腫瘤微環境與免疫抑制性細胞的研究進展

鄭凱源 綜述，付蔚華 審校

（天津醫科大學總醫院普通外科研究所，天津300052）

機體的免疫系統在腫瘤的形成及發展中具有雙重作用：它不僅可以通過殺傷腫瘤細胞來抑制腫瘤的發生和發展，同時還能通過構建能促進腫瘤進展的免疫抑制微環境，從而促進腫瘤的發生和發展。在腫瘤的發生發展過程中，機體可通過固有免疫和獲得性免疫識別和清除腫瘤細胞，發揮免疫監視的作用。機體的免疫細胞，如T淋巴細胞、NK細胞、NKT細胞、γδT淋巴細胞以及巨噬細胞等，可以巢集到腫瘤部位，通過自身與其分泌的 IFN-γ、TNF-β、顆粒酶、FASL及TRAIL等具有細胞毒性的細胞因子，發揮抗腫瘤的作用。腫瘤細胞可以通過多種途徑逃避機體的免疫監視，它可以通過自身發生基因水平、遺傳水平、代謝水平上的重構，來防止其發生凋亡或被免疫細胞所識別，從而發生免疫逃逸[1]。同時，腫瘤細胞也可以促進免疫抑制性細胞趨化到腫瘤微環境中，這些募集來的免疫抑制細胞及其所分泌的細胞因子能抑制機體的抗腫瘤免疫反應，從而使腫瘤細胞逃避機體的免疫監視，這被認為是腫瘤免疫逃逸發生的主要原因[2]。腫瘤細胞及其相關產物，特別是處于進展期的腫瘤，可以促進抑制性和調節性免疫細胞亞群的產生，并募集它們到腫瘤微環境中。腫瘤微環境中的骨髓來源的抑制細胞（MDSC）、調節性T淋巴細胞（Treg）、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、調節性 DC（DCreg）、中性粒細胞、TH17及調節性B淋巴細胞（Breg）等是腫瘤發生發展過程中的主要免疫抑制性細胞[3]。本文通過綜述腫瘤微環境中一些主要的免疫抑制細胞及其在抗腫瘤免疫反應中的作用，從而為腫瘤的免疫治療提供一些新的思路和方向。

1　腫瘤微環境中主要的免疫抑制細胞

1.1調節性T淋巴細胞（Tregs） Tregs是調節免疫耐受，維持機體免疫反應平衡最重要的免疫抑制細胞，主要起源于胸腺或從外周淋巴結器官發育而來。其中從胸腺分化而來的為自然調節性T細胞（nTreg），起源于外周淋巴器官的是誘導調節性T細胞（iTreg）。依據其表面分子表達物的不同，調節性T細胞可分為CD4+Treg、CD8+Treg、自然殺傷性T細胞Treg、雙陰性調節性T細胞。研究發現，大部分的惡性腫瘤患者外周血Tregs的比例都明顯升高，如胃癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌以及婦科惡性腫瘤等[4]。同樣也有許多研究報道，腫瘤微環境中Tregs的比例也會升高，而腫瘤局部調節性T細胞的數量與腫瘤預后密切相關[5]。Curiel等[6]在研究中發現，在上皮性卵巢腫瘤組織的浸潤淋巴細胞（TILs）中Tregs占全部CD4陽性細胞的比例為（23±11）%，而在正常卵巢組織中，Tregs卻少到難以測出。在缺氧的腫瘤微環境中，腫瘤細胞產生的CCL22、CCL5、CCL28、CCL2 及 CXCL12 等趨化因子可以募集Tregs到達腫瘤部位，從而導致腫瘤微環境中Tregs顯著增多[7]。

Tregs可以通過多種途徑影響其他的免疫細胞，包括CD4+、CD8+T淋巴細胞、NK細胞及DCs等，抑制其抗腫瘤免疫反應，從而有利于腫瘤的發生和發展[8]。它可以通過多種機制抑制T淋巴細胞的功能：（1）促進IL-10和TGF-β等免疫抑制性細胞因子的產生；（2）上調膜表面CTLA-4、PD-1/PDL1等負抑制性分子的表達；（3）消耗具有抗腫瘤作用的細胞因子IL-2[9]。研究發現，在RMAS和B16淋巴瘤研究模型中，Tregs可以通過顆粒酶B和穿孔素殺傷CD8+T淋巴細胞。從白血病小鼠分離的Tregs可以通過下調DC表面CD80、CD86及CD40等協同刺激分子的表達，減少TNF-α,IL-12等細胞因子的產生，從而抑制DC的功能[10]。Tregs還可以通過分泌IL-10、TGF-β等免疫調節性細胞因子和細胞間相互作用來調節DC細胞的分化和成熟[11]。有研究表明Treg細胞在抑制CD8+T細胞反應中起至關重要的作用，Foxo1失活是Treg細胞遷移的必要條件；并提出了可以通過在Treg細胞中的微調激活Foxo信號通路來優先破壞腫瘤免疫耐受，抑制腫瘤生長，且不會造成自身免疫反應[12]。

