被開發出來，利用這種皮膚致敏感芯片系統，可實現將THP-1細胞與角質細胞或者皮膚模型動態連接起來，使用計算機進行精確控制、微量加樣和實時檢測相關參數。對于精確研究低致敏物質的量效關系、模擬生理狀態下細胞之間的交叉對話(cross-talking)，深入了解細胞表面標志物、炎性因子釋放和基因組的調控提供了理想的模型。目前，使用皮膚模型與皮膚附屬器或機體其它細胞組合的人體芯片研究已經開始[18]。

4 結論與展望

隨著ACD機制的逐漸被闡明，基于AOP通路中KE2開展的研究和建立的體外致敏檢測方法越來越多，更多的方法經過驗證被用于指導化學品、藥品或其它物質皮膚致敏的檢測。目前，基于樹突狀細胞的方法在研發和使用時應注意以下幾個問題：①選擇接近體內樹突細胞的細胞系：目前用于KE2檢測的細胞種類較多，要根據研究需要尋找和選用不同的細胞；②了解檢測方法所依賴的細胞系的局限性和適用性：如THP-1與U-973的細胞表面標志物類型和強弱不同，使用時應記錄其表型特征，并建立細胞質量控制檔案；③使用組合方法：實驗室應建立AOP通路中的至少3個方法，并根據整合測試策略(integrated approaches to testing assessment，IATA)的原則建立整合模型，以提高致敏預測的準確性；④建立體外數據庫：皮膚致敏體外方法的開發處于推廣和數據積累階段，實驗室應積累不同化學品原料的測試數據，反過來對方法進行優化；⑤合理推廣應用范圍：體外方法的開發主要是根據單一化學品的測試建立模型，實際應用中可能用于醫療器械浸提物、植物提取物、混合物等復雜樣品的測試，應在使用中積累經驗，合理推廣替代方法的使用范圍，必要時與其它方法互相驗證[19]。相信，在AOP通路的指導下，皮膚致敏的體外方法開發將朝著進一步降低實驗成本、提高預測準確性、使用組合模型和提高檢測通量的方向發展。成套和標準化替代方法的開發，在豐富毒性測試檢測工具箱的同時，進一步減少了動物的使用，也起到了提高消費品安全的作用。

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