芹黃素對布雷菲德菌素誘導的神經元樣PC12細胞內質網應激途徑的影響

趙宇紅 陳 旺 曾 宇

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(AD)以不可溶性β淀粉樣肽沉積引起神經元的毒性損傷得到較多的研究支持〔1〕。內質網(ER)是細胞內蛋白修飾及處理的場所，未折疊蛋白的蓄積可引起具有保護作用的內質網應激(ERS)，幫助細胞渡過難關，維持細胞生存，但長期過強的ERS或其應激機制的失常將誘導細胞的損傷及凋亡〔2,3〕。研究發現，缺氧、氧化應激、異常糖基化反應、鈣離子穩態的異常都可導致ERS反應造成細胞的損傷〔4,5〕。研究表明，不可溶性β淀粉樣肽沉積也可引發神經細胞ERS，參與神經退行性疾病如AD的病理生理過程，是誘導神經細胞凋亡的重要因素〔6～8〕。芹黃素具有抗氧化、抗感染、抗腫瘤等作用〔9～11〕，本課題組前期的實驗研究發現，芹黃素對AD細胞及動物模型有較好的改善作用，也可以誘導抗凋亡基因的表達〔12,13〕，但芹黃素是否對參與神經退行性病變發生的ERS途徑影響，目前報道較少。本研究觀察芹黃素對神經細胞ERS凋亡途徑的調節作用。

1 資料與方法

1.1主要試劑及儀器 布雷菲德菌素(BF)A購自(Cell Signaling Technology,美國)，兔抗大鼠微管關聯蛋白(MAP)2多克隆抗體，羊抗大鼠葡萄糖調節蛋白(GRP)78及兔抗大鼠C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)多克隆抗體(SantaCruz,美國)，Annexin V-FITC凋亡試劑盒(BD)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(Pierce,美國)，RT-PCR試劑盒(Fermentas，美國),神經生長因子(NGF)購自武漢海特生物工程公司，芹黃素購自靜琳科工貿有限公司，其他試劑均購自北京鼎國生物科技公司，流式細胞儀(FACScalibur)，PCR儀及酶標儀(Bio-RAD,美國)。

1.2細胞培養、誘導分化及鑒定 PC12細胞按1×105個細胞/ml濃度接種于培養板或培養瓶中，在10%小牛血清的DMEM培養液(Gibco,美國)，5%CO2,37℃的培養箱中培養，按文獻方法〔14〕加入NGF 50 μg/L培養7d，鏡下觀察PC12細胞長出長突起，去上清，用0.25%胰酶消化后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，1 000 r/min離心10 min,收集細胞，用流式細胞測定細胞微管關聯蛋白(MAP)2及神經元烯醇化酶(NSE)表達。

1.3藥物處理及分組 細胞培養用不同濃度的BFA處理48 h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并選取BFA 1 μg/ml作為模型組處理劑量。實驗分為對照組、模型組、芹黃素(10.00、20.00、40.00 μmol/L)組。對照組不加BFA，模型組給予BFA 1 μg/ml作用48 h，芹黃素(10.00、20.00、40.00 μmol/L)組在給予BFA前先用芹黃素10.00、20.00、40.00 μmol/L分別孵育12 h(對照組給予生理鹽水)。各組實驗終止后，同前法收集細胞進行實驗指標測定。

1.4流式細胞儀檢測 收集的細胞用PBS重懸，加入C5標記的兔抗MAP2一抗(1∶10 000)暗室孵育1 h，1 000 r/min離心10 min，PBS洗3次，上流式細胞儀測定MAP2陽性細胞比例。同上法，按Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明操作，測定凋亡細胞陽性率。

1.5MTT測定細胞存活率 接種于96孔板內的細胞，按以上各組處理后，吸出培養液，每孔加入不含血清培養基180 μl和5.0 g/L MTT 20 μl,于37℃孵育4 h后吸出，每孔加入DMSO 200 μl，37℃孵育0.5 h，在酶標儀上讀取560/630 nm處的吸光度值。

1.6RT-PCR 檢測GRP78及CHOP mRNA的表達 收集對照組、模型組、10.00、20.00 μmol/L芹黃素細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，按RT-PCR試劑盒方法操作測定GRP78及CHOP mRNA的表達。RT-PCR引物由大連寶生物有限公司設計合成，引物序列如下：GRP78 上游引物 5′GACCATGGAGAAAGCTGTAGAGGAA-3,下游引物為5′CCAAGACACGTGAGCAACTGCTA-3;退火溫度62℃,373 bp,CHOP上游引物5′-CTTTCGCCTTTGAGACAGTGTCCAG-3′，下游引物5′-CCATAGAACTCTGACTGGAATCTGGAG-3′，退火溫度60℃,223 bp；β-actin:上游引物5-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCGAGG-3′下游引物5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCCACGCT-3,退火溫度65℃,300 bp。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，掃描后，用imageJ圖像軟件處理。