1.2骨髓來源的抑制細胞（MDSCs） MDSCs是骨髓來源的一群異質性細胞，是DCs、巨噬細胞和（或）粒細胞的前體形式，可以顯著抑制機體的抗腫瘤免疫反應[13]。在腫瘤、感染、炎癥、敗血癥、外科損傷等病理條件下，這些髓系來源的前體細胞成熟受阻，因而停留在各個分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs[14]。MDSCs大量聚集在一些腫瘤組織，包括腎癌、前列腺癌、肝細胞癌、結直腸癌、乳腺癌及胰腺癌等，與患者的不良預后有關[15]。免疫抑制表型是MDSC的概念標志，但其中的抑制機制目前仍沒有明確的共識。MDSCs可以通過多種機制促進腫瘤的免疫逃逸，其中主要的機制是消耗促使T淋巴細胞成熟及發揮功能所必需的氨基酸，分泌ROS、NO等導致氧化應激，阻礙淋巴細胞的遷移，并誘導Tregs的產生[16]。MDSC與CD8抗原特異性相互作用后可以產生大量的T細胞抑制性的活性氧（ROS）[17]。

Highfill等[18]在小鼠橫紋肌肉瘤模型的研究中發現，由腫瘤細胞產生的CXCR2可以募集大量的CXCR2+CD11b+Ly6GhiMDSCs到腫瘤微環境中，后者可以大量消耗腫瘤組織微環境中的精氨酸，而精氨酸是T淋巴細胞增殖的必需氨基酸，因此最終導致T淋巴細胞的增殖障礙，抑制T淋巴細胞介導的免疫反應。MDSCs還可以通過表達IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子誘導Tregs的產生，抑制CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的活化。最近有研究發現[19]，腫瘤微環境中分離的MDSCs相對于外周血中分離的MDSCs具有更強的免疫抑制能力，其機制尚不清楚。Marini等[20]在研究霍奇金淋巴瘤及B型非霍奇金淋巴瘤患者MDSC分布中，發現其外周血中積累的G-MDSCs主要由活化低密度中性粒細胞構成，并且有免疫抑制性。MDSC與B細胞是機體適應性免疫調節的重要部分，研究發現，MDSC能夠抑制B細胞的增殖及活化，從而抑制其免疫應答作用[21]。MDSC通過多重機制包括前列腺素E2，誘導型一氧化氮合酶和精氨酸酶直接抑制B細胞[22]。MDSC也可通過影響各種細胞通路損害NK細胞效應功能[23]。研究表明，來自肝癌荷瘤小鼠的MDSCs顯著地抑制NK細胞的細胞毒作用、NKG2D表達及IFN-γ的產生，并誘導NK細胞的無效性，而消除MDSC可以挽救受損的肝臟NK細胞功能。在慢性炎癥和腫瘤環境下，MDSC主要通過下調CD247介導NK細胞損傷。此外，在MDSC和NK細胞之間似乎存在反饋機制，其中NK細胞可調節MDSC擴增[24]。此外，MDSC也參與多種自身免疫性疾病，如1型糖尿病、自身免疫性肝炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等疾病發生發展的免疫紊亂機制[25]。已有研究證明，降低動物模型和癌癥患者中MDSC數量或免疫抑制活性可延緩腫瘤生長、延長荷瘤動物存活時間[26]。

1.3腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）TAMs作為腫瘤微環境中的重要組成成分，是外周血單核細胞浸潤到實體腫瘤組織中而演變成的巨噬細胞，通過參與腫瘤血管淋巴管生成、移除細胞碎片、組織重塑、免疫抑制等過程，在腫瘤發生發展及轉移中發揮重要的作用。腫瘤微環境中存在大量的TAMs，這些大量的TAMs常提示患者預后不良[27]。TAM主要有兩種來源：起源于骨髓的血液單核細胞（monocyte-derivedmacrophages，MDMs)或起源于卵黃囊并在特定組織定植的巨噬細胞（tissueresidentmacrophage，TRMs）。大多數情況下TAMs主要來源于循環血單核細胞并通過趨化因子CCL2聚集到腫瘤組織周圍。

