LC-MS/MS同時測定MCF-7細胞中雌二醇及其羥基代謝物*

★ 朱瑞陳衛東 葛芹 楊海寧 姚琪 趙亞男

(1.安徽中醫藥大學藥學院 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院 合肥 230012；3.皖南醫學院弋磯山醫院臨床藥學部 安徽 蕪湖 240001；4.安徽省多糖藥物工程技術研究中心 安徽 蕪湖 241001)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，隨著人口老齡化以及飲食結構的改變，我國乳腺癌的發病率逐年上升，并呈年輕化趨勢[1]。流行病學研究提出內源性和外源性的雌激素是引發乳腺癌的主要危險因素。

雌激素是重要的內源性物質，在體內發揮著多種生物學效應[2-4]。此外雌激素在乳腺癌和子宮內膜癌等疾病的發展中起著重要的作用[5]。雌激素主要以雌二醇存在，與雌激素受體結合后產生多種生理作用[6]。雌二醇是雌激素中最主要、活性最強的激素[7]，目前普遍認為過量堆積的雌二醇在乳腺癌的發生、發展及預后中具有重要的作用[8-10]。雌二醇可被胞色素P450酶CYP1A1代謝為2-OH雌二醇，被CYP1B1代謝為4-OH雌二醇， 2-OH雌二醇和4-OH雌二醇通過兒茶酚甲基轉移酶(COMT)轉化為2-甲氧基雌二醇和4-甲氧基雌二醇。同時4-OHE2、2-OHE2可被代謝成雌二醇-3,4-半醌，半醌式結構進一步變成醌式結構，與細胞內DNA結構中嘌呤結合，形成DNA加合物，導致DNA的損傷，產生致癌作用[11]。

已有研究者建立方法測定血液[12]、尿液[13]、水體[14]、奶粉[15]中雌激素含量，然而對于細胞中雌激素的測定，相關文獻報道較少，因此我們認為有必要建立一種細胞內快速的定量測量雌二醇及其代謝物濃度的方法，為研究雌二醇及其代謝在不同乳腺癌細胞內的藥物代謝動力學行為提供基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)，AB SCIEX4500 三重四極桿串聯質譜儀(美國 AB SCIEX 公司)，AB135-S 型十萬分之一電子分析天平(德國梅特勒-托利多公司)，TG88/16-WS 臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，XW-80A 微型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)，LC-4016 型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，Millipore 超純水系統(美國 Millipore 公司)，二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)。

1.2 試劑和藥品 雌二醇對照品(批號：100182-201205 純度：96.3%)、炔雌醇(批號：100052-200609 純度：99.5%)均購自中國食品藥品檢定研究院；2-Hydroxy-17β-estradiol(批號：6-STB-57-6 純度：96%)、4-Hydroxy-17β-estradiol(批號：6-STB-56-1 純度：98%)均購自加拿大TRC公司；吡啶-3-磺酰氯(上海源葉生物科技有限公司批號：S62313 純度：98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。DMEM高糖培養基(無酚紅)、活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清均購自于Hyclone公司；胰蛋白酶購自Gibco公司。

2 實驗內容

2.1 MCF-7細胞培養 MCF-7細胞株(購自中國科學院上海生命科學研究所),將細胞接種于培養瓶，于37℃、5%CO2培養箱內，以含10%胎牛血清的 DMEM培養液在培養瓶內培養，取對數生長期細胞進行實驗。細胞按5×105個每孔接種于6孔板，隔天給藥。

2.2 對照品溶液與內標溶液的配制 精密稱取雌二醇，2-OH雌二醇、4-OH雌二醇適量，加甲醇配制成2-OH雌二醇、4-OH雌二醇濃度為100 ng/mL，雌二醇濃度為200 ng/mL的混合對照品溶液，于-80℃保存備用。精密稱取適量炔雌醇 (IS) 標準品，用甲醇配制成5 ng/mL的炔雌醇儲備液。

