脊髓小膠質細胞調控神經病理性疼痛的分子機制及中醫藥干預的研究進展

曹人酈，袁 蓓，顧艷麗，張立石，王 超，何海軍，林 娜

(1中國中醫科學院中藥研究所,北京100700；2內蒙古醫科大學,內蒙古呼和浩特010110；3中國中醫科學院中醫基礎理論研究所,北京100700；4中國中醫科學院望京醫院,北京100102)

0 引言

神經病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由軀體感覺系統的損害或疾病導致的疼痛,主要表現為自發性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏、感覺異常及情感障礙等［1］。NP發病機制復雜,既往研究多從神經元角度闡釋NP病理機制,研究表明,NP發病機制與神經元G蛋白偶聯受體、離子通道受體、細胞因子受體等激活介導的周圍敏化相關,亦與炎癥因子、細胞因子等介導的中樞敏化相關,主要表現為興奮性突觸傳遞增強和抑制性突觸傳遞減弱［2－5］。NP臨床治療十分棘手,目前,阿片類藥物或三環類抗抑郁藥等均以抑制神經沖動為目的,并未針對病因或某個病理階段特異性靶點進行干預,且常伴隨嚴重的中樞副作用［6］。近年發現,中樞神經系統,特別是脊髓水平的小膠質細胞可通過直接連接、突觸連接或釋放神經遞質影響神經元功能,并通過長時程增強作用(long-term potentiation,LTP)參與 NP 病理［7］,在 NP 發生、發展中發揮重要作用,并為NP治療提供了可能的靶點。本文基于動物實驗研究歸納了近年來脊髓水平小膠質細胞調節NP的分子機制及中醫藥干預NP作用機制的研究進展,期望為 NP的治療及科學研究提供參考。

1 脊髓小膠質細胞參與神經病理性疼痛

小膠質細胞是中樞神經系統的免疫活性細胞,相當于周圍組織的巨噬細胞,正常靜息狀態下處于穩定狀態,并有支持、連接、保護及營養神經元的作用,但受損傷刺激后的小膠質細胞會迅速對神經損傷做出反應［1,8］,并表達多種標志性蛋白,啟動細胞內相關信號通路,進而釋放炎癥介質導致神經功能的紊亂。

1.1 小膠質細胞活化因子及受體 神經元釋放趨化因子、核苷酸、促炎因子等均可通過相應受體激活小膠質細胞。如,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、高遷移率族蛋白-1(high mobility group box protein 1,HMGB1)、神經調節蛋白1(neuregulin 1,NRG1)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、趨化因子 2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2)、趨化因子Fractalkine(Fractalkine,FK)等。

ATP可通過損傷相關分子模式(danger/damageassociated molecular patterns,DAMPs)活化嘌呤離子通道型受體(purinergic receptor),如P2X4R、P2X7R而激活小膠質細胞,相關受體拮抗劑能緩解NP模型動物低痛敏狀態［9－10］；HMGB1可通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs),如,Toll樣受體2、4(toll-like receptors 2/4,TLR2/4)及糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)活化小膠質細胞,而抑制HMGB1介導的信號通路能緩解小膠質細胞介導的神經炎癥［11］；NRG1與受體酪氨酸蛋白激酶ErbB(receptor tyrosine-protein kinase erbB)2,3,4結合可通過有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)促進小膠質細胞活化［12－13］；神經損傷還能促進MMP-9表達介導小膠質細胞參與的神經炎癥［14－15］；CCL2 也能通過趨化因子 2 受體(CC-chemokine receptor 2,CCR2)活化小膠質細胞,CCL2/CCR2介導的信號通路在NP痛敏維持中發揮重要作用,研究表明,CCR2基因敲除動物NP痛敏明顯降低,CCR2 拮抗劑能有效提高動物痛敏閾值［16－17］；FK位于神經元表面,其受體為CX3CR1(CX3C-chemokine receptor 1,CX3CR1),被組織蛋白酶S(Cathepsin S,CatS)裂解的FK,不僅能增加神經元的興奮性,還能通過FK/CX3CR1信號通路促進小膠質細胞活化繼而誘導神經炎癥反應［18］。

