生防菌對杧果主要病害病原菌室內抑菌試驗

張賀，楊石有，汪熊夢琦，劉曉妹，漆艷香，蒲金基

(1.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 ?？?571101；2.海南大學熱帶農林學院，海南 ?？?570228)

杧果種植過程中常遭受多種病害，如刺盤孢屬Colletotrichumspp.真菌引起的杧果炭疽病，鏈格孢屬Alternariaspp.真菌引起的杧果鏈格孢葉斑病，以及由鐮孢屬Fusariumspp.真菌引起的且在金沙江干熱河谷暴發成災的杧果畸形病[1-4]，這些病害不同程度地威脅著杧果健康生長[5]。施用農藥是防治病害的重要措施，隨著杧果種植面積逐年擴大，病害防治難度加大，化學農藥使用量總體呈上升趨勢。過量使用農藥不僅增加生產成本，也影響杧果質量安全和生態環境安全。實現農藥減量控害，是當前杧果病害防治的難題之一。

以菌治菌是植物病害防治的重要方法之一，前人在此方面的研究也取得了積極進展[6-9]。為篩選對杧果重要病害有良好防效的生防菌，作者用前期得到的生防菌和市售的生防菌劑，采用平板對峙培養法測定其對刺盤孢屬、鏈格孢屬、鐮孢屬等27株病菌菌株的室內抑菌效果，以期初步獲得對杧果單一病害或多種病害均有良好防效的生防菌，為杧果病害的生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病菌菌株 刺盤孢屬8株，編號為2K120cg、2K345cg、A1、bca、Lcg1、mac9、Mcg、Tai；鏈格孢屬9株，菌株編號為A108、A157、A406、A452、A456、A466、A483-1、A92、A93；鐮孢屬10株，菌株編號為FM4、MMD1、MMD12、MMD14、MMD17、MMD20、MMD27、MMD29、MMD30、MMD4。27株病菌菌株由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組提供，每個屬的病菌菌株均分離自病害發生嚴重的海南省三亞市、樂東縣、東方市，云南省保山市，廣西壯族自治區百色市，四川省攀枝花市等杧果主產區。

1.1.2 供試生防菌劑 枯草芽孢桿菌S1，山東省梁山縣陽光生物工程研究所；枯草芽孢桿菌S2，北海群林生物工程有限公司；枯草芽孢桿菌S3，云南星耀生物制品廠；嗜冷·枯草·納豆芽孢桿菌S4，山東寶來利生物工程股份有限公司；側孢芽孢桿菌S5，河南省沃寶生物科技有限公司；巨大芽孢桿菌S6，河南省沃寶生物科技有限公司；地衣芽孢桿菌S7，臨沂十七狼飼料有限公司；蠟質芽孢桿菌S8，山東泰洛藥液有限公司；枯草·納豆·地衣芽孢桿菌·硝化細菌S9，西安富祺生物科技有限公司；市售的生防菌劑地衣芽孢桿菌S10，山西凱盛肥業集團有限公司；解淀粉芽孢桿菌S11，山西凱盛肥業集團有限公司。

1.1.3 供試生防菌 生防酵母菌JM由實驗室篩選而得；枯草芽孢桿菌5a-9、6a-3、6c-5、6c-5、FCK、B1和Z10由海南大學劉曉妹教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 病菌培養和生防菌菌懸液制備 刺盤孢屬、鏈格孢屬和鐮孢屬病菌接種在PDA平板上，28 ℃培養4 d之后，用無菌打孔器在菌落邊緣打直徑5 mm菌餅，用于接種LB平板(直徑9 cm)的正中央備用。

將市售11種生防菌劑依有效成分含量用LB培養液系列稀釋至濃度為2×107個/mL的菌懸液，6種生防芽孢桿菌(編號為5a-9、6a-3、6c-5、FCK、B1、Z10)和1株生防酵母菌JM接種于LB培養液中，28 ℃、120 r/min 恒溫搖培24 h后，系列稀釋法配置成菌體濃度為2×107個/mL的菌懸液備用。

1.2.2 生防菌抑菌作用檢測 采用平板對峙培養法。LB平板中央接種靶標病菌，同時在其夾角呈90°的四周、間距靶標病菌3.0 cm處接種2.5 μL生防菌液，28 ℃恒溫培養3 d后測定病菌菌落直徑、抑菌帶寬度，并根據尹敬芳 等[10]人的方法計算生長抑菌率，每個處理3個重復。

1.2.3 數據分析 采用Excel 2003統計數據、計算生長抑菌率，SAS數據處理系統運用鄧肯新復極差法進行方差分析，運用HemI 1.0.3.3軟件以抑菌率繪制直觀可視化的熱圖，展示不同生防菌對不同病菌的抑菌效果，每個小方格表示一個生防菌對一個病菌菌株的抑菌效果，用行表示不同病菌、用列表示不同生防菌，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低，綜合分析不同病菌與不同生防菌之間抑菌效果差異[11]。

2 結果與分析

2.1 生防菌對刺盤孢屬病菌菌絲生長的拮抗作用 供試的生防菌對刺盤孢屬的8個菌株有明顯的抑菌效果，平均抑菌率為17.27%～36.77%。生防菌劑枯草芽孢桿菌S3顯著強于其他的生防菌，其平均抑菌率為36.77%；其次為巨大芽孢桿菌S6和枯草芽孢桿菌FCK，平均抑菌率分別為27.59%和25.96%，二者差異不顯著(表1)。

