氧化應激、線粒體功能障礙與帕金森病

梁志剛 羅鼎真 王曉民

(青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院神經內科，山東 煙臺 264000)

抗氧化、保護線粒體功能可能是帕金森病(PD)治療和神經保護的重點。本文對近幾年氧化應激、線粒體功能障礙與PD研究進展做一綜述。

PD于1817年由英國醫生James Parkinson首次報道，是一種以黑質紋狀體系統選擇性、進行性變性為主要特征的中老年期運動障礙性疾病。其主要病理改變是黑質致密區(SN)多巴胺(DA)能神經元變性、死亡，殘存神經元胞質內嗜酸性包涵體即Lewy 小體(LB)形成，導致紋狀體中DA含量減少，該病典型臨床癥狀為靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢平衡障礙。這些運動障礙從發病伊始就呈漸進性加重過程，患者生活無法自理，最終死于肺部感染等并發癥。由于DA能神經元退行性病變發生的真正原因和機制尚不明確，PD的預防及治療都非常困難，目前臨床上主要治療手段是左旋多巴(L-DOPA)藥物替代療法和手術治療，這些措施雖能夠在短期內改善PD患者的癥狀，但不能阻止或延緩DA能神經元的進行性變性過程，所以遠期療效無法令人滿意。因此以延緩或阻止黑質DA能神經元進行性變性過程為靶點的神經保護性策略是PD治療學的發展方向。針對PD發病機制的研究熱點，多種抗氧化應激、改善線粒體功能及持續性DA受體刺激的藥物逐漸被應用于PD的治療，這些藥物有望延緩疾病進程，更好地改善臨床癥狀。

1 氧化應激與PD

1.1自由基和氧化應激的概念 氧化應激是指機體內氧自由基的產生與清除失去平衡，外源性氧化劑的過量攝入導致活性氧在體內堆積引起細胞毒性。過量的自由基以進攻多不飽和脂肪酸可引起脂質過氧化，導致生物膜結構和功能的改變; 損傷蛋白質的巰基和氨基使蛋白質變性、交聯，使酶的活性喪失; 損傷DNA 可導致細胞突變。種種有害后果與許多疾病如腫瘤、炎癥、衰老、神經退行性疾病的發生有密切關系〔1〕。

近幾年研究證明氧化應激產生的過量自由基不但直接攻擊生物大分子發揮損傷作用，而且自由基可以作為信號分子啟動一系列病理生理過程。外界刺激在信號傳遞過程中產生活性氧(ROS)，而ROS 又可以刺激信號通路，參與細胞信號轉導過程。在細胞凋亡信號轉導的過程中，ROS 既可以作為外界誘因，又是其他誘因在體內激發凋亡的一種中間產物，其機制可發生在凋亡過程的各環節，包括直接誘導凋亡或影響與凋亡有關的細胞內信號轉導和基因表達。氧化還原調節可以發生于從受體到細胞信號通路的多水平環節，ROS 可通過細胞膜靶標將刺激信號由細胞膜傳至細胞內，作用于細胞內靶標激發信號級聯反應，誘導細胞凋亡。氧化應激是神經元變性-死亡這一進程中的早期事件。

1.2中腦黑質對自由基損傷的易感性 由于解剖和生理等因素，正常大腦組織富含不飽和脂肪酸，因為代謝需要又必須承受與自身重量不相稱的高比例氧耗，所以大腦是對自由基損傷的易感器官。中腦黑質因為以下原因對自由基損害更敏感：(1)自身保護機制相對薄弱，黑質致密部谷胱甘肽(GSH)和抗氧化酶的含量較其他腦區少；(2)DA能神經元中的神經黑色素對Fe3+的高親和力使黑質中聚集了高濃度的Fe3+，并可隨時轉為活化的Fe2+，Fe2+可與H2O2發生Fenton反應生成攻擊性更強的·OH〔2〕。(3)黑質致密部小膠質細胞的比例較其他腦區高，異常激活的小膠質細胞是活性氧自由基和毒性細胞因子的重要來源；(4)DA氧化代謝的過程中即可產生一定量的自由基，外界毒素也可通過阻斷線粒體呼吸鏈的電子傳遞而產生大量自由基；而且DA 能神經元的數量減少可導致殘余DA能神經元的代謝活動代償性增強，H2O2生成增多，進而導致毒性·OH的聚積，細胞處于嚴重的氧化應激狀態〔3，4〕。因此推測PD的發生正是由于自由基的產生與清除之間正常的平衡受到了嚴重破壞，最終導致DA能神經元的死亡。

