白芍對斜視性弱視模型貓視皮質N-甲基-D-天冬氨酸受體1表達的影響

石 晶 譚小波 楊 潔 郝佳穎 李 偉 李 娜 何 彥

(承德醫學院附屬醫院眼科，河北 承德 067000)

弱視是指眼底沒有發生顯著的器質性病變，主要由于屈光參差、形覺剝奪或雙眼高度屈光不正、單眼斜視等因素導致單或雙眼視力下降〔1〕。弱視對患者視力會產生影響。雖然弱視能完全醫治，但如果錯過了最佳治療時期會影響最佳的治療效果，降低生活質量。因此，對弱視的有效治療已經成為研究熱點〔2～6〕。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 白芍(RPA，西安天瑞有限公司)；N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)1引物 (生工生物科技有限公司)；25%戊二醛(鄭州雅盛電子科技有限公司分裝)，Trizol試劑(GIBCO-BRL公司)，RNA LA PCRTMkit(AMV)試劑盒(TaKaRa公司)，SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa公司)。實時定量聚合酶鏈反應數據分析軟件StepOne plus，ABI PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司，美國)，電子天平(上海精天電子儀器有公司)。微電極拉制器，視覺電生理系統(羅蘭，德國)。

1.2動物 初生家養幼貓18只，體重約350 g，雌雄不分，在天津醫科大學實驗動物中心飼養1 w，常規檢查雙眼，確認外眼、屈光間質及眼底無異常。隨機分為正常組、模型組及RPA組，各6只。其中模型組和RPA組水合氯醛麻醉后造模：用碘伏常規消毒左眼，沖洗結膜囊(慶大霉素)，沿角膜緣剪開顳側球結膜，隨后進行分離結膜下筋膜，在赤道部用斜視鉤勾出外直肌，然后剪斷外直肌，分離周圍筋膜，將球結膜整理好，慶大霉素再次沖洗結膜囊，待蘇醒后送回動物房。3組均飼養在動物房中，自由飲水。給藥方法：RPA組每日分別按100 mg/kg灌胃RPA。模型組和正常組均灌服等體積生理鹽水，連續30 d。

1.3視覺誘發電位 麻醉幼貓后在其人字縫頂點上方的正中線開一小洞至皮質，插入針電極作為作用電極，其中Ag-AgCl置于前額做參考電極，另一盤狀電極置于右耳作為地電極。然后固定好貓，確認其視網膜中央區的反向延長線投射在刺激器中央位置，并用相應的鏡片矯正屈光。采用棋盤格反轉刺激，距離50 cm，刺激模式是0.3 cpd，每個空間頻率掃描10次。圖形視覺誘發電位(PVEP)及掃描視覺誘發電位(SVEP)測量均在暗室中進行。

1.417區的細胞外記錄 麻醉幼貓后采用苯腎上腺素收縮瞬膜，檢影雙眼，隨后配戴合適的接觸鏡。將貓頭固定在立體定位儀上，暴露貓顱骨，在右側半球P-5，L-3處直徑切開顱骨并去除硬腦膜。采用視覺刺激系統，刺激條件：調整微電極拉制器的磁力為2.5，熱力為4.0。微電極記錄：①僅對右眼刺激有反應；②兩眼放電頻率有差異；③雙眼分別刺激時放電頻率基本一致；④兩眼放電頻率存在差異；⑤僅對左眼刺激有反應。

1.5實時定量聚合酶鏈反應 將眼組織加入Trizol中勻漿，每1 ml Trizol 加入0.2 ml 三氯甲烷；劇烈混合30 s后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相層液體小心轉移至新離心管中；加入0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃ 12 000 r/min離心10 min，可見少量RNA沉淀；棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀2次；4℃ 7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA沉淀。取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。將溶解后的RNA按試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增。引物見表1，擴增條件為95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 32 s，共40個循環。

1.6統計學處理 采用SPSS10.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)。

表1 引物序列

2 結 果

2.1各組左眼SVEP視力比較 與正常組〔(1.35±0.19)cpd〕相比，模型組左眼SVEP視力〔(0.73±0.24)cpd〕明顯下降(P<0.01)，RPA組〔(1.34±0.08)cpd〕與模型組比較，左眼SVEP視力明顯上升(P<0.01)。

2.2各組左眼PVEP視力比較 與正常組相比，模型組及RPA組左眼N75及振幅值差異無統計學意義(P>0.05)。與正常組相比，模型組P100值及N75-135顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，RPA組P100值及N75-135顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組左眼PVEP視力比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3RPA對斜視弱視貓17區眼驅動細胞的影響 模型組左側17區眼驅動細胞水平(3.74±0.68)較正常組(4.95±0.71)明顯下降(P<0.01)，RPA組顯著上升(12.02±1.02，P<0.01)。模型組右側17區眼驅動細胞水平(21.33±1.19)較正常組(5.01±0.72)明顯上升(P<0.01)，RPA組(11.15±1.07)較模型組顯著下降(P<0.01)。

2.4各組左側17區、左側21a區NMDAR1 RNA表達水平比較 模型組左側17區、21a區NMDAR1 RNA表達水平(0.46±0.15，0.53±0.13)較正常組(1.75±0.22，0.81±0.21)明顯下降(P<0.01)，RPA組NMDAR1 RNA表達水平(0.72±0.20，0.75±0.11)顯著高于模型組(P<0.01)。

2.5各組右區17區、右側21a區NMDAR1 RNA表達水平比較 模型組右側17區、21a區NMDAR1 RNA表達水平(0.62±0.16，0.43±0.15)較正常組(18.2±0.22，1.48±0.40)明顯下降(P<0.01)，RPA干預組NMDAR1 RNA表達水平(1.05±0.21，0.68±0.25)明顯高于模型組(P<0.01)。

3 討 論

弱視是視覺的異常發育，其治療的關鍵在于發現及時、早期治療。遮蓋治療是治療弱視最有效的方法，無論在什么年齡段都適用，但是此治療方法也存有弊端，即治療時間太長及依從性欠佳〔7～9〕。中樞神經系統的視皮層是弱視主要的病變位置，最初發生在初級視皮層水平，隨后擴大到更高的視覺水平〔10〕。阿托品、縮瞳劑、左旋多巴等藥物治療也在臨床中應用，但是一般作為二線治療方案〔11～16〕。因此，臨床迫切需要尋找一種新的有效的藥物治療弱視。本實驗研究表明，RPA能顯著提升幼貓SVEP視力、PVEP視力，提高17區的眼驅動細胞數，使NMDAR1表達上升。重建患者受損視皮層發育的可塑性，同時恢復神經元的形態以及功能是弱視治療的基本，進而修復神經傳導通路，使皮層內神經元的興奮性同步，最終使分別接受雙眼的視皮層區域達到均衡狀態。

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