2.3 細胞樣品處理 取100 μL樣品，加入10 μL內標溶液，用1 mL甲基叔丁基醚萃取，渦旋后離心，吸取上清液并用氮吹儀吹干。吹干后加入150 μL吡啶-3-磺酰氯，再加入50 μL碳酸氫鈉緩沖液(pH=10.71)，渦旋，于60 ℃進行水浴，40min后加入1 mL甲基叔丁基醚萃取，取上清吹干，再加入80%甲醇復溶，渦旋后離心，取上清液UPLC-MS/MS分析。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC CSHTMC18(2.1mm×100mm，1.7μm);柱溫：30℃；0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0-6 min，38%A-48%A；6-6.5 min， 48%A-38%A；6.5-7 min，38%A-38%A)；流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL。

2.4.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI源)，離子源溫度為350℃，進行正離子模式掃描，檢測模式為多反應監測(MRM)，源噴射電壓為5500V，氣簾氣(CUR)為35psi，噴霧氣為氮氣，碰撞氣為氬氣，化合物具體質譜參數參見表1。

2.5 細胞樣品方法學考察

2.5.1 方法專屬性 取細胞空白裂解液，標準品混合溶液加內標溶液，空白裂解液加入標準品混合溶液、內標溶液，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，得到三者的色譜圖，由圖1可知空白裂解液中的內源性雜質對待測物和內標的測定沒有干擾，表明方法專屬性良好。

表1 雌二醇、羥基雌二醇及內標炔雌醇的質譜相關參數

化合物母離子子離子DP(V)EP(V)CE(V)CXP(V)雌二醇414．2350．21381038112-OH雌二醇571．2365．21301038114-OH雌二醇571．2365．2130103811炔雌醇438．2374．2157103811

A標準品混合溶液色譜圖；B空白裂解液加標準品及

2.5.2 線性范圍考察和定量下限 精密吸取空白細胞裂解液90 μL置于EP管中，分別依次加入系列濃度混合標準工作溶液10 μL，制備成雌二醇濃度為0.4、0.8、1.6、2、4、8、16、20 ng/mL，2-OH雌二醇濃度為0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10 ng/mL，4-OH雌二醇濃度為0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10 ng/mL的系列對照品細胞樣品，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定。以細胞裂解液中各待測物的濃度X為橫坐標，待測物的峰面積與內標峰面積之比Y為縱坐標，求得的直線回歸方程即為標準曲線，見表3。以 10 倍信噪比(S/N=10)確定儀器的定量下限(LLOQ)，雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇分別為0.4、0.2、0.2 ng/mL。

2.5.3 精密度和準確度 精密吸取細胞裂解液90 μL，配制6份雌二醇及羥基雌二醇定量下限濃度(LLOQ)、低濃度(LQC)結果顯示乙腈作為有機相時、中濃度(MQC)、高濃度(HQC)質控樣品，雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇濃度分別為0.4、0.2、0.2，1.2、0.6、0.6，2.8、1.4、1.4，15、7.5、7.5 ng/mL，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，記錄各物質的峰面積，計算各藥物的峰面積與內標的峰面積的比值，帶入當天隨行標曲并求得各藥物的實際濃度，計算實際測定量與加入量的比值，進而求算準確度及日內、日間精密度,結果見表7-9。結果表明，該方法測定細胞中雌二醇及其羥基代謝物的日內及日間精密度均良好，滿足生物樣品分析要求。

化合物回歸方程(ng/mL)rLLOQ(ng/mL)雌二醇Y=0．2707X+0．08350．99850．42-OH雌二醇Y=0．3932X+0．0050．99870．24-OH雌二醇Y=0．3915X+0．02110．99850．2