表1 生防菌對木亡果主要病原菌抑菌率 %

注：根據Duncan’s多重比較，同列不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

生防菌劑枯草芽孢桿菌S3對供試的8個菌株均有較強的抑菌效果，其中對Mcg菌株的抑菌效果最強，抑菌率53.79%，抑菌帶1.03 cm；多個生防菌菌株對bca菌株有較強抑菌效果(圖1)。

注：以抑菌率作熱圖，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低。圖1 生防菌對刺盤孢屬病菌菌絲生長抑菌率

2.2 生防菌對鏈格孢屬病菌菌絲生長的拮抗作用 供試的生防菌對鏈格孢屬的9個菌株有明顯的抑菌效果，平均抑菌率為9.77%～28.63%。其中枯草芽孢桿菌6a-3效果最好，平均抑菌率28.63%；其次為枯草芽孢桿菌S3和FCK，平均抑菌率分別為24.55%和24.48%，二者差異不顯著(表1)。病菌株A483-1對供試的11種市售生防菌劑和7種前期篩選得到的生防菌均有很強耐受性，部分生防菌株對其還有促生長作用；枯草芽孢桿菌B1對病菌菌株A108抑菌效果最強，抑菌率達50.64%，抑菌帶1.60 cm(圖2)。

注：以抑菌率作熱圖，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低。圖2 生防菌對鏈格孢屬病菌菌絲生長抑菌率

2.3 生防菌對鐮孢屬病菌菌絲生長的拮抗作用 供試的生防菌對鐮孢屬的10個菌株抑菌效果明顯，平均抑菌率為15.35%～50.95%?？莶菅挎邨U菌S3顯著強于其他的生防菌，平均抑菌率50.95%；其次為枯草芽孢桿菌FCK抑菌率為40.37%；蠟質芽孢桿菌S8抑菌效果較差(表1)?？莶菅挎邨U菌S3對9個菌株有很好的抑菌效果，抑菌率為45.69%～60.07%、平均抑菌帶寬為1.10 cm；病菌MMD1菌株對枯草芽孢桿菌S3、枯草·納豆·地衣芽孢桿菌·硝化細菌S9、枯草芽孢桿菌5a-9、6c-5、FCK、B1和Z10較敏感，而病菌MMD29菌株則對多個生防菌株的敏感性較差(圖3)。

注：以抑菌率作熱圖，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低。圖3 生防菌對鐮孢屬病菌菌絲生長抑菌率

3 結論與討論

供試的7株生防菌和11種市售生防菌劑對杧果上分離的27株病菌的抑菌結果表明，枯草芽孢桿菌S3對刺盤孢屬、鏈格孢屬、鐮孢屬病菌都有明顯的抑菌效果，尤其對鐮孢屬病菌的抑菌效果最好，平均抑菌率超過50%，而對鏈格孢屬病菌的抑菌效果則略次。與市售的商品化生防菌劑相比，本次篩選的枯草芽孢桿菌FCK菌株的抑菌效果與生防菌劑S3有較好抑菌效果，具有開發成生防菌劑的潛力，可用于杧果病害的生物防治。

芽孢桿菌Bacillusspp.是廣泛存在于自然界中重要的生物防治微生物資源，芽孢桿菌對植物病原真菌的拮抗作用已被前人證實[8]，是杧果病害綠色防控技術中的重要生防菌。平板對峙培養中2種菌落在培養基上競爭能力的高低，以最終形成的抑菌圈直徑大小為標準，從試驗結果來看，其與病原菌間主要有營養競爭和產生抑菌物質抑制病菌菌絲的生長兩種情況，這與關一鳴 等[12]的研究結果較為相似。芽孢桿菌的生防機制主要有營養物質與空間位點競爭、抗菌物質分泌及溶菌、促進植物生長等[13]。部分供試病菌的菌絲受生防菌的影響明顯膨大、畸形，阻礙了菌絲的正常生長。陳莉[14]認為芽孢桿菌能夠分泌多肽，從而起到抑菌作用；韓玲 等[15]在枯草芽孢桿菌菌液對百合枯萎病的防治的研究過程中認為芽孢桿菌能產生制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，對作物的多種真菌病害有防治作用。生防菌劑芽孢桿菌類枯草芽孢桿菌S3、巨大芽孢桿菌S6、枯草芽孢桿菌FCK和酵母菌菌株JM在本試驗中對多種杧果上病菌的抑菌率較高，與康浩 等[16]、劉曉妹 等[17]研究結果相似，可用于下一步的田間病害防治試驗。

試驗中同一種病害的不同病菌菌株對生防菌的耐受性差別明顯，有些菌株對生防菌劑十分敏感，而有些菌株則對生防菌劑耐性較高，不同生防菌劑的抑菌效果也差異明顯。因此在開展生防菌篩選時應考慮到兩個方面，一方面是在不同病害發生區域內選取多個菌株用于生防菌的篩選與鑒定，另一方面是選取多種無相互拮抗的生防菌，復配成多種生防菌劑的混合液進行篩選，再結合田間試驗獲得高效的、廣譜、易于培養的生防菌劑，應用于病害防治，減少化學農藥的使用量，延緩病菌的抗藥性產生，降低化學農藥對環境的威脅，從而保證杧果的優質高產。