基于GSS高通量測序技術的懷山藥根、莖中內生真菌群落多樣性分析

劉 元，李守婷，申進文，文春南，文 晴，阮 元，麻兵繼*

(河南農業大學 a中藥材系，b生物系，河南 鄭州 450002)

懷山藥(DioscoreaoppositaThunb)為“四大懷藥”之一，是河南著名的道地藥材，具有健脾益胃、生津益肺、補腎澀精等功效[1]。目前，對懷山藥的研究多集中在栽培技術、化學成分和藥理研究等方面[2-3]，而關于懷山藥與其內生真菌的關系方面的研究則較少。本課題組前期對懷山藥道地產區——河南焦作溫縣一帶的懷山藥根中內生真菌進行了初步分離純化研究，并對其中一株內生真菌厚孢鐮刀菌進行了化學成分的研究，結果表明懷山藥內生真菌能產生豐富的次生代謝產物[4]。雖然中藥材內生菌和藥材質量之間存在密切聯系，相關研究文獻也較多[5-6]，但有關懷山藥內生真菌與藥材品質之間的關聯性目前尚未見文獻報道。因此，在整體水平上對懷山藥植株內生真菌群落結構進行分析，有利于進一步闡明內生真菌與懷山藥道地性的關聯，從而為更好地開發利用懷山藥優良品質奠定基礎。另外，傳統的真菌分類鑒定主要依照真菌的形態、生長以及生理生化等特征進行研究。然而真菌的種類繁多，個體差異性不明顯，且其生長、生理生化特征也會隨著環境的變化而發生改變。因此，采用傳統方法對中藥材內生真菌進行正確的分離純化、分類鑒定均存在較大的困難。近年來隨著分子生物學技術的發展，核酸序列分析已被廣泛的應用于真菌分類鑒定中，目前常用的分子標記為內轉錄間區(internal transcribed spacer，ITS)，可根據ITS序列將真菌歸類到種或亞種水平[7]。

高通量測序技術(high throughput sequencing，HTS)具有高通量、高靈敏度、高準確性和低運行成本的特點，該測序技術已被應用于多種生態系統的微生物多樣性研究[8]。高通量測序可以深入、細致地研究微生物群落結構，從而克服由于傳統菌株分離培養的限制而導致很難獲得宿主植物完整內生真菌譜的技術障礙，近年來已應用于多個中藥材道地性的研究[9-10]。GSS高通量測序(green shield sequencing，GSS)是基于目前最常用的Illumina高通量測序技術上最新改進的一種測序技術，采用了液滴PCR技術。與普通的Illumina高通量測序技術相比，GSS高通量測序可以從源頭上消除宿主植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來的干擾，還原樣本中微生物群體的真實比例。本次測序合作單位北京艾普希隆生物科技有限公司的實驗數據表明，運用該方法所測定的真菌測序量占樣本總測序量的比例最高可升至 99.7%(水稻葉片)，這為建立完整、可靠、穩定和準確的懷山藥道地藥材內生真菌標準的譜圖庫提供了技術保障。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年10月于河南焦作溫縣懷山藥道地產區采集10株無明顯病害的懷山藥，分別隨機取根部和莖部，均勻混合后放入無菌樣品袋中，低溫保鮮，于24 h內進行表面消毒處理。

1.2 表面滅菌

將懷山藥根、莖用無菌水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒效果檢驗參照文獻[11]中的方法。

1.3 樣本DNA提取與純化

使用環境樣本DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1.4 ITS區的PCR擴增

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶有Barcode的特異引物ITS3(5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對樣本的ITS區域進行擴增，每個樣本進行3次重復，每個PCR反應終止于線性擴增期，PCR結束后將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。送北京艾普希隆生物科技有限公司對真菌的ITS區進行Paired-end測序，測序使用Illumina(MiSeq)平臺。

1.5 生物信息學分析

雙端測序得到的PE reads使用FLASH進行拼接，同時對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列等操作過程結束后完成數據過濾，得到可供后續分析的高質量目標序列。在97%的相似性水平上使用UPARS算法進行OTU的聚類，統計樣品每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。

1.6 多樣性分析

在群落生態學的研究中，物種多樣性包括Alpha多樣性(群落內)和Beta多樣性(群落間)。其中Alpha多樣性是指群落內或棲息地內的物種多樣性，通過樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度、均勻性及多樣性等信息。Alpha多樣性分析包括一系列生態統計學分析指數，如計算香農指數(Shannon index)、Chao1指數、Simpson指數、系統發育多樣性指數(phylogenetic diversity，PD)等進行生物多樣性分析[11]。豐富度指數(Chao1)和Shannon、Simpson、PD的計算用Mothur1.30.1軟件完成。

2 結果與分析

2.1 懷山藥根莖和莖中內生真菌物種組成

物種組成分析反映樣品在不同分類學水平上的內生真菌群落結構。圖1中A和B分別展示了懷山藥內生真菌在門(phylum)水平和綱(class)水平的群落結構和分類比較結果。從門水平來看，懷山藥根和莖中內生真菌主要分布在子囊菌門(Ascomycota)，僅有少量分布于擔子菌門(Basidiomycota)。從綱分類水平來看，其內生真菌主要分布在座囊菌綱(Dothideomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)中，少量分布在傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)中。懷山藥根和莖中真菌菌群分布有差異，其中莖中子囊菌門占真菌菌群的92.0%，而根中子囊菌門約占真菌菌群的97.4%。另外，盤菌綱(Pezizomycetes)真菌在莖中存在而根中沒有，而酵母菌(Saccharomycetes)為根中特有菌。