Steidl等[28]在研究中報道，經典霍基金淋巴瘤患者活組織檢查中發現的大量TAMs與減少的生存時間有著密切關系，甚至被認為是治療后復發的預測指標。

TAMs主要通過抑制CD8+T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應來促進腫瘤免疫逃逸[29]。TAMs的細胞表面可以表達PD-L1、B7-H4等抑制性配體，可直接與CD8+T淋巴細胞上的相應受體結合，從而抑制CD8+T淋巴細胞的抗腫瘤作用，也可以表達CCL22誘導Tregs的產生，間接抑制CD8+T淋巴細胞的功能[30]。TAMs還可以通過分泌特殊的細胞因子、生長因子等作用于腫瘤組織相關基質或內皮細胞，參與促進腫瘤細胞生長和轉移，誘導腫瘤組織新生血管和淋巴管生成等過程[31]。通過對相關趨化因子進行調控從而限制巨噬細胞的富集，可能會成為有效的抗腫瘤靶點。有研究表明，用特異性單克隆抗體選擇性地抑制VEGFR2，可顯著減少巨噬細胞的浸潤與腫瘤的增長。

1.4M2型巨噬細胞巨噬細胞是一群可塑性極強的細胞，根據應對不同的環境信號刺激時表現出不同的功能，可以被分為兩個亞群，M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞是通過經典活化途徑活化的巨噬細胞，在機體的固有免疫中發揮重要作用。M2型巨噬細胞則由細胞因子IL-4、IL-10、IL-13和糖皮質激素活化，通過上調IL-10以及下調IL-12的表達來抑制腫瘤免疫反應[32]。研究發現，腫瘤相關巨噬細胞（M2型巨噬細胞）能促進腫瘤的發生和發展，但具體機制尚不完全清楚。學者普遍認為，在腫瘤內的腫瘤細胞為M2型巨噬細胞，即腫瘤相關巨噬細胞（TAM），該細胞表達高水平的CD206和白細胞介素10，可抑制T細胞的增殖，參與了腫瘤進展的過程。M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化還是M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化取決于它們所處的腫瘤微環境[33]。腫瘤微環境中的 IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、CSF和TNF-α等細胞因子可以通過激活STAT信號通路促進M1向M2極化[34]。腫瘤微環境中的缺氧條件也會促進M1向M2極化，并促進它們表面血管生成素受體TIE2的表達，后者可以抑制巨噬細胞的抗腫瘤作用，促進腫瘤的遠處轉移[35]。

1.5調節性樹突狀細胞（DCreg） DC是機體最重要的抗原提呈細胞，在腫瘤特異性CT誘導的抗腫瘤免疫反應中有著至關重要的作用[36]。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)具有強大的捕捉、處理和遞呈抗原的能力，在病原微生物或炎性因子的刺激下逐漸成熟，并由外周組織遷徙至次級淋巴器官，活化、調節效應T細胞，在調控先天性和適應性免疫反應中扮演著重要的角色。

然而在腫瘤微環境中，IL-10、TGF-β、VEGF 和 PGE2 等腫瘤相關因子,可以誘導DC成為調節性的DCreg。DCreg最初由IL-10刺激體外培養的小鼠骨髓細胞分化而來，存在于正常小鼠的脾臟及淋巴結內，特別在IL-10轉基因小鼠中表現為類漿細胞樣形態和不成熟樣表型，活化后能高表達并分泌IL-10，其表面標志具有多變性。有文獻報道小鼠DCreg中DCs的特異性標記CD11c及MHC分子呈高表達，低表達共刺激分子 CD40、CD80、CD86[37]。

T細胞在接受抗原刺激后完全活化依賴于雙信號的刺激及相應的細胞因子，DCreg通常極低水平表達共刺激分子，而CD40、B7等共刺激分子又是T細胞活化所必須的第二信號，因此DCreg無法活化T細胞而導致T細胞“無能”或低反應性，從而誘導抗原特異性的免疫耐受[38]。研究發現，DCreg可以促進T細胞表達CD25、CTLA-4，并分泌TGF-β和IL-10，加快效應 T 細胞（effector T cells，Teff）的凋亡。DCreg除了能夠誘導T細胞“無能”或促進T細胞清除外，還能誘導Treg細胞的產生，而Treg與DCreg均能分泌IL-10，因此具有彼此促進分化的作用，這進一步加強了DCreg的免疫調節/耐受作用，被認為是DCreg誘導免疫耐受最為重要的機制。