2.5.4 基質效應考察 取細胞裂解液90 μL，分別加入低濃度、高濃度的標準品混合溶液10 μL, 配制成含雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇的LQC、HQC標準添加細胞裂解液的樣本(n=6)，按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，記錄各物質的峰面積均為A1，另用90 μL超純水代替細胞裂解液。其他步驟同上，獲得相應峰面積為A2，結果如表10所示，基質效應的計算公式為ME(%) = A1/A2×100%。由結果可知，雌二醇及其羥基代謝物、內標炔雌醇的基質效應均在85%～115%之間，即離子效應對本法結果測定影響較小，基本滿足底物定量分析的要求。

2.5.5 穩定性考察 分別考察了雌二醇及其羥基代謝物的低、高6個QC質控樣品的室溫放置2h的穩定性、自動進樣器放置24h的穩定性及樣品凍融3次穩定性，以上穩定性考察結果見表11。結果表明在上述條件下樣品均穩定。

2.6 雌二醇細胞攝取實驗 取對數生長期的MCF-7細胞，用含10%胎牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔5×105個細胞接種到6孔板，每孔體積1 mL ，置37 ℃、5% CO2培養箱中孵育過夜后貼壁，撤掉上清液，PBS溶液清洗三遍，然后加入含有雌二醇培養基2mL，雌二醇的作用終濃度為0.4μM、0.8μM、1μM，實驗設6個復孔，藥物作用時間為10、30、40、60、120、240、480、720min，在藥物相應作用時間結束時撤掉藥物，并用PBS清洗細胞表面4次，加入Ripa裂解液(含1%PMSF)200 μL，冰上裂解十分鐘，收集細胞裂解液，然后以12000 rpm離心10 min，收集上清液，取一部分用于蛋白濃度測定，另一份按“2.3”方法處理樣品，“2.4”方法進樣測定，記錄各物質的峰面積。最終細胞內的藥物量用藥物(ng)/蛋白質(μg)表示。

結果見圖4和圖5，MCF-7細胞中可以測得雌二醇及2-OH雌二醇，并呈劑量依賴性 細胞中2-OH雌二醇及雌二醇隨著時間增加而增多，而4-OH雌二醇未能測得，可能由于雌二醇在MCF-7中不經過CYP1B1代謝，而經過CYP1A1代謝。

表3 細胞中雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇日內、日間精密度及準確度測定結果(n=6)

表4 MCF-7 細胞中雌二醇及其羥基代謝物 和內標基質效應(n=5)

表5 MCF-7 細胞中雌二醇及其羥基代謝物 內標的穩定性考察(n=6)

圖2 雌二醇在MCF-7細胞中平均藥量-經時變化曲線

3 討論

本研究對流動相進行了篩選，分別考察了甲醇和乙腈作為有機相，結果顯示乙腈作為有機相時，各藥物響應值穩定性良好、分析時間縮短，基底噪音信號較小，因此選擇乙腈作為本研究的有機相。此外加入0.1%甲酸，可以顯著提高待測物的離子化效率。

圖3 2-OH雌二醇在MCF-7細胞中平均藥量-經時變化曲線

考慮到雌激素為低極性的化合物，缺少可離子化的基團，質譜響應信號較低，針對這一問題，衍生化可以提高其離子響應，本實驗比較了衍生化試劑丹磺酰氯和吡啶-3-磺酰氯的離子化效率，發現吡啶-3-磺酰氯效果更好，還考察了碳酸氫鈉緩存液的pH值對于質譜響應的影響，發現pH為10.71時響應最大，此外對衍生化時的溫度及時間也進行了考察，發現溫度60℃為宜，時間為40分鐘，溫度和時間不可過高，否則質譜響應將降低。關于萃取試劑的選擇，發現甲基叔丁基醚的萃取效果比乙酸乙酯更好。

細胞實驗中，我們也嘗試測過給藥后細胞培養基中的藥物量，發現細胞外液中可以測到4-OH雌二醇，而實驗結果發現細胞中沒有，這可能由于4-OH雌二醇可導致基因突變，細胞出于自身保護而做出的一種自發的外排行為。

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