選取豐度最高的50個操作單元(OTUs)與NCBI數據庫中基因序列進行Blast比對，相似物種(相似度在97%以上)及GenBank登錄號如圖2所示。進化樹將豐度最高的50個OTUs進行展示，其中Hannaellasp.(KY305135)為懷山藥根中特有，豐度值為102；Hannaellasp.(KT962991)、Acremoniumsp.(KY988552)、Aspergillussp.(KY407901)為懷山藥莖中特有，其豐度值分別為65、89和56；Rhodosporidiumsp.(KF690377)、Ceratobasidiumsp.(KX953590)、Ochroconisconstricta(KX610329)、Fusariumsp.(KY950388)、Botryotiniafuckeliana(KX096661)、Passalorasp.(JX507956)為根和莖共有，但根中豐度值明顯高于莖；Hannaellasp.(KX758406)、Hannaellasp.(KX758405)、Derxomycessp.(KY588901)、Bulleraunica(KY101799)、Rhodotorulasp.(KY033113)和Glomerellacingulata(AB696727)為根和莖共有，但莖中豐度值明顯高于根。

圖1 懷山藥根、莖樣品中內生真菌群落分布

圖2 種水平內生真菌的系統發育樹

2.2 懷山藥根和莖中內生真菌生物多樣性

2.2.1 單個樣品復雜性

根和莖的Alpha多樣性分析的Shannon指數、Chao 1指數、PD和物種數4個指數見圖3所示。豐富度以Chao 1表示，多樣性以Shannon 指數表示，檢測到的物種的數量以Observed表示，系統發育譜系多樣性以PD表示，結果均為莖大于根。綜合各項指標顯示，懷山藥根中的物種豐富度和多樣性等均略低于莖。

圖3 樣品的Alpha 多樣性

2.2.2 稀釋曲線

稀釋曲線表明每個樣品物種的豐富度，用來反映測序情況。分別使用觀測到的物種數(Observed)、Chao 1及Shannon指數進行稀釋曲線的制作。如圖4所示,對不同的樣本分別進行分析，顏色代表不同樣本，橫坐標代表重抽樣抽出的序列數，縱坐標代表不同的多樣性值。從稀釋曲線來看，隨著測序數量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平緩但未進入平臺期，說明測序數據合理，基本覆蓋樣品中所有種群，即使再增加測序數量也只會產生少量新的OTUs。

圖4 懷山藥根、莖樣品的稀釋曲線

2.2.3 Rank abundance 曲線

Rank abundance曲線可以解釋多樣性的兩個方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀(平滑程度)反映了樣本中的物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。由圖5可知，樣品曲線斜率較大，表明懷山藥根和莖中均有優勢菌，這也與圖1中的分析結果一致。從水平方向，兩個樣品在橫軸上跨度即分類豐富度基本相當。

圖5 懷山藥根、莖樣品的Rank abundance曲線

熱度圖(Heatmap)用于表示一個或多個組的樣品在某一分類水平上的群落組成和豐度。豐度用顏色深淺來表征，方塊顏色越偏紅，說明該種的豐度越高，越偏藍色說明豐度越低?？筛鶕S度和組成進行聚類，也可按照特定的順序進行橫縱坐標的排列。由圖6可知，在種水平上，懷山藥根中豐度最高的為擔子菌門葡萄孢盤菌屬灰色霉菌(Botryotiniafuckeliana)，莖中豐度最高的為鏈格孢屬一個未知種的(Alternariasp.)。

圖6 種水平高豐度類群熱度

2.2.4 Venn圖

在OTU分析中，Venn用于表示多個組樣品的OTU共有和獨有物種情況。由圖7可知，根中特有的OTU為35個，莖中特有的OTU為75個，根和莖共有的OTU為233個。Venn圖在一定程度上反映出兩個樣品中內生真菌群落組成的相似程度，表明根和莖中相同的種類占多數，且懷山藥莖中內生真菌物種多樣性程度略高于根。

圖7 懷山藥根、莖樣品OTUs分布

3 討論

本研究首次將基于當前Illumina MiSeq測序平臺的最新改進技術GSS高通量測序技術應用于懷山藥內生真菌種群結構多樣性研究，從基因組的水平上來解析微生物群落結構，突破了很多厭氧內生真菌不能被分離培養的技術瓶頸[12]，既克服了傳統分子生物學方法存在的通量低的缺陷，又從源頭上消除植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來的干擾，還原了懷山藥根和莖中內生真菌群體的真實比例。

本研究結果表明，懷山藥根和莖樣品中內生真菌物種組成豐富，但二者在種群結構上有一定的差異。懷山藥根和莖中內生真菌在門水平上均主要為子囊菌門Ascomycota(根97.3%，莖92%)，少量分布在擔子菌門Basidiomycota(根2.6%，莖7.7%)；這與王曉龍[13]采用傳統分離培養方法研究的結果一致。在綱的水平上，主要分布有座囊菌綱Dothideomycetes(根34.1%，莖65.5%)，錘舌菌綱Leotiomycetes(根35.9%，莖8.1%)，糞殼菌綱Sordariomycetes(根22.2%，莖13.3%)；在目的水平上，主要分布于格孢腔菌目Pleosporales(根24.2%，莖60.2%)，蠟釘菌目Helotiales(根34.9%，莖7.6%)，糞殼菌目Sordariales(根20.1%，莖3.4%)；在屬的水平上，主要分布于鏈格孢屬Alternaria(根17.1%，莖33.2%)，葡萄孢盤菌屬Botryotinia(根34.1%，莖6.3%)，毛球殼屬Lasiosphaeriaceae(根20.0%，莖0.3%)；另外，GSS高通量測序結果還獲得了一部分的弱勢菌群，但由于弱勢菌群在整個物種組成中所占比例甚小，本論文未對其進行一一列舉。

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