其他類型的受體還有神經遞質受體,如,谷氨酸受體,γ-氨基丁酸受體,膽堿能受體,腎上腺素受體,多巴胺受體等［19］；激素受體及調節器受體包括組織胺受體,阿片受體,大麻素受體,P物質受體,神經營養因子受體,其他類型的趨化因子受體,白介素受體,干擾素受體等,均能通過相應配體參與小膠質細胞活化［20－23］。

1.2 小膠質細胞活化后的信號通路 小膠質細胞活化以細胞內相關信號通路激活及分泌相關炎性介質為主要表現,進而影響突觸傳遞和神經元的興奮性,其活化主要和以下信號通路相關：有絲分裂原活化激酶(mitogen activated kinase,MAPK)信號通路,核因子 κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號通路,蛋白質酪氨酸激酶/轉錄活化子3(Janus tyrosine kinase/transducer and activator of transcription 3,JAK/STAT3)信號通路及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶Akt(Phosphoinositide 3-kinase/protein Akt kinase,PI3K/Akt)信號通路。

1.2.1 MAPK信號通路 MAPK信號通路包括ERK,p38 MAPK,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介導的信號通路［24－27］。 研究發現,神經損傷可誘導小膠質細胞p38磷酸化,但星形膠質細胞和神經元中無明顯p38磷酸化現象［28］,白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)可以促進 p38磷酸化,表明IL-1β參與p38上游機制［29-32］,p38抑制劑能提高 NP 動物痛敏閾值［33－34］。 ERK1/2磷酸化與 NP 痛敏改變密切相關,神經損傷可誘導ERK在小膠質細胞、星形膠質細胞及神經元中時序性改變,研究表明,ERK信號通路活化能調控蛋白酶活性并產生多種細胞因子,如,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),IL-1β 等參與 NP 痛敏的產生［35－37］。JNK主要存在于星形膠質細胞,研究發現,使用JNK抑制劑D-JNKI-1JNK可以提高NP動物機械痛敏閾值［38］；體外研究顯示,星形膠質細胞活化與JNK信號通路密切相關,并能誘導單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的分泌［39］。 而最近研究顯示,坐骨神經慢性壓迫損傷(chronic constriction injury,CCI)模型中,小膠質細胞內JNK信號通路也會被激活,并且在第七天達到峰值［40］。

1.2.2 NF-κB信號通路 NF-κB是在B淋巴細胞中發現的一種核轉錄因子,參與多種細胞因子的調控。NF-κB 有 5 種亞型：p50,p52,p65,c-Rel和 Rel-B［41］。在神經系統中,NF-κB僅以p50或p65兩種亞型存在［42］。NF-κB主要通過經典途徑和非經典途徑通路調控炎癥反應,其中,細胞因子受體及Toll樣受體參與的經典途徑與NP病理密切相關［43－44］。研究發現,抑制膠質細胞NF-κB信號通路可通過NP動物模型痛敏閾值,并促進IL-6和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表達［45］。

1.2.3 JAK/STAT3信號通路 JAK/STAT3信號通路主要參與細胞轉導［46］,細胞因子,如,IL-6,γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-10 與其受體結合能誘導JAK活化,進而迅速誘導STAT磷酸化而發揮轉錄功能。研究表明,STAT3在小膠質細胞活化過程中發揮重要作用［47］,如,STAT3能下調脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導的小膠質細胞炎癥因子(如iNOS,IL-6,CCL5 等)的釋放［48］；IL-6 誘導 JAK/STAT3信號通路活化也能促進 iNOS、IL-18、TNF-α和CCL2等因子的釋放［49］；研究還表明,STAT3能調控細胞生長和分化,JAK/STAT3信號通路不僅與小膠質細胞增殖相關,還參與小膠質細胞極化過程［49］。

1.2.4 PI3K/Akt信號通路 胰島素及LPS可通過PI3K/Akt信號通路誘導小膠質細胞活化。PI3K/Akt信號通路與細胞生長、增殖、代謝等多種細胞功能相關。研究表明,PI3K可通過一系列轉化激活Akt［49］,而Akt下游調節在NP病理中發揮重要作用,如,PI3K/Akt能調控突觸可塑性和 LTP［50－52］。

