骨橋蛋白與腎結石形成機制的研究進展

夏煜琦+程帆+袁潤

[摘要] 骨橋蛋白（OPN）為泌尿系結石基質主要有機成分之一，在腎結石患者及動物模型腎組織內含量明顯增高。在腎結石形成各階段包括晶體黏附、氧化應激、細胞凋亡等過程中扮演關鍵角色。OPN大量表達將導致晶體沉積，結石形成，最終造成腎臟細胞損傷?？筄PN抗體、抗氧化物及凋亡通路抑制劑能顯著減輕OPN介導的結石形成。本綜述旨在討論近年來骨橋蛋白在腎結石形成機制中的新進展以及針對OPN的新的結石預防治療靶點。

[關鍵詞] 骨橋蛋白；晶體黏附；氧化應激；細胞凋亡；腎結石

[中圖分類號] R692.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0045-04

[Abstract] OPN is one of the main components of the organic phase of stone， which is highly expressed in the renal tissue of the kidney stones patients and animal stone models， and plays an important role in the process of crystal aggregation and adhesion， oxidative stress of renal tubular epithelial cells and apoptosis. A large amount of OPN expression will lead to crystal deposition， stone formation， resulting in kidney cell damage. OPN antibodies， antioxidants and apoptotic pathway inhibitors can significantly reduce OPN mediated stone formation. This review aims to discuss recent advances of the role of osteopontin in the formation of kidney stones and the new stone prevention and treatment target for OPN.

[Key words] Osteopontin； Crystal adhesion； Oxidative stress； Apoptosis； Kidney stone

腎結石是泌尿系統的常見病、多發病，流行病學研究顯示，腎結石的患病率及發病率逐年遞增[1]，在我國，患病率為0.12%～6.02%[2]。同時，由于結石病易復發，并發癥多，已成為很多患者嚴重的負擔。目前腎結石的形成機制仍舊不清楚，傳統觀點認為腎結石的形成過程包括尿液過飽和、晶體核心形成、晶體成長及聚集，然而目前越來越多的研究者強調腎小管上皮細胞與結石晶體間的相互影響[3]。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是草酸鈣結石基質的重要成分[4]，可能通過促進晶體黏附及介導氧化應激、細胞凋亡促進結石的形成[5]。對OPN與腎結石形成機制的研究，有助于為腎結石尋找新的預防及治療靶點。

1 OPN研究現狀

1.1 OPN概述

骨橋蛋白又被稱為分泌性磷蛋白-1（secreted phosphoprotein-1，SSP1），是小整合素結合配體N連接的糖蛋白家族的一員[6]，為分子量34 kDa帶負電荷的磷酸化糖蛋白[4]。OPN的生物學活性取決于三個特異性結構，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD，氨基酸159-161）序列，凝血酶裂解位點（Arg168-Ser169）及鈣離子結合位點（氨基酸86-95）[7-8]。RGD序列通過整合素，參與晶體黏附于上皮細胞、細胞內信號轉導等過程[7]。OPN被凝血酶裂解后，隱藏的整合素連接位點162SVVYGLR168暴露，促進與整合素的連接[8]。鈣離子結合位點具有10個天冬氨酸（Asp）殘基，參與鈣化過程。

1.2 OPN主要功能

OPN廣泛分布于膽囊、尿路、消化道、肺和乳房等組織以及乳汁、膽汁、尿液等體液內。樹突樣細胞，巨噬細胞，大腦及腎臟組織都可以分泌OPN。腎臟內OPN于遠端小管以及集合管內生成[9]。OPN在調節細胞基質重構、組織鈣化、單核-巨噬細胞遷徙趨化、促炎細胞因子的釋放及細胞凋亡方面發揮重要作用，同時也與一系列病理生理過程相關，例如惡性腫瘤、胰島素抵抗、骨質疏松、泌尿系結石等[10]。