1.3PD的氧化損傷標記 有大量研究在關于PD患者尸體解剖組織中的研究尋找到氧化應激的指標。腦組織富含磷脂和不飽和脂肪酸，二者均易于受到氧化應激的損傷，PD患者黑質多不飽和脂肪酸的濃度降低，而丙二醛(脂質過氧化指標)增高〔5〕。氧化應激對蛋白損傷的指標水平，如可溶性蛋白的羰基化修飾在PD患者的尸體標本中亦明顯增高〔6，7〕?；钚缘闹匾笜俗杂膳c結合的硝基酪氨酸，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)小鼠模型腦內損傷區增高，PD患者腦內觸核蛋白于Parkin蛋白硝基化與亞硝基化亦有報道〔8〕。PD的動物模型及病人腦組織中存在氧化損傷，表明氧化應激參與了PD的發病。

1.4氧化應激在PD發病機制的重要作用 氧化應激是受到關注最多的一種PD發病機制。尸檢結果表明PD病人黑質部位存在嚴重的氧化應激，如游離鐵離子增多〔9〕、GSH含量下降〔10〕、線粒體復合體Ⅰ功能受損〔11〕及大量被氧化損傷的脂質、蛋白質和DNA等等；MPTP 或6-羥基多巴(OHDA)等神經毒素也可在體內產生自由基，破壞紋狀體DA 能神經元，使人類及實驗動物出現帕金森綜合征表現，這些都提示氧化應激可能與PD的發生和進展密切相關。自由基是引起氧化應激的基礎，目前認為PD腦內神經黑色素、鐵、DA代謝和線粒體功能異常及代謝酶的缺乏是產生自由基的主要來源。PD 患者黑質DA神經元的變性是一個持續漸進且主動的自我延續過程，而持續的炎性反應促進了這一過程。炎性細胞因子可能主要通過氧化應激損害促進了DA能神經元的變性和死亡。從一些早期發病的家族性PD患者第4 號染色體中發現兩個單獨的α-synuclein 基因錯義突變后，α-synuclein蛋白在PD 發病機制中的作用受到廣泛關注。有實驗表明，過度表達的野生型或突變的α-synuclein 本身對細胞并沒有任何毒性作用，但是突變的α-synuclein過度表達增加了神經細胞對氧化應激的易感性〔12〕。更重要的是，至今在PD病人的黑質部位仍未發現存在突變的基因或者外源性毒物可以抑制線粒體功能，因此還不能肯定氧化應激的起因及其和線粒功能障礙之間的時程關系。另外，現在仍未確定PD病人黑質部位起關鍵作用的自由基類別，早期人們認為ROS，因為DA代謝產生H2O2和·OH，而且1-甲基-4苯基吡啶(MPP)+也通過抑制線粒體功能和干擾DA在胞內的貯存而產生大量O2-。不過這一設想還沒有得到直接證據的支持，而且MPP+的神經毒性作用與O2-之間也沒有很好的相關性〔13〕。大量的實驗都支持活性氮(RNS)在DA能神經元退變機制中扮演了重要角色。PD病人黑質LB中含有3-硝基酪氨酸和硝基化的α-synuclein，表明過亞硝酸鹽可能參與對DA能神經元的損傷過程〔14，15〕。PD病人黑質內可誘導型的一氧化氮合酶(iNOS)免疫活性增強，這可能是小膠質細胞中iNOS表達上調的結果〔16〕，過多的一氧化氮(NO)擴散到DA能神經元，可以與酶的巰基部位發生亞硝化反應，抑制線粒體復合體Ⅰ和Ⅳ〔17〕。