1.3 小膠質細胞活化釋放的炎癥介質 小膠質細胞具有隨周圍環境變化向M1或M2型小膠質細胞轉化的極化現象,用LPS刺激小膠質細胞能誘導其向M1型細胞轉化釋放促炎因子,如,IL-1β,IL-6,IL-12,IL-15,IL-18,IFN-γ,TNF-α,CCL2-5,CCL7,環氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)和 iNOS 等［53］；而用抗炎化合物如IL-4,IL-13等能誘導小膠質細胞向M2型細胞轉化,使促炎表型失活,重建細胞自穩并誘導小膠質細胞分泌一系列鎮痛因子,如,IL-1α、IL-1ra、IL-3、IL-10及組織型基質金屬蛋白酶抑制因子-1,神經生長因子,轉化生長因子-β等［54］。相關研究為從小膠質細胞極化角度治療NP提供了思路。

1.4 小膠質細胞與其它細胞的相互作用 在NP病理演化的不同階段,小膠質細胞還與神經元及其它細胞存在動態、復雜的相互作用關系,如,星形膠質細胞活化依賴于小膠質細胞激活,二者動態的相互作用介導了NP的啟動和維持［55］；神經受損后,血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)上皮細胞黏附分子-1能促進小膠質細胞活化［56－57］；少突膠質細胞可釋放 IL-33并通過IL-33/ST2途徑激活小膠質細胞內 PI3K,MAPKs,NF-κB 信號通路［58－59］。 肥大細胞不僅脫顆粒敏化傷害性感受器,還能通過BBB及血脊髓屏障與小膠質細胞相互作用,研究表明,肥大細胞中的類胰蛋白酶能通過蛋白酶激活受體2信號通路促進小膠質細胞釋放 TNF-a,IL-6［60］；神經損傷也能誘導CD4+－T淋巴細胞滲透到脊髓背角通過CatS/IFN-γ信號通路或CD40途徑與小膠質細胞相互作用,并參與觸誘發痛的形成［61－62］。

2 中醫藥單體以及復方對小膠質細胞的調控作用

中醫藥以中醫理論為基礎,辨證論治為原則,千百年來在干預慢性疼痛方面發揮了重要作用,中醫藥不僅重視疼痛癥狀,更依據疼痛產生的原因進行求本治療［63－64］。研究表明,許多中藥及復方有抑制NP小膠質細胞活化的作用。

早在公元前3世紀我國便有利用大麻緩解疼痛的記載,大麻的活性化合物大麻素2型受體--β-石竹烯能抑制小膠質細胞的活性,具有抗炎和鎮痛作用［65－66］。雪上一支蒿中的一枝蒿甲素是二萜類生物堿,這種單體成分通過促進脊髓小膠質細胞分泌強啡肽 A 緩解中樞敏化作用［67］。 鉤吻子素［68］,白藜蘆醇［69］,蒿本內酯［70－71］都可以降低 LPS 誘導的原代小膠質細胞炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6的產生,有效緩解NP痛覺過敏,研究認為,其抑制小膠質細胞激活和促炎細胞因子的產生為其抗炎和神經保護作用的關鍵。墨西哥鼠尾草中的鼠尾草提煉劑(salvinorin A)是一種非含氮的kappa阿片類藥物受體激動劑,實驗結果表明,SA可有效減少福爾馬林誘導的機械性痛覺過敏及脊髓神經元的高興奮性［72］。丹參的主要有效成分丹參酮IIA可以有效抑制脊神經結扎(spinal nerve ligation,SNL)模型動物脊髓小膠質細胞活化,其機制與抑制MAPKs活化及減少TNF-α、IL-1β的表達相關［73］?；⒄忍崛∥飳CI誘導的機械性痛覺過敏有顯著的抑制作用,研究表明,其機制可能與抑制脊髓小膠質細胞ERK和p38的磷酸化相關［74］。黃芩中的黃芩苷可明顯升高CCI大鼠術后的機械痛敏閾值,且其鎮痛作用維持時間優于嗎啡［75］。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素,具有抗炎和抗氧化等多種藥理作用,其可以通過下調IκB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,Iκ-Bk)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的活性抑制NF-κB的激活及其調控的相關基因表達,而神經損傷誘發活化的NF-κB可通過上調脊髓CX3CR1表達參與NP的形成［76］。屬于裂環環烯醚萜的莫諾苷可通過激動脊髓胰高血糖素樣肽1受體(glucagonlikepeptide1,GLP-1)對 NP產生鎮痛作用［77］。 異構體芍藥苷［78］(isomers paeoniflorin,PF)和芍藥內酯苷［79］(albiflorin,AF)是從芍藥的根中提取的主要成分,研究表明PF和AF均可抑制脊髓小膠質細胞p38絲裂原活化蛋白激酶通路的激活并降低促炎細胞因子的表達。梓醇是從地黃根部提取的一種環烯醚萜類小分子化合物,研究表明,梓醇能通過調節TNF-α和AKT抑制NF-κB信號通路,進而抑制小膠質細胞激活,減少炎癥因子的釋放；中藥材獨一味也有相似的藥效及作用機制［80－81］。