有研究報道[39]，人類的肺癌細胞可以將DCs轉變為能產生TGF-β的細胞，而鼠肺癌細胞可以驅使DCs高表達IL-10、NO、VEGF 和 ARG1。Norian 等[40]在研究中報道，腫瘤微環境中浸潤的MHC-II+CD11b+CD11c+DCs可以通過產生ARG1抑制CD8+T淋巴細胞，從而抑制抗腫瘤免疫反應。DCreg具有負性免疫調節功能，能夠通過多種機制誘導免疫耐受，因此DCreg可以為器官移植免疫排斥反應的治療提供新的思路，而這一思路在動物移植模型中已得到較為成熟的應用。朱杰昌等給心臟移植術后的小鼠輸注以針對小鼠CIM0基因的RNA干擾（RNA interference，RNAi）慢病毒載體在體外感染供者骨髓來源的DC制備的低表達CD40的耐受性DCreg，可以誘導移植免疫耐受從而延長小鼠移植心臟的存活時間。

2　針對免疫抑制細胞的治療

2.1通過扭轉免疫抑制通路或者阻斷免疫檢查點來增強有效的抗腫瘤T淋巴細胞免疫反應。許多免疫抑制細胞和腫瘤細胞表面表達CTLA-4、PD-1/PD-L1等抑制性分子，這些免疫抑制信號，也叫做免疫檢查點，這些抑制信號阻止T淋巴細胞的活化，促進腫瘤的免疫逃逸[41]。因此以這些免疫檢查點為靶點，可以促進機體的抗腫瘤免疫反應，并且已經有針對這些免疫檢查點的阻斷性抗體應用于臨床。目前針對CTLA-4、PD-1的阻斷性抗體已經通過臨床試驗并應用于臨床，且在延長癌癥患者總體生存時間上取得了一定的效果[42]。Anse等[43]在研究中報道，PD-1阻斷性單克隆抗體nivolumab可以抑制腫瘤的免疫逃逸，并在應用于霍基金淋巴瘤患者后取得了實質性的效果。Hod等[44]報道，抗CTLA-4抗體ipilimumab和tremelimumab在治療晚期黑色素瘤的應用中，已經進入了Ⅲ期臨床試驗，接受治療者與未接受治療者相比具有總體生存優勢。2011年，FDA批準ipilimumab應用于臨床，因其在延長轉移性黑色素瘤的生存時間上體現出的明顯優勢[45]。2015年3月，FDA批準nivolumab應用于晚期和非小細胞肺癌的治療，相對于化療藥物多西他賽，能明顯提高總體生存時間[46]。

2.2通過直接以免疫抑制細胞本身為靶點或者減少腫瘤組織募集的免疫抑制細胞的數量來增強抗腫瘤免疫作用。Qin等[47]在小鼠胸腺腫瘤模型的研究中報道，一種被稱為肽體（肽-Fc融合蛋白）的治療性多肽可以特異性的結合血液、脾臟以及腫瘤組織中的MDSCs，殺傷這些被結合的MDSCs，阻斷其抗腫瘤免疫的作用，抑制腫瘤的生長。Kim等[48]在研究中發現，應用于腎癌的治療中的一種酪氨酸酶抑制劑舒尼替尼，可以誘導MDSCs的凋亡并抑制Tregs的功能。Ni等[49]在皮膚T淋巴細胞瘤的研究中發現，一種抗CCR4抗體mogamulizumab可以與Tregs細胞表面高表達的CCR4結合，最終引起CCR4+惡性T淋巴細胞和CCR4+Tregs數量的減少。這些研究的成功也證明了通過阻斷或扭轉免疫抑制通路可以增強機體的抗腫瘤免疫，從而防止腫瘤免疫逃逸的發生及控制腫瘤的遠處轉移。

綜上所述，腫瘤微環境中由免疫抑制細胞及其所分泌的細胞因子構建的免疫抑制網絡是腫瘤發生免疫逃逸最重要的原因，在了解了這些免疫細胞及其抑制的機制后，通過藥物阻斷這些抑制性免疫細胞和它們發揮抑制作用的通路，可以有效的阻止腫瘤細胞的免疫逃逸、抑制腫瘤細胞的轉移，從而在腫瘤發展進程的各個階段進行控制并達到增強抗腫瘤免疫反應的結果[50]。然而腫瘤的形成是一個復雜的過程，各種各樣的機制參與其中，且不同腫瘤類型的差異，同類腫瘤不同分化、發展階段的差異，腫瘤患者個體間的差異，這些都決定了腫瘤的治療不可能僅通過某種藥物的單一治療，所以多種藥物聯合的個體化的精準化的治療方案將是腫瘤免疫治療未來努力的方向。

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