2 OPN與腎結石

2.1 OPN與成石物質

結石為無機相及有機相混合形成，其中有機相占干重約5%[11]。由于結石不可能在快速流動的尿液中形成，很多研究者認為，結石是在黏附于腎臟組織的過程中形成并生長的，這些生長相關的有機成分來源于腎臟組織。對結石成分分析發現，OPN作為有機相存在于草酸鈣及磷酸鈣結石內，并且是結石有機成分中含量最為豐富的蛋白之一[4]。腎結石晶體沉積發生于腎乳頭鈣斑（randall plaques，RPs），Taguchi等[12]利用免疫組織化學透射電鏡，在結石患者腎臟內發現，RPs內OPN水平及分布也顯著高于正常腎組織。然而，對正常人及腎結石患者尿液進行光譜質譜分析發現，OPN在正常人及結石患者尿液中含量并沒有明顯差異[13]。

2.2 OPN表達與腎結石

OPN作為腎結石基質的重要成分，在晶體形成中擔任關鍵角色。在乙二醇誘導的草酸鈣結石動物模型腎臟組織中，OPN在mRNA及蛋白水平顯著升高，同時造成腎臟損傷，肌酐清除率下降[14]。Tsuji等[15]，使用siRNA沉默SD大鼠OPN基因發現，OPN下調時，腎臟內草酸鈣晶體沉積明顯減少。大量細胞試驗及動物試驗證明，在結石產生過程中，OPN高表達，并促進結石形成[9，16]。endprint

然而，也有研究者認為，OPN為腎臟鈣質沉著及結石形成的有效抑制劑。Mo等[17]，將OPN基因敲除小鼠與野生型對比發現，敲除小鼠腎乳頭間質磷酸鈣沉積更多。將小鼠尿液，一水草酸鈣晶體及狗腎小管細胞系（MDCK）混合培養發現，在OPN敲除基因小鼠的尿液中培養的細胞系，晶體與上皮細胞黏附明顯增加。

關于OPN作用的爭論，可能是由OPN的結合/游離狀態不同而導致，游離OPN能抑制晶體核心形成、晶體成長和聚集[18]，然而，由于骨橋蛋白的強陰離子活性，它與鈣離子之間有強大的結合力，導致游離的骨橋蛋白在體內很少見[19]。而結合骨橋蛋白為晶體聚集以及黏附的促進劑。因此，可能是某些因素影響了OPN與鈣離子/草酸根離子結合，進而改變游離OPN與結合OPN間的比例，影響結石晶體形成，從而產生了對OPN作用的矛盾結論。

2.3 OPN與晶體黏附

OPN作為細胞外基質的主要成分，參與鈣鹽晶體形成，并介導晶體黏附于腎小管上皮細胞。Kumar等[20]對24位結石病患者與正常人尿液離心、超濾及再處理，發現OPN包繞的晶體黏附能力顯著增強。Hirose等[21]觀察腎小管上皮細胞在結石形成早期的微觀結構，發現腎小管細胞損傷后，以OPN為核心物的晶體在腎臟皮質髓質連接處黏附于上皮細胞。此外，在OPN基因敲除鼠腎組織中，結石晶體碎片化，晶體數減少及晶體大小減小[22]。OPN介導的黏附作用與其結構上整合素結合位點162SVVYGLR168相關[8]。這些研究表明，OPN在結石形成過程中，一方面作為結石基質的一部分，與結石的形成有關；另一方面，包繞成石晶體，促進晶體與腎小管細胞間的黏附作用，并且與腎小管細胞受損后的晶體黏附密切相關。

2.4 OPN與氧化應激

實驗及臨床研究證實結石患者腎臟內，氧化應激（oxidative stress，OS）的發生[23]?？寡趸芰p弱將導致晶體增加，結石形成[24]。在結石發生早期階段，腎小管上皮細胞損傷，線粒體內部結構破壞，空泡形成，胞膜微絨毛減少，縮短[21]。細胞損傷促發氧化應激，谷胱甘肽濃度下降，花生四烯酸增加[25]，同時OPN表達升高，促進前列腺素E2（PGE2）、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）等與炎癥相關因子的合成增加[26]。氧化應激與炎癥因子的產生將造成腎小管上皮細胞進一步損傷與結石形成。用抗氧化劑，如NADPH氧化酶抑制劑干擾后，腎小管細胞中反應活性氧，OPN的水平下調，并且減輕了結石晶體誘發的氧化損傷[24，26]。