由當歸、肉桂和葛根等組成的當歸四逆湯的水提物組,廣泛用于炎癥和缺血性疾病的治療,其治療NP的機制可能與抑制脊髓小膠質細胞、星形膠質細胞活化及抑制炎癥介質的表達相關,研究發現,當歸四逆湯能通過抑制脊髓NF-κB活化和/或細胞因子表達有效緩解CCI和糖尿病神經病變［82］。中醫藥復方身痛逐瘀湯也可有效的緩解CCI大鼠的神經病理性疼痛痛覺過敏,改善大鼠患側后肢運動功能,其機制可能與下調脊髓磷酸化p38蛋白表達有關［83］。

NP的其它治療方法還包括理療、針灸、介入手術等,如電針鎮痛機制與抑制小膠質細胞p38 MAPK通路相關［84］。

NP發病機制復雜,疼痛相關信號調控原件功能又非單一,而目前NP治療從技術上還達不到靶向病變細胞相關靶點進行特異性干預,所以,針對疼痛信號傳導通路中某一靶點的干預必然伴隨副作用,這也在阿片類藥物、三環類抗抑郁藥物、離子通道抑制劑等臨床應用的副作用中得到證實［6］?；贜P發病機制復雜及目前廣泛應用治療NP的藥物非證候考慮的情況,我們初步根據經典證候方劑-烏頭湯及蒙藥那如-3進行了病證結合動物模型的探索,課題組采用經典的腰5脊神經結扎模型探索NP的證候,從SNL模型小鼠尿液代謝、毛色變化及烏頭湯、蒙藥那如-3脊髓組織炎癥因子的變化情況我們認為：SNL模型可模擬臨床的“寒痹”、“冷痹”疼痛模型［63］。而病證結合的早期干預(烏頭湯、蒙藥那如-3)不僅能有效緩解實驗動物的病情進展,還能抑制脊髓膠質細胞的活化和降低實驗動物脊髓背角組織炎癥因子的表達［85－86］；既往多認為炎癥變化多與中醫的熱證密切相關,本研究為中醫熱證等同于“炎癥因子”的認識提供了另一種解釋：不同模型的炎癥反應只是綜合證候的一個方面,微觀病理不能完全代表證候的綜合表象。

基于中醫藥辨證及多靶點干預疾病的特點,我們采用不同慢性疼痛動物模型研究發現,烏頭湯鎮痛機制與抑制周圍神經瞬時受體電位通道蛋白活性相關［87］；其主要成分-制川烏兼具激動脊髓內源性kappa受體及抑制瞬時受體電位通道蛋白V1活性的雙重作用［88］；在SNL模型中,我們發現,烏頭湯對小膠質細胞及星形膠質細胞具有多靶點的抑制效應,并在脊髓組織基因芯片結果中得到證實［85－86］,相關機制可能是間接發揮,但對NP病證結合的臨床辨證干預可能具有借鑒和指導意義。