NO還可能通過結合鐵蛋白而增加游離鐵離子的濃度；NO還能選擇性地抑制GSH還原酶，引起GSH含量下降。MPTP的損傷機制中也有NO參與，使用NO合酶(NOS)抑制劑可以保護小鼠和猴免受MPTP的損傷。目前還不能確定哪一類自由基的作用更重要，ROS和RNS更可能是同時發揮作用的，NO和O2-反應形成過亞硝酸鹽，繼而又分解生成-OH，這些都是氧化應激過程中發揮損傷作用的重要因素。

過量的自由基如果超出DA能神經元的清除能力，就會導致細胞結構的嚴重破壞。受氧化損傷的細胞成分不僅喪失了生理功能，還可能繼續發揮毒性作用：羰基化的蛋白質不易被泛素蛋白酶體系(UPS)識別和降解而積聚，破壞細胞內環境；DNA損傷可能會造成重要分子的錯誤編碼?？梢娧趸瘧な窃斐蒁A能神經元退變的一個重要機制。氧化應激被認為是PD患者黑質神經元死亡的主要因素。DA在氧和水的存在下，受單胺氧化酶作用生成過氧化氫、醛和氨。H2O2可導致毒性自由基增加，于是誘發氧化應激反應。自由基對神經元的損害主要表現在如下幾方面：細胞膜發生脂質過氧化反應，膜磷脂被破壞降解；細胞膜對鈉，鈣及大分子物質通透性增加，神經元發生細胞毒性水腫；線粒體破壞，功能喪失。盡管多項研究支持氧化應激參與了DA能神經元變性和死亡過程的啟動、發生及發展，因為在尸檢中所見的多是疾病末期的狀態，所以，PD病人黑質DA能神經元進行性死亡的機制非常復雜，氧化應激、線粒體功能障礙、異常免疫炎癥反應、蛋白質水解應激和興奮性毒性等機制相互關聯，組成復雜的有害網絡，在多因素的觸發下啟動，可能不依賴于病因而導致DA能神經元的進行性退變。

2 線粒體功能障礙與PD

線粒體是細胞能量產生的初級場所。毒性物質可以通過抑制線粒體復合物Ⅰ來影響線粒體呼吸鏈導致ATP產生減少，最終導致細胞因能量耗竭而死亡〔18〕。對于線粒體代謝異常的直接證據來源于病人的尸檢組織于離體的細胞培養。其中尸檢的一個重要發現表明在PD病人的黑質和前腦皮質中線粒體氧化呼吸鏈復合物Ⅰ(電子傳遞鏈的重要組成部分)功能下降，應用先進的免疫捕獲技術能證明氧化應激的增加和呼吸鏈復合物Ⅰ電子轉移率的下降〔19〕。此外在體研究發現，MRS研究檢測到PD病人顳頂葉區及枕葉高能磷酸水平下降，并導致線粒體相關的代謝異常引起無氧代謝。線粒體功能障礙導致氧化應激加重，氧化損傷脂質、蛋白、DNA，同時降低了重要的抗氧化物質，在PD患者尸解腦組織內可以發現谷胱苷肽下降〔20～22〕。環境和遺傳因素導致的線粒體功能障礙，能引起ROS的過度生產并啟動了PD DA神經元細胞的凋亡。過氧化物產生并導致損傷部位遠端的任何電子傳遞鏈抑制而促進了線粒體自由基的產生。能夠誘導PD神經病理的神經毒素，如MPP+，魚藤茼刺激了電子傳遞鏈復合物Ⅰ的過氧化物的生成并刺激鄰近線粒體基質氧化還原部位自由基產生。