2.5 OPN與細胞凋亡

Niimi等[27]，在乙二醇誘導的SD大鼠草酸鈣結石模型中觀測到：線粒體親環素D激活，線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）損傷開放，線粒體塌陷，氧化應激及凋亡通路啟動，OPN大量表達，促進晶體黏附于腎小管細胞。mPTP阻滯劑環孢素A（cyclosporine A，CsA），親環素D抑制劑N-甲基-4-異亮氨酸環孢素（N-methyl-4-isoleucine cyclosporin，NIM811）能阻止mPTP開放，減輕凋亡水平，顯著抑制OPN表達，減少晶體沉積[27-28]。Bhardwaj等[29]，發現OPN表達水平與內質網應激水平的相關性?？赡芡ㄟ^CD44受體[30]，激活內質網應激，增加-內質網向線粒體轉運的鈣離子流，促進線粒體坍塌，激活凋亡通路[29]。這些研究表明，在結石形成早期階段，一方面，OPN能誘發內質網應激，mPTP，線粒體坍塌激活凋亡通路；另一方面，在凋亡通路啟動后，大量表達，增強晶體黏附能力。

3 靶向OPN的治療策略

包括維生素E、綠茶、活血丹、褪黑素及檸檬酸鉀等在內的抗氧化物，能通過抑制OS，減少OPN表達以及腎臟組織內結石晶體的形成[22，24]。腎結石動物模型中，腎臟組織內氧化應激標志物，腎損傷分子-1（KIM-1）及OPN水平顯著升高，草酸鈣晶體沉積。而食用抗氧化劑活血丹，檸檬酸鉀后各指標顯著下調[22]。這些抗氧化劑，可用于結石高危人群，例如尿路梗阻感染、高草酸尿癥、代謝綜合征患者預防結石形成，或體外沖擊波碎石術后預防結石復發。

通過抑制凋亡通路的關鍵因子，能減輕凋亡，減少OPN表達及結石形成。mPTP阻滯劑CsA，親環素D抑制劑NIM811能抑制mPTP開放，抑制細胞損傷及凋亡通路激活，OPN表達及早期草酸鈣晶體形成[27-28]。對凋亡通路各個重要環節的抑制，可能成為未來對抗結石的新靶點。

抗OPN抗體能影響凝血酶對OPN的裂解，通過抑制黏附抑制結石的早期形成。Hamamoto等[8]在乙醛酸誘導的小鼠模型中，腹腔注射鼠抗OPN抗體（anti-murine osteopontin antibody，35B6-Ab）顯著減輕腎臟晶體黏附，晶體形成及細胞損傷。

游離OPN能抑制晶體核心形成、晶體成長和聚集，而結合OPN則正好相反[18-19]，游離OPN與結合OPN的轉換過程目前仍然不清楚，若能抑制OPN與鈣離子的結合，減少結合OPN，增加游離OPN，或許能夠發揮游離OPN的功能，抑制結石的形成。

4 討論

綜上所述，OPN從三方面促進腎結石形成：①尿路中草酸鹽的濃度過高，結石早期形成。OPN作為結石核心的一部分，促進晶體間聚集及黏附，并促進晶體黏附于腎小管管腔。②晶體黏附于腎小管上皮細胞后，被內吞進入胞內溶酶體或者釋放到腎臟間質被降解[11]。黏附于腎小管細胞上的結石晶體，能促進OPN大量表達及NADPH氧化酶反應生成大量過氧化物。③OPN促進內質網應激，激活親環素D，線粒體通透性轉換孔（mPTP）損傷開啟，線粒體死亡，凋亡通路啟動，OPN大量表達，促進晶體黏附于腎小管細胞。同時，巨噬細胞對小晶體吞噬并且消化，生長過快的晶體巨噬細胞無法消化，晶體進一步聚集并且排入管腔。endprint

OPN作為結石組成成分，在結石形成腎組織內高表達，在晶體聚集與黏附，腎小管上皮細胞損傷氧化應激、凋亡等過程發揮重要作用?？筄PN抗體、抗氧化劑、凋亡抑制劑等能通過抑制OPN產生，減少腎組織內晶體形成及沉積，減輕腎臟損傷，能為臨床預防及治療腎結石提供新的有效方法。

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（收稿日期：2017-09-19 本文編輯：任 念）endprint