3 小結及展望

中樞敏化是NP的主要發病機制,既往多從神經元突觸重塑角度闡述NP病理,近年發現小膠質細胞亦與NP中樞敏化密切相關,并與神經元、其他膠質細胞、淋巴細胞等存在動態、廣泛、復雜的網絡聯系,共同參與了NP的發生、發展和維持。NP發病機制復雜,受倫理學限制及研究條件的限制,目前絕大多數研究多采用實驗動物作為研究對象,且時有相互矛盾的結果,而人類小膠質細胞無論從結構和功能上均有差異于動物的復雜性,故目前的研究均存在不同程度的局限性,相關機制有待于進一步深入研究。如,在NP病理演化過程中,于體外研究或動物水平,雖然對小膠質細胞活化因子、小膠質細胞相關受體蛋白、小膠質細胞釋放的炎癥介質等有較深入的研究,但其時間、空間復雜的相互作用關系目前還未闡明；在不同刺激因子作用下,小膠質細胞可適應微環境變化表現出不同亞型或表型,而使得NP發病機制更加復雜,小膠質細胞極化可能為NP治療提供了新的靶點及切入點,但受目前研究對象及技術手段的限制其相關研究還有待于進一步深入；再比如,小膠質細胞在NP病理演化過程中存在動態的、復雜的背景信號通路網絡及相互關系,且特定的信號通路調控原件的功能也不是單一的,故針對某一個靶點的特異性干預可能伴隨嚴重的副作用,這也是針對小膠質細胞特定靶點開發新藥困難的原因。

目前,NP多靶點干預的治療理念得到認同［63－64］,這也與中醫藥辨證論治綜合干預慢性疼痛的理念不謀而合,中醫藥治療慢性疼痛不僅重視疼痛或痛覺過敏癥狀,更重視引發疼痛的原因及綜合證候表現,針灸、拔罐、按摩、藥物敷貼、辨證用藥等綜合干預某些類型NP的有效性均得到臨床驗證。目前,NP的主要干預手段仍是藥物治療,還無特異性治療神經損傷的中藥或中成藥,小膠質細胞為NP啟動的“關卡”,并和周圍其他細胞形成復雜的相互作用,從而成為重要的NP干預靶細胞,結合NP不同動物模型中小膠質細胞病理演化的微觀辨證,可能有益于NP的臨床有效干預及新藥研發?；诩纫羊炞C的中醫藥多途徑、多靶點抑制小膠質細胞神經炎癥的事實,我們可以采用反向醫學研究的方法,聚焦于NP發病的特定病因、業已證明的關鍵靶點、特定病理階段點及證候特點,臨床采用宏觀辨證與微觀辨證相結合的方法藥物整體調節,促進機體證候的改善并關注神經炎癥及損傷改善的關鍵點［89－90］,并在誘導性多功能干細胞分化的髓系前體細胞水平驗證,進而從天然藥物中篩選NP治療的特異性藥物,且必須關注整體證候,如針對特異性神經損傷,疼痛明顯者可從“寒痹”角度進行研究驗證；再如,糖尿病神經損傷單純采用對癥治療的方法效果并不理想,根據中醫絡病理論,針對臨床患者某一階段的病理變化,采用補氣活血,化瘀通絡或清利濕熱的方法篩選特定標志物,關注與小膠質細胞聯系的關鍵點,結合體外誘導的人小膠質細胞水平的驗證等,可能對特異性神經損傷的治療具有標本兼治的作用。

總之,NP發病機制復雜,有待于進一步深入研究；小膠質細胞介導的神經炎癥機制的發現為NP治療提供了可能的靶點；針對不同病因、不同病理階段,采用宏觀辨證與微觀辨證相結合的方法進行綜合干預可能有益于NP的治療；結合髓系前體細胞誘導人小膠質細胞體外培養技術及反向醫學驗證的思路,對特定病因、特定病理階段的NP新藥研發也可能具有一定的借鑒意義。