3 抗氧化藥物治療PD的研究進展

基于氧化應激反應增強和氧自由基清除系統的缺陷在PD 發病機制中的重要作用，為了確定自由基是否為有價值的神經保護治療靶點，國內外學者在多種PD模型中對各種抗氧化策略進行了探討，這些策略包括抑制自由基生成、清除自由基或增強內源性抗氧化系統的功能等。兒茶酚-氧-甲基轉移酶(COMT)抑制劑、單胺氧化酶(MAO)-B抑制劑和DA受體激動劑，通過降低DA更新率，阻斷或減少DA的合成、釋放或氧化代謝來減少自由基生成，從而抑制氧化應激反應，減輕自由基對黑質DA能神經元的損害。其中MAO-B抑制劑(司雷吉蘭、雷沙吉蘭)近年來臨床基礎研究都表明其可能具有抗氧化的神經保護作用，是目前臨床上對PD患者修飾治療的首選。自由基清除劑通過清除活性氧，阻斷呼吸鏈反應來減輕自由基的損傷。維生素E(VitE)是血漿中最強的脂溶性抗氧化劑，但臨床研究結果并不支持PD患者使用VitE，究其原因可能有：PD患者腦中VitE水平本來正常，無須給予；所使用的VitE劑量太小，腦內VitE的濃度不足以產生抗氧化效應；VitE選擇性作用于H2O2而不是·OH，而·OH引起脂質過氧化，而H2O2是在脂質過氧化連鎖反應中形成，或許研制滲透性更好的VitE新制劑會對PD的治療有效。維生素C(VitC)是血漿中最強的水溶性抗氧化劑，可以消除過氧自由基和防止脂質過氧化的啟動，保護血漿脂質免遭氧化損害。但VitC也能提供電子，促進三價鐵轉換成反應形式的二價鐵，起著前氧化劑的作用。因為PD患者腦結合鐵的能力相對缺乏，腦內鐵的水平又有增高，在使用VitC治療PD時應謹慎。

美國PD神經保護治療藥物開發委員會(CINAPS)對目前可能有效的PD神經保護藥物進行了系統性的評估，其中60%的神經保護劑研究集中在抗氧化及線粒體保護方面。美國有研究表明口服輔酶Q10(1 200 mg/d)加用維生素E可以阻止PD進展。而PD神經保護探索試驗(NET-PD)2 400 mg/d的輔酶Q10未能證實能上述作用，新輔酶Q10的Ⅲ期臨床試驗也即進行過程中，以進一步確定輔酶Q10臨床治療作用〔23～25〕。線粒體保護治療是PD的新的治療途徑，但需要進一步的研究。輔酶Q10是一種天然的保護線粒體復合物Ⅰ電子傳遞而影響線粒體去極化的抗氧化劑。PD患者分離出來的線粒體中輔酶Q10的含量較少，輔酶Q10減少的比率在PD患者中明顯高于對照組，說明氧化應激在PD患者中的增加。在小鼠和靈長類動物，輔酶Q10保護DA神經元免受百草枯誘導的氧化應激、魚藤茼暴露及急慢性MPTP誘導的DA能細胞的死亡〔26～28〕。肌酸，磷酸肌酸，一種高能磷酸鍵，提高細胞活力并能保護線粒體膜通透孔開放。能減少MPP+介導的對胚胎中腦腹側神經元細胞毒性作用〔29〕。我國學者研究發現丁苯酞對PD患者的治療保護作用，中藥單體及一些有效成分如黃酮類及多糖類、皂苷類對PD細胞及動物模型具有抗氧化及線粒體保護作用。尿酸作為水溶性外源性抗氧化劑，研究認為可能對PD患者具有神經保護及疾病修飾作用〔30〕。近年來對于保護線粒體結構和功能復合細胞通路的研究進展，出現了更多的治療靶點〔31〕。過氧化物體增殖體激活受體Y共激活物過氧化物酶體增殖物活體受體協同刺激因子(PGC)-1α是一種能調節線粒體發生起源和能量代謝的轉錄子激活物，能保持能量代謝的穩定。白藜蘆醇，3′，4′，5-三羥(基)芪，一種葡萄皮提取的多聚苯提取物能過激活PGC-1α與沉默信息調節因子2相關酶(SIRT)1而保護線粒體能量代謝〔32〕，并能保護MPTP對小鼠的DA能神經元損傷〔33，34〕。

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