1.7Western印跡檢測GRP78及CHOP蛋白表達 收集對照組、模型組、10.00、20.00 μmol/L芹黃素細胞提取總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白濃度測定，各組調整為相同濃度后，加入上樣緩沖液， 100℃水浴加熱5 min，樣品冷卻后于4℃下在12.5% SDS-聚丙烯凝膠上電泳，每孔上樣量為10 μl,以Marker為參考，切取目的條帶蛋白轉于NC膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入抗GRP78(1∶1 000)，抗CHOP(1∶1 000)和抗β-actin(1∶1 000)抗體，4℃冰箱過夜，取出，TBS洗10 min×2次，加入相應熒光二抗，37℃孵育1 h,TBS洗10 min×2次,免疫信號用增強型化學發光法顯色，曝光到X 線膠片上。將X 線膠片掃描后，用ImageJ1.41 分析軟件進行灰度分析。

1.8統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行LSD及χ2檢驗。

2 結 果

2.1NGF誘導神經元樣PC12細胞鑒定 倒置顯微鏡可見PC12細胞突起明顯變長，細胞呈現三角形，貼壁生長，具有神經元樣形態。MAP2平均陽性率為(94.78±3.60)%,顯示PC12細胞經誘導后具神經元樣特性。

2.2不同濃度BFA對神經元樣PC12細胞凋亡的影響 BFA在0.05，0.10,0.50,1.00,5.00，10.00 μmol/L的濃度范圍內可呈劑量依賴性抑制神經元樣PC12細胞凋亡,隨BFA濃度增大，細胞凋亡率增加，各組細胞存活率分別為(92.26±3.48)%、(72.62±6.70)%、(61.33±4.63)%、(32.54±6.50)%、(28.18±3.18)%、(3.96±2.02)%，為實驗方便，我們選取BFA 1.00 μg/ml(即0.283 μmol/L)作為誘導凋亡劑量。

2.3芹黃素對BFA誘導的神經元樣PC12細胞存活率的影響 用芹黃素10.00、20.00、40.00 μmol/L預處理經BFA誘導凋亡的神經元樣PC12細胞后，細胞存活率分別為(48.72±4.07)%、(60.65±4.80)%及(63.20±5.18)%，與對照組(100.00±2.46)%差異無統計學意義(P值分別為2、62、3.71、3.86)，表明芹黃素對細胞無毒性損傷；但與模型組〔(32.19±2.91)%〕比較差異有統計學意義(P值分別為0.013、0.022、0.031)，表明細胞的存活率提高比較明顯。

2.4芹黃素對GRP78、CHOP mRNA表達的影響 如表1所示，與對照組GRP72、CHOP mRNA比較，BFA可誘導細胞GRP78、CHOP mRNA表達增加，10.00、20.00 μmol/L的芹黃素預處理均可明顯減少細胞GRP78、CHOP mRNA的表達。

表1 芹黃素對GRP78、CHOP mRNA表達的影響

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.5芹黃素對GRP78、CHOP 蛋白表達的影響 BFA可誘導細胞GRP78、CHOP 蛋白表達增加，10.00、20.00 μmol/L的芹黃素預處理均可明顯減少細胞GRP78、CHOP 蛋白的表達，見表2。

表2 芹黃素對GRP78、CHOP蛋白表達的影響

3 討 論

ERS在神經退行性疾病發生中的作用漸受關注〔15～17〕。PC12細胞具有神經內分泌細胞的特性，但其蛋白表達與神經元存在差異性〔18〕。但在NGF誘導后，PC12細胞即出現蛋白表達的變化，用NGF誘導7 d，PC12細胞的形態學變化不可逆，具有神經元樣功能〔19，20〕。本文與上述研究結果一致。BFA是一種天然存在的大環內酯類抗生素，它能特異性地阻斷蛋白質從ER向高爾基體復合物轉運過程，引起ER蛋白質處理的障礙，誘導ERS的發生，引起細胞凋亡〔21〕，本實驗表明ERS模型的建立，與文獻報道結果相同〔22～24〕。GRP78表達上調具有ERS特異性,常被用作ERS 的標志性分子〔25，26〕。本實驗觀察發現，用芹黃素處理PC12分化細胞，可降低由BFA誘導的GRP78 高表達，提示芹黃素可減輕ERS反應，可用作抑制ERS損傷的有效藥物。芹黃素化學名為4′,5,7-三羥基黃酮，屬黃酮類化合物， 研究發現，某些黃酮類成分可通過降低GRP78表達，減輕ERS嚴重程度，減輕滑膜炎癥損傷及缺血心肌再灌注損傷，產生保護作用〔27～29〕。ERS發生后，細胞將存亡決定于細胞內穩態的維持; 若細胞內穩態遭到破壞，未折疊蛋白反應(UPR)將作為凋亡的執行者，去除組織中的損傷細胞。因此CHOP被認為是ERS凋亡途徑信號途徑中最重要的成員〔30,31〕。本實驗表明芹黃素可通過抑制ERS誘導的DNA損傷相關基因表達,抑制由ERS誘導的凋亡途徑，產生細胞